錳素對甘蔗脯氨酸合成積累的影響

楊 善，謝 平，李廣翔，葉昌輝，周鴻凱

(廣東海洋大學 農學院，廣東 湛江 524088)

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錳素對甘蔗脯氨酸合成積累的影響

楊 善，謝 平，李廣翔，葉昌輝，周鴻凱*

(廣東海洋大學 農學院，廣東 湛江 524088)

以粵糖55為材料，設6個錳處理水平，分別在正常水分和干旱條件下，通過桶栽試驗，測定葉片的葉綠素、脯氨酸含量與Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和δ-鳥氨酸轉氨酶(δ-OAT)活性及其基因表達。結果表明，隨著施錳量的增加，2種水分條件下，所有測定指標均呈先增加后減小的趨勢。干旱脅迫下，脯氨酸含量在錳濃度為0.8 g·kg-1時達到最大；δ-OAT，P5CS活性與葉綠素含量在錳濃度為0.4 g·kg-1時達到峰值；δ-OAT，P5CS基因表達量則是在0.2 g·kg-1供錳條件下最大。正常水分下，葉綠素含量、脯氨酸含量、δ-OAT活性變化與干旱脅迫時相似；P5CS活性在0.8 g·kg-1時達到最大，但增幅不大。統計分析結果表明，正常水分和干旱脅迫條件下，與脯氨酸含量的簡單、偏相關系數和直接通徑系數均達到極顯著水平的分別是P5CS活性和δ-OAT活性。由此認為，在磚紅壤土中，為保證甘蔗具有較強抗逆性，甘蔗的施錳量應為0.2～0.4 g·kg-1。在錳的影響下，干旱脅迫時，甘蔗脯氨酸的合成途徑以鳥氨酸途徑為主；正常水分時，脯氨酸的合成則是谷氨酸途徑更占優勢。

甘蔗；錳；脯氨酸；P5CS；δ-OAT；基因表達

當植物受到重金屬、干旱、高鹽等逆境脅迫時，為了適應逆境，植物體會在短時間內積累大量的脯氨酸、甜菜堿等一系列滲透調節物質[9]。楊建波等[10]研究表明，在干旱脅迫處理下，不同品種甘蔗的生長勢、葉片水勢及葉綠素含量均有不同程度降低，葉片脯氨酸和丙二醛含量升高，葉片細胞質膜透性增大。在植物體內，脯氨酸的生物合成途徑一般分為谷氨酸途徑(Glu→Pro)和鳥氨酸途徑(Orn→Pro)，△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和δ-鳥氨酸轉氨酶(δ-OAT)分別是前述2個合成途徑的關鍵酶[11-12]。余光輝等[13]研究表明，假儉草在干旱脅迫下主要通過Orn→Pro途徑積累脯氨酸。王華[14]研究表明，在鹽脅迫下，鳥氨酸途徑主導著海濱錦葵根中脯氨酸的合成，而葉片中脯氨酸的合成以谷氨酸途徑為主。

前人對干旱脅迫下甘蔗脯氨酸的合成積累效應研究很多[15-16]，但針對不同水分條件下，不同錳濃度對甘蔗脯氨酸合成積累效應的研究尚未見報道。本研究以粵糖55為材料，設6個錳濃度水平，分別測定了在正常水分和干旱脅迫下，植株體內游離脯氨酸含量與P5CS，δ-OAT活性及其基因表達，以探索不同外源錳濃度水平對甘蔗葉片游離脯氨酸合成積累效應的影響，以期為甘蔗栽培技術創新提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用甘蔗品種為粵糖55，是粵西蔗區主栽品種之一。供試土壤為磚紅壤土，部分理化性質如下：pH值5.08，堿解氮152.12 mg·kg-1，速效鉀158.56 mg·kg-1，有效磷53.27 mg·kg-1，有機質27.80 g·kg-1，活性錳128 mg·kg-1。

