復(fù)方萬(wàn)年青膠囊神經(jīng)保護(hù)作用成分的水提取工藝研究

高 陸 王美慧 魏曉雨 曲佳樂(lè) 姜文月

吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130000

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復(fù)方萬(wàn)年青膠囊神經(jīng)保護(hù)作用成分的水提取工藝研究

高 陸 王美慧 魏曉雨 曲佳樂(lè) 姜文月*

吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130000

目的：確定具有神經(jīng)保護(hù)作用新藥的最佳水提取工藝參數(shù)。方法：采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選最佳工藝，以總皂苷和出膏率為綜合評(píng)分指標(biāo)，優(yōu)選最佳水提取工藝，并對(duì)優(yōu)選工藝進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：最佳水提取工藝是10倍水，提取3次，每次提取1h。結(jié)論：優(yōu)選后的水提取工藝穩(wěn)定可靠，可為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用該新藥提供參考。

神經(jīng)保護(hù)作用新藥；正交試驗(yàn)；綜合評(píng)分

老年癡呆泛指發(fā)生在65歲以后的各類癡呆，包括阿爾茨海默病、血管性癡呆和混合型癡呆等類型[1]。隨著人口老齡化的加速，老年癡呆的患病率高、疾病負(fù)擔(dān)嚴(yán)重，已成為一個(gè)全球性的公關(guān)衛(wèi)生問(wèn)題，其社會(huì)成本計(jì)劃相當(dāng)于癌癥、心臟病和中風(fēng)成本的總合[2-3]。老年癡呆給患者及家庭帶來(lái)巨大的醫(yī)療、心理和情感壓力，因此從天然藥物中探索開(kāi)發(fā)具有神經(jīng)保護(hù)作用的新藥勢(shì)在必行。

復(fù)方萬(wàn)年青膠囊是由萬(wàn)年青、人參、黃芪等10味中藥組成的純中藥抗癌藥物，具有解毒化瘀、扶正固本的功效。用于肺癌、肝癌、胃癌化療合并用藥，具有減毒增效的作用?；贒rug-similar 概念的復(fù)方抗癌藥新用途開(kāi)發(fā)，通過(guò)連接網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，將疾病、基因與藥物利用基因表現(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行串連，將藥物處理細(xì)胞后的基因表現(xiàn)圖譜與連接網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)的基因表現(xiàn)圖譜進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)復(fù)方萬(wàn)年青膠囊具有神經(jīng)保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，水提取工藝以總皂苷和出膏率為評(píng)分指標(biāo)，考察料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)工藝的影響，優(yōu)化神經(jīng)保護(hù)作用有效成分最佳提取工藝，為研究具有神經(jīng)保護(hù)作用的新藥工藝開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Ultra-6100型紫外可見(jiàn)分光光度儀(北京普源精電科技有限公司)；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；SB-1200D超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；AB135-S電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 材料 人參皂苷Re(批號(hào)：110754-201324，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，半枝蓮、黃芪、人參均由吉林天力泰藥業(yè)有限公司提供，娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 水提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 復(fù)方中半枝蓮、黃芪、人參的主要活性成分大多為水溶性物質(zhì)，因此采用傳統(tǒng)水煎煮法進(jìn)行提取，采用L9(34)正交試驗(yàn)(表1)。

綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)計(jì)算方法：(出膏率×0.3/最大值+總皂苷×0.7/最大值)×10。

表1 水提取工藝正交試驗(yàn)因素水平

2.2 出膏率考察 按處方量稱取半枝蓮、黃芪、人參藥材，混合后加水浸泡1h，按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表分別進(jìn)行提取。將所得提取液濃縮、干燥，稱定干膏重量，計(jì)算水提取的干膏得率。

2.3 總皂苷含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品11.98mg于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1.198mg/mL。

