PCR檢測實驗恒河猴和食蟹猴群體中幽門螺桿菌和“獼猴螺桿菌”的感染

王立鵬， 李永旺， 郭連香， 時長軍

(蘇州西山生物技術有限公司，江蘇 215123)

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PCR檢測實驗恒河猴和食蟹猴群體中幽門螺桿菌和“獼猴螺桿菌”的感染

王立鵬， 李永旺， 郭連香， 時長軍

(蘇州西山生物技術有限公司，江蘇 215123)

目的 調查國內實驗恒河猴和食蟹猴中幽門螺桿菌和“獼猴螺桿菌”的感染情況。方法 參考文獻中的螺桿菌屬16S rRNA和幽門螺桿菌16S rRNA的引物序列，和新設計的“獼猴螺桿菌”16S rRNA特異性引物，在人工養殖的45只成年恒河猴和90只成年食蟹猴糞便樣本中，通過qPCR或常規PCR檢測來初步調查這兩種獼猴中兩種螺桿菌的感染情況。結果 在恒河猴中幽門螺桿菌和“獼猴螺桿菌”的感染率均為100%，在食蟹猴中幽門螺桿菌和“獼猴螺桿菌”的感染率分別為100%和97.8%。結論 證實我國人工繁育飼養的恒河猴和食蟹猴普遍存在“獼猴螺桿菌”感染。幽門螺桿菌和“獼猴螺桿菌”幾乎同時存在于所有人工繁育的實驗猴個體中，可能會對這兩種獼猴的健康以及相關動物實驗結果的準確性存在不利影響。

恒河猴；食蟹猴；幽門螺桿菌； 獼猴螺桿菌；感染；診斷

Warren和Marshall在1983年從胃炎患者胃粘膜活檢標本中首次分離出幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，HP)，此后以該細菌為代表菌建立了螺桿菌屬。目前，螺桿菌屬已有23個種[1]。幽門螺桿菌，螺旋形彎曲，革蘭氏染色陰性，長2～4 μm，直徑0.4 μm，菌體一端有4條鞭毛[2]。在人體內，幽門螺桿菌主要定居于胃竇粘膜，會導致胃炎和胃潰瘍，WHO已將其定為胃癌的第一類致癌因子[3]。體外研究表明幽門螺桿菌對多種抗生素敏感，但是在體內應用發現感染人群的許多幽門螺桿菌對抗生素具有抗性。為了研究出更有效的根治幽門螺桿菌的藥物或疫苗，預防胃癌的發生，需要構建能夠感染幽門螺桿菌的動物模型[4]。目前，只有家貓和非人靈長類是幽門螺桿菌的自然宿主動物[5]。

1987～1990年期間的5篇研究報告表明，在恒河猴(rhesus monkey)和南方豚尾獼猴(Southern pig-tailed macaque)中存在幽門螺桿菌的自然感染；而在食蟹猴(cynomolgus monkey)中則既沒有發現自然感染，人工感染幽門螺桿菌也無效[2，6-9]。1993年，Takahashi的團隊用人源和恒河猴源的幽門螺桿菌人工感染食蟹猴，結果證明食蟹猴可以被人工感染幽門螺桿菌[10，11]。1999年，Reindel等首次發現食蟹猴也存在幽門螺桿菌的自然感染[12]。目前，國內仍未見對猴群中幽門螺桿菌自然感染情況的調查研究。

2001年，Fox等學者從恒河猴結腸組織中分離培養出一種新的螺桿菌，暫時命名為“獼猴螺桿菌”(Helicobactermacacae)。“獼猴螺桿菌”，螺旋形彎曲，革蘭氏染色陰性，長2～3 μm，直徑0.2 μm，菌體兩端各有1條帶鞘的鞭毛[13]。該菌長期存在于腸道中，可能與結腸炎的發生有關，引發慢性痢疾、體重下降和脫水等癥狀[14]。目前，國內尚未有對猴群中該種螺桿菌感染情況的調查研究。