1.2 試驗方法

采用桶栽試驗(膠桶高0.5 m，口徑0.4 m，在桶底開4個對稱的排水小孔)，每桶裝磚紅壤土20 kg，種植2段雙芽苗。試驗設置6個錳素處理水平，分別為0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6 g·kg-1。隨機區組設計，3次重復，共計18桶。試驗處理設2個生長條件：土壤含水量>20%，作為正常條件；土壤含水量<14%，作為干旱脅迫。

于2013年6月18日種植，田間管理按大田管理水平操作。齊苗后定苗，每桶選留對稱且健壯的2株甘蔗幼苗，用自來水澆灌，保持土壤濕潤。2013年10月2日，以MnSO4·5H2O作為錳素施入土壤中，按錳含量(以Mn2+計)要求，每桶均勻施入相應含量的MnSO4溶液1 L。于2013年10月30日、11月18日、11月27日分別取甘蔗+1葉測定葉片中活性錳含量。于2013年11月20日，實測土壤水分為(20.58±2.42)%， 每桶取1株甘蔗進行測試分析，取其+1葉測定脯氨酸含量、δ-OAT活性、P5CS活性，取其心葉作為總RNA提取材料。隨后，將試驗桶栽甘蔗移入通風透氣良好的玻璃室內，停水管理，進行6 d干旱脅迫處理，于2013年11月27日，實測土壤含水量為(12.65±1.34)%，取樣，同上分析測試各項目。

1.3 測定項目及方法

葉綠素含量測定采用乙醇-丙酮混合液浸泡法；脯氨酸含量測定用茚三酮顯色法[17]；P5CS提取參照Hayzer等[18]的方法，活性測定參照韓曉玲[19]的方法，一個酶活性單位(1 U)定義為每分鐘生成1 μmol γ-谷氨酰胺所需要的酶量；δ-OAT的抽提、活性測定參照余光輝等[13]的方法，一個酶活性單位(1 U)定義為每小時生成1 mmol P5C所需要的酶量；葉片中錳含量采用原子吸收分光光度法測定[20]。

總RNA用TRNzol-A+總RNA提取試劑盒提取，利用TIANScript cDNA 第一鏈合成試劑盒反轉錄，上述試劑盒均購自天根生化科技公司；用寶生物工程公司的SYBR?Premix ExTaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒，在Roche LightCycler?2.0平臺上進行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，基因表達分析采用2-△△Ct法[21]，以正常水分時的基因表達為1。

利用軟件Primer Premier 5.0按照GenBank中甘蔗P5CS基因(EU005373.2)、δ-OAT基因的cDNA序列(EF517495.1)設計引物，具體如下：P5CS的引物分別為5′-GTGGGTGTTGAAGGTCTC-3′，5′-AGGAAGGTTCTTATGGGT-3′；δ-OAT的引物分別為5′-GAGTTTAGGGACCAGTTACAGAA-3′， 5′-AAGCAGGAGATAGAGCGTCAT-3′。其中，內參基因引物則引用闕友雄等[22]篩選的25SrRNA引物組合： 5′-GCAGCCAAGCGTTCATAGC-3′，5′-CCTATTGGTGGGTGAACAATCC-3′。

1.4 統計分析

本研究所有數據的統計分析在SPSS 19.0上進行；對于有顯著差異的各指標，用LSD法對不同處理水平進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 甘蔗葉片錳含量

由圖1可知，隨著施加錳濃度的增加，葉片錳含量也隨之增加。在相同測定時間下，除正常水分時的0與0.2 g·kg-1間的葉片錳含量沒有顯著性差異外，其他錳濃度處理的葉片錳含量均有顯著差異。同時，對比正常水分(11月18日)和干旱脅迫(11月27日)條件下各施錳處理的葉片錳含量，其值基本趨于穩定，說明甘蔗對于外源錳的吸收已經達到一個平衡狀態。