2.3.2 供試品溶液制備 精密稱取所得各干浸膏粉末0.5g分別置于50mL錐形瓶中，精密加入甲醇30mL，超聲處理20min，放置室溫，過(guò)濾，減壓蒸干甲醇，用15mL蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。 加乙醚萃取3次(20mL/10mL/5mL)，棄去乙醚層。水層加入水飽和正丁醇萃取4次(30mL/20mL/15mL/10mL)，合并正丁醇萃取液，用0.1mol/L的NaOH溶液洗正丁醇層2次，每次10mL，棄去NaOH層，減壓回收正丁醇至干，用甲醇分次洗滌、轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度線，即得供試品溶液。2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、40、80、120、160、200μL于比色管中，揮干溶劑，加入5%的香草醛醋酸溶液 0.2mL和高氯酸0.8mL，在 60℃條件下水浴加熱 15min后，取出，并冷水浴至室溫，精密加入5mL冰醋酸[4]，在544nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程：Y=4.9562X-0.0321(R=0.9999)，結(jié)果顯示人參皂苷Re在48～240μg范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.3.4 測(cè)定方法 精密量取供試品溶液0.2mL置具塞比色管中，水浴揮干溶劑，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，并測(cè)定吸光度，計(jì)算，即得。

3 結(jié)果

3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 由表2顯示的試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果可直觀分析，極差RC>RA>RB，表明影響該組合物的提取因素主次順序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)(C)>料液比(A) >提取時(shí)間(B)，各因素不同水平的影響次序?yàn)椋篈3>A2>A1B3>B2>B1C3>C2>C1，因此從上訴實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析其最佳提取工藝為A3B3C3，即加10倍量水，煎煮提取3次，每次2h。

表3所得綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)方差分析結(jié)果顯示，因素C的P<0.05，表明提取次數(shù)對(duì)提取效率具有顯著性影響，料液比和提取時(shí)間的影響不顯著，為降低成本、節(jié)能減排，故將提取時(shí)間確定為1h。因此，綜合以上分析結(jié)果，最終確定的最佳工藝為A3B2C3，即10倍量水，煎煮提取3次，每次1h。

表2 水提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 水提取工藝方差分析

3.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 按復(fù)方量稱取藥材5份，按正交試驗(yàn)所選擇的工藝路線，即A3B2C3，即加水10倍量，提取3次，每次1h進(jìn)行提取，計(jì)算干膏平均得率為19.54%(n=5，RSD=1.36%)，總皂苷含量為11.68mg/g(n=5，RSD=1.02%)。

4 討論

復(fù)方萬(wàn)年青膠囊為多味藥組成的復(fù)方，經(jīng)細(xì)胞親和-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)篩選的結(jié)果表明，該組方中抗老年癡呆活性組分主要包括蒽醌類、黃酮類和皂苷類，細(xì)胞親和-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)篩選的結(jié)果將另行發(fā)表。黃芪中黃芪甲苷在神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用中顯示出重要的作用，黃芪甲苷可以增加周圍神經(jīng)的再生率，增強(qiáng)神經(jīng)元軸突再生和重建[5]，且目前已經(jīng)證實(shí)黃芪甲苷可以提高神經(jīng)元的存活能力[6]；人參皂苷是人參的主要藥理活性成分，它對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)都有作用[7]。半枝蓮的主要成分為黃酮類等，水溶性較好，因此與黃芪、人參一并水提取，水提取路線中以總皂苷和出膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

人參總皂苷是一類含有糖苷鍵的四環(huán)或五環(huán)三萜類化合物，測(cè)定目標(biāo)是四環(huán)三萜或五環(huán)三萜，即皂苷元[8-9]。比色法測(cè)定人參總皂苷的定量原理：皂苷元中的C3和C12上的羥基與香草醛上的醛基發(fā)生反應(yīng)，形成縮醛，成為新的共軛體系而顯色，因此，人參總皂苷的定量測(cè)試應(yīng)符合以下要求：a人參皂苷應(yīng)完全水解成皂苷元；b人參皂苷元結(jié)構(gòu)不被破壞；c皂苷元在一定的濃度范圍與香草醛顯色反應(yīng)呈線性，且所水解下來(lái)的糖對(duì)測(cè)試影響較小。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，筆者嘗試加入3%、5%、7%和10%的香草醛醋酸溶液，隨著香草醛用量的增加，人參總皂苷的吸收有所增加，空白顏色也加深，但是整體凈吸收呈穩(wěn)定趨勢(shì)，說(shuō)明反應(yīng)已達(dá)到飽和，本實(shí)驗(yàn)選擇5%的香草醛醋酸溶液；實(shí)驗(yàn)中考察了加入高氯酸的用量，分別加入0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL高氯酸，其中加入0.4mL和0.6mL高氯酸時(shí)，吸光度較低，說(shuō)明水解不完全，本實(shí)驗(yàn)選擇加入0.8mL的高氯酸。