2.2 甘蔗葉片葉綠素含量

由圖2可知，2種水分條件下，甘蔗葉片葉綠素含量都隨著施錳素的增加而呈現先增后減的趨勢，無論是在正常水分還是干旱脅迫下，均在施錳濃度為0.4 g·kg-1時達到最大，且顯著高于其他供錳水平；在施錳濃度為1.6 g·kg-1時最小，且顯著低于其他供錳水平。說明適量的錳素有利于甘蔗葉片葉綠素的合成，而過量的錳素則會阻礙葉綠素的正常合成。對比2種水分條件，干旱脅迫下葉綠素含量總體較正常水分下降了24.81%，表明干旱脅迫會使甘蔗葉片葉綠素含量下降。

圖中各處理間無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)圖1 不同錳濃度對甘蔗葉片錳含量的影響Fig.1 Effects of different Mn application rates on Mn content in sugarcane leaves

在正常或干旱脅迫條件下，不同錳濃度間無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同圖2 不同錳濃度對甘蔗葉片葉綠素含量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of manganese on chlorophyll content in sugarcane leaves

2.3 甘蔗葉片游離脯氨酸含量

圖3顯示，在2種水分條件下，甘蔗體內游離脯氨酸含量均隨著錳施用量的增加而呈現先增后減的趨勢。干旱脅迫下，當錳施用濃度小于0.8 g·kg-1時，植株內游離脯氨酸的含量隨著施錳濃度的增加而顯著增加；大于0.8 g·kg-1時下降。即適當量的錳素會促進甘蔗植株內游離脯氨酸的合成積累；但是，當錳施用濃度大于0.8 g·kg-1時，表現出抑制作用。正常水分下，自施錳濃度為0.4 g·kg-1起，脯氨酸含量開始顯著增加，至0.8 g·kg-1時達到峰值，之后隨錳施用濃度的增加而顯著下降，說明在正常水分條件下，當施錳濃度增加到0.4 g·kg-1時，甘蔗植株開始受到錳脅迫的影響。

2.4 甘蔗葉片δ-OAT活性

由圖4可知，在干旱條件下，隨錳施用量的增加，δ-OAT活性變化表現為拋物線狀，在錳濃度為0.4 g·kg-1時達到峰值，比對照(0 g·kg-1)增加了44.62%。超過0.8 g·kg-1時，δ-OAT活性顯著下降。正常水分條件下，δ-OAT活性亦表現為先增后減的趨勢，但波動較干旱條件下小。

圖3 不同錳水平對甘蔗葉片脯氨酸含量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of manganese on proline content in sugarcane leaves

圖4 不同錳水平對甘蔗葉片δ-OAT活性的影響Fig.4 Effects of different concentrations of manganese on δ-OAT activity in sugarcane leaves

總體來看，適量的錳可激活δ-OAT活性，合成更多的脯氨酸來調節甘蔗植株的生長；而過多的錳則會抑制δ-OAT活性。

2.5 甘蔗葉片P5CS活性

由圖5可知，在2種水分條件下，P5CS活性的變化趨勢與δ-OAT相似。正常水分下，P5CS活性在0.8 g·kg-1時達到最大值，之后緩慢減小。而干旱脅迫下，隨著施錳量增加，P5CS活性被激活，在0.4 g·kg-1時最大，隨后減小。即適量的錳能夠激活P5CS活性，而錳施用量過大則有一定的抑制作用。干旱脅迫與正常水分狀況比較，干旱脅迫時P5CS的平均活性比水分正常條件下增加了68.74%。因此，推測土壤水分是激活P5CS活性的主要因素，而錳的施用量對P5CS活性也有一定的影響。

2.6 δ-OAT，P5CS基因表達

由圖6可知，除施錳濃度為1.6 g·kg-1外，干旱脅迫下δ-OAT，P5CS相對于正常水分條件下的基因表達量呈增大的趨勢。由此說明，干旱脅迫下能誘導δ-OAT，P5CS基因表達量的上調，這與δ-OAT，P5CS活性的變化趨勢是相似的。在不同外源錳濃度下，δ-OAT，P5CS的基因表達量表現出顯著差異，當施錳濃度為0.2 g·kg-1時，δ-OAT，P5CS基因表達量最大，分別為正常水分條件下的3.0，2.95倍；當錳濃度大于0.4 g·kg-1時，δ-OAT，P5CS基因表達量的上調幅度均小于對照(0 g·kg-1)，特別是當錳濃度為1.6 g·kg-1時，相較于正常水分條件，δ-OAT基因表達下調。總體來看，適當的錳有利于誘導δ-OAT，P5CS基因在干旱脅迫條件下的表達，而施錳濃度過大則會抑制δ-OAT，P5CS基因在干旱條件下的表達上調幅度。

圖5 不同錳水平對甘蔗葉片P5CS活性的影響Fig.5 Effects of different concentrations of manganese on P5CS activity in sugarcane leaves

圖6 不同錳水平對甘蔗δ-OAT，P5CS基因表達的影響Fig.6 Effects of different concentrations of manganese onδ-OAT and P5CS gene expression in sugarcane leaves

2.7 相關性及通徑分析

從表1可知，正常水分條件下，只有P5CS活性與脯氨酸含量間的簡單相關系數、偏相關系數均達到極顯著性水平，且為正相關；δ-OAT活性與葉綠素含量的簡單相關系數達到顯著性水平，偏相關系數達到極顯著性水平，均為正相關；P5CS活性與葉綠素含量之間的偏相關系數達到顯著性水平，為負相關。因此，正常水分時，在錳素的影響下，δ-OAT活性與葉綠素含量、P5CS與脯氨酸含量間的關系極為密切，而P5CS活性與葉綠素含量間也有緊密聯系。干旱脅迫下，在各個生理指標間的簡單相關系數中，唯有葉綠素與脯氨酸含量間的系數未到達顯著性水平；而在偏相關分析中，只有δ-OAT活性與脯氨酸含量間的偏相關系數達到了顯著性水平，且為正相關。由此表明，干旱脅迫下，δ-OAT與脯氨酸含量間的關系最為密切。

由表2可知，正常水分下，只有P5CS活性對脯氨酸含量的通徑系數達到極顯著水平，為0.737 8。而δ-OAT活性、葉綠素含量對脯氨酸含量的直接通徑系數分別為0.100 8，0.188 3，所以，P5CS活性對脯氨酸含量的調節作用最大。干旱脅迫下，只有δ-OAT活性對脯氨酸含量的直接通徑系數達到了極顯著水平；而P5CS活性對脯氨酸含量的直接通徑系數較小，為0.376 4；葉綠素含量對脯氨酸含量的直接通徑系數為-0.204 8，為負向的調節作用；同時，P5CS活性、葉綠素含量通過δ-OAT活性的間接通徑系數都比較大，說明此時對脯氨酸的合成積累以δ-OAT活性調節為主。

表1 各生理指標間的簡單、偏相關性分析

Table 1 The simple and partial correlation analysis of physiological indexes

參數δ-OAT活性X1正常水分干旱脅迫P5CS活性X2正常水分干旱脅迫葉綠素含量X3正常水分干旱脅迫脯氨酸含量Y正常水分干旱脅迫δ-OAT活性X1110.30240.13360.7012**0.43300.10170.5948*P5CS活性X20.22120.7142**11-0.5029*0.39490.6857**0.4001葉綠素含量X30.6397*0.6566**-0.25180.6448**110.1861-0.2480脯氨酸含量Y0.38450.7810**0.7127**0.7062**0.06700.462511

注：左下表示簡單相關系數，右上表示偏相關系數。*表示達顯著水平(P<0.05)，**表示達極顯著水平(P<0.01)。下同。

表2 通徑分析結果

Table 2 Results of path analysis

參數直接通徑系數正常水分干旱脅迫通過X1通徑系數正常水分干旱脅迫通過X2通徑系數正常水分干旱脅迫通過X3通徑系數正常水分干旱脅迫剩余通徑系數正常水分干旱脅迫X10.10080.6467**0.16320.21640.1204-0.13450.42280.3238X20.7378**0.37640.02230.4618-0.0474-0.1321X30.1883-0.20480.06450.4246-0.18580.2427