依據(jù)方差分析結(jié)果得知，因素A和因素B的P>0.05，表明料液比和提取時(shí)間影響不顯著，黃芪、人參和半枝蓮三味藥材中半枝蓮體積大、較吸水，為將藥材充分浸泡，將料液比確定為10倍；另外為降低成本、節(jié)能減排，將提取時(shí)間確定為1h。因素C的P<0.05，表明提取次數(shù)對(duì)提取效率具有顯著性影響，因此煎煮提取3次。綜合以上分析結(jié)果，最終確定的最佳工藝為10倍量水，煎煮提取3次，每次1h；水提取的干膏平均得率為19.54%，總皂苷含量為11.68mg/g。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的提取條件進(jìn)行中試生產(chǎn)，結(jié)果表明本工藝條件適于產(chǎn)品的工業(yè)化，在此條件下，工藝條件溫度，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、均一，表明此工藝條件具有可行性和適用性。

[1] 李錚. 老年癡呆相關(guān)概念辨析 [J]. 中華護(hù)理雜志，2011，46 (10): 1045.

[2] World Health Organization. Dementia: a public health priority [R]. Geneva: WHO，2012.

[3] Luengo-Femandez R,Leal J, Gray A. Dementia 2010: the prevalence, economic cost and research funding compared with other major diseases[R]. Booklet, Alzheimer's Research Trust, 2010.

[4] 萬(wàn)玉華，戴潔，黃春靜，等. 紫外分光光度法測(cè)定參須中的人參總皂苷的含量 [J]. 中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2012，10 (24): 146-147.

[5] 張志國(guó). 黃芪甲苷對(duì)帕金森病神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制研究 [D]. 西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2012.

[6] 劉德麗，包華音，劉楊. 近5年黃芪化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].食品與藥品，2014，16(1): 68-70.

[7] 劉紅梅，李瑞雪，楊學(xué)軍，等. 人參皂苷的神經(jīng)保護(hù)作用和機(jī)制及其在神經(jīng)變性疾病中的應(yīng)用[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31(5): 595-598.

[8] 楊文志，于淑蓮，婁子恒，等. 論人參總皂苷的科學(xué)定量方法[J].人參研究，2007，2: 7-10.

[9] 孫慕白，金竺. 紅參炮制工藝及質(zhì)量研究[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，30(4): 611-613.

(編輯：程鵬飛)

Extraction Technology of Neuro Protective New-drug

GAO Lu WANG Meihui WEI Xiaoyu QU Jiale JIANG Wenyue*

Jilin Modern Chinese Medicine Engineering and Research Center Co.,Ltd.Changchun 130000,China

Objective To determine the process parameters of optimal water-extraction, which is Neuro Protective New-drug(NPN). Methods The process parameters were optimized by an orthogonal test L9(34). Total saponins and the yield were selected as marker components and comprehensive weighted score was used to select and verify optimal process. Results The optimum water-extraction conditions was as follows: NPN was added with 10 times water, decocted for an hour for 3 times. Conclusion The optimized water-extraction and ethanol-extraction method is stable and reliable, and can provide reference for further development and utilization of the New-drug.

Neuro Protective New-drug; Orhtogonal Test; Comprehensive Score

2016-07-08

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目(NO.20130727032YY)。

高陸(1957-)，女，博士，碩士生導(dǎo)師，修正藥業(yè)集團(tuán)總工程師，副總裁，主要從事中藥新藥研究與開(kāi)發(fā)。 E-mail: bxgl@163.com

姜文月(1986-)，女，博士，主要從事新藥及保健食品開(kāi)發(fā)。E-mail: jiangwenyue1987@126.com

R284.2

A

1007-8517(2016)19-0114-03