注：X1為δ-OAT活性；X2為P5CS活性；X3為葉綠素含量。

3 討論

3.1 錳素對甘蔗葉片葉綠素含量的影響

錳直接參與光合作用，維持葉綠體的結構；同時，錳與蛋白質結合形成的酶蛋白是光合作用中不可缺少的參與者[23]。本研究中，葉綠素含量在2種水分條件下均呈現先增后減的趨勢，并且均是在錳濃度為0.4 g·kg-1時達到最高；隨著錳素的增加，葉綠素含量開始減少，表明適量的錳素(即小于0.4 g·kg-1)有利于甘蔗葉片葉綠素的合成，而過量的錳素(大于0.4 g·kg-1)會阻礙葉綠素的正常合成。這一結果和孫玉珍等[4]以3種花卉為材料，進行錳脅迫的盆栽試驗結果相似。鐵是合成植物葉綠素的必須元素之一。錳素過量時，葉綠素含量減少，使得甘蔗葉片失綠、黃化，這可能與錳脅迫下甘蔗對鐵的吸收、運輸、鈍化有關[24]。

3.2 錳素對甘蔗葉片游離脯氨酸的積累效應

本研究發現，在干旱脅迫下，施用適量的錳時，能夠提高δ-OAT，P5CS基因的表達量，在錳濃度為0.2 g·kg-1時上述基因表達較正常水分條件下的上調幅度最大。同時，甘蔗葉片的δ-OAT，P5CS活性不斷增大，游離脯氨酸含量也顯著積累，以提高抗逆能力，維持體內正常的滲透壓，抵抗干旱脅迫對植株帶來的傷害。這與彭令發等[25]以玉米為材料的研究結果類似，即適量的錳素能夠提高玉米對干旱脅迫的抗逆性。當錳施量大于0.8 g·kg-1時，δ-OAT，P5CS活性受到抑制作用，游離脯氨酸的含量也隨之下降。這可能是由于過多錳的吸收抑制了植物對鐵、鎂、鈣的吸收[8]，使得甘蔗體內的元素平衡遭到破壞，從而抑制了各種代謝活動，使得脯氨酸合成受阻。

在正常水分條件下，隨著錳施用量的增加，游離脯氨酸含量變化與干旱脅迫時的趨勢類似，當錳施量在0～0.2 g·kg-1時，甘蔗尚未受到錳的脅迫，而大于0.4 g·kg-1時，脯氨酸含量劇增，大量游離脯氨酸積累，表明植物可能已經受到錳脅迫。δ-OAT活性在錳施用量為0.4 g·kg-1時才被顯著激活；而P5CS活性則在錳施用量為0.2 g·kg-1時即被顯著地激活。這可能是由于鎂素能活化谷氨酰胺合成酶，參與谷氨酸、谷氨酰胺的合成[26]，因此，P5CS活性對錳脅迫更為敏感。

綜上，甘蔗在干旱脅迫下，錳的施用量應以0.4 g·kg-1最佳，此時甘蔗抗旱性最強，葉綠素含量最高，P5CS，δ-OAT基因表達量比較大，脯氨酸含量也比較高；而在正常水分下，錳肥的施用量應控制在0.2 g·kg-1，此時甘蔗未受到錳脅迫，利于甘蔗植株的正常生長。因此，在磚紅壤土中，錳的施用量宜控制在0.2～0.4 g·kg-1。

3.3 錳素對甘蔗葉片游離脯氨酸合成途徑的影響

在干旱、重金屬、高鹽等脅迫下，脯氨酸的合成調節究竟是谷氨酸途徑還是鳥氨酸途徑占主導地位，至今尚未有統一的結論，但都認為與植物種類、生長狀態有關[27]。趙福庚等[28]認為，鹽脅迫下明顯激活大麥幼苗體內脯氨酸合成的鳥氨酸途徑；而Roosens等[29]以4周齡的擬南芥為材料研究表明，鹽脅迫下主要是谷氨酸途徑引起植株體內游離脯氨酸的增加。本研究發現，在干旱脅迫下，隨著錳施入量的增加，δ-OAT活性被顯著激活，呈先增大后減小的趨勢，與脯氨酸含量的變化有一致性，而P5CS活性增幅較小。同時，通過分析發現，只有δ-OAT活性與脯氨酸含量的簡單、偏相關系數均達到了極顯著性水平；而P5CS活性并未達到顯著水平。由此推測，在錳素的影響下，干旱脅迫條件下，甘蔗體內游離脯氨酸的合成以鳥氨酸途徑為主，這與黃誠梅等[30]以PEG脅迫模擬干旱脅迫，認為甘蔗葉片中脯氨酸的合成以谷氨酸途徑主導的結論不同。本研究還發現，在正常水分下，脯氨酸合成積累量比干旱脅迫時小。隨著錳施入量的增加，δ-OAT，P5CS活性先增大后減小，而δ-OAT活性的增幅很小。進一步的分析表明，唯P5CS活性與脯氨酸含量的簡單、偏相關系數均達到了極顯著性水平，且通徑分析中P5CS活性對脯氨酸含量的直接通徑系數明顯大于δ-OAT。由此推測，在錳影響下，正常水分條件下甘蔗體內游離脯氨酸的合成途徑中Glu→Pro比Orn→Pro更占優勢，所以P5CS對錳素較為敏感。但此條件下的剩余通徑較大，說明脯氨酸的合成還有其他隨機因子的影響，需進一步探索。

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(責任編輯 高 峻)

Effects of manganese on proline biosynthesis and accumulation in sugarcane

YANG Shan， XIE Ping， LI Guang-xiang， YE Chang-hui， ZHOU Hong-kai*

(CollegeofAgriculture，GuangdongOceanUniversity，Zhanjiang524088，China)

In the present study， the sugarcane variety YT-55 was selected as study material. Under drought and normal conditions， the activity of P5CS， δ-OAT and their gene expression， and contents of free proline and chlorophyll were tested under 6 Mn concentrations， respectively. It was shown that all indexes tested exhibited a first increasing and then decreasing trend with the elevated Mn application rates under two water conditions. Under drought stress， the proline content reached the maximum when manganese concentration was 0.8 g·kg-1， the activity of δ-OAT and P5CS activity and chlorophyll content reached the peak under 0.4 g·kg-1Mn， and the gene expression level ofδ-OATandP5CSreached the maximum when manganese concentration was 0.2 g·kg-1. Under normal conditions， changes of chlorophyll and proline contents and δ-OAT activity were similar to those under drought stress. The activity of P5CS reached maximum when manganese concentration was 0.8 g·kg-1. The simple， partial correlation and direct path coefficients of δ-OAT activity and proline content reached significant level under drought stress， while the simple， partial correlation and direct path coefficients of P5CS activity and proline content reached significant level under normal condition. This study suggested that manganese application amount should be 0.2-0.4 g·kg-1for sugarcane production in latosol soil， and the stress resistance of sugarcane was strong under this condition. Due to the influences of manganese， the ornithine pathway dominated the proline biosynthesis of sugarcane under drought stress， while the glutamic pathway was dominant under normal water condition.

sugarcane; manganese; proline;P5CS;δ-OAT; gene expression

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.06.03

2015-10-21

廣東省科技計劃項目(2013B020301005，2013B020301008)；廣東省良種培育和引進專項(201201148)；廣東海洋大學“強校工程”科研項目(GDOU2015050201)

楊善(1987—)，男，廣西賀州人，碩士研究生，從事熱帶作物栽培生理研究。E-mail：116168836@qq.com

*通信作者，周鴻凱，E-mail：897961801@qq.com

S566.1

A

1004-1524(2016)06-0915-07

楊善，謝平，李廣翔，等. 錳素對甘蔗脯氨酸合成積累的影響[J]. 浙江農業學報，2016，28(6)： 915-921.