本研究用螺桿菌屬16S rRNA特異性引物的普通PCR方法，對我國人工繁育的兩種獼猴群中的螺桿菌流行情況進行初步調查。確認螺桿菌在猴群中有感染后，進一步以幽門螺桿菌16S rRNA特異性引物實時熒光定量PCR方法(qPCR)對養殖場恒河猴和食蟹猴的幽門螺桿菌感染進行調查。針對“獼猴螺桿菌”16S rRNA特異性保守區域設計引物，通過PCR方法檢測我國獼猴和食蟹猴中是否存在“獼猴螺桿菌”感染。由于“Helicobactermacacae”(“獼猴螺桿菌”)尚未被原核生物命名國際委員會(ICSP)正式采用，因此本文用引號標記以示區別。

1 材料和方法

1.1 獼猴糞便樣本

45只2～4歲的雄性恒河猴和90只雌雄各半的4歲左右食蟹猴的新鮮糞便樣本分別采集自不同實驗猴人工繁育場，樣本冷藏空運至本公司，-20℃保存待用。

1.2 糞便樣本DNA提取

取恒河猴或食蟹猴的糞便樣本200 mg，用糞便基因組DNA提取試劑盒(天根，貨號#DP328)提取核酸，操作步驟按照試劑盒說明書進行。最終用100 μL無菌水洗脫，-20℃保存待用。

1.3 幽門螺桿菌陽性對照制備

Helicobacterpylori株(ATCC 43504)，用含有血瓊脂和7%馬血等的彎曲桿菌選擇性血瓊脂培養基，在37℃微需氧環境下培養。之后用無菌棉棒刮取部分菌落，計數并稀釋至109CFU/mL，10倍梯度稀釋至100CFU/mL。經PCR測試，103CFU/mL菌液提取的DNA模板可作為PCR反應的陽性對照。

1.4 其他細菌DNA樣本

從肺炎克雷伯氏桿菌CVCC3699，大腸埃希氏菌 CMCC44102，嗜肺巴斯德桿菌ATCC35149，假結核耶爾森CMCC53504，乙型溶血性鏈球菌CMCC32210，肺炎鏈球菌ATCC49619，多殺巴斯德桿菌CVCC458，金黃色葡萄球菌CMCC26003，雞白痢沙門氏菌CVCC528，志賀氏菌CMCC51252，小腸結腸耶爾森氏菌GIM1.265及空腸彎曲桿菌ATCC33291中提取基因組DNA，用于3種引物的特異性實驗。

1.5 引物及質粒合成

引物和質粒的合成均由蘇州金唯智生物技術有限公司合成和構建。螺桿菌屬16S rRNA特異性上游引物HSPP767 F: GGCTATGACGGGTATCCG GC，下游引物HSPP767 R:GCCGTGCAGCACCT GTTTTC[15]；幽門螺桿菌16S rRNA特異性上游引物HP-P1 F:TTTGTTAGAGAAGATAATGACGGTATCTA AC，下游引物HP-P1R:CATAGGATTTCACACCT GACTGACTATC[4]；“獼猴螺桿菌”16S rRNA特異性引物H.M8F：GGGATGCTCTTAGAAATGC，H.M8R：GCTCTTTACGCCCAGTGATT，為本公司設計。HSPP767 F/HSPP767 R、HP-P1F/HP-P1R和H.M8F/H.M8R的靶序列人工合成后分別連接到pUC57載體上，即為pc12、pc16和pc20。

1.6 普通PCR反應

PCR儀為Eppendorf 6321。反應體系包含10 mM Tris-Cl(pH 8.3)，50 mM KCl和2 mM MgCl2，4種dNTP各0.2 mM，上下游引物各0.4 μM，1U rTaq DNA聚合酶(Takara，#KA201A)，5 μL糞便樣本提取的DNA模板，總體積為25 μL。PCR反應條件為95℃預變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，進行35個循環，之后72℃延伸5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳，5 V/cm，100 bp DNA marker(天根，#BSA22S1)4 μL，凝膠中摻入0.01% GeneRed(博美達，#41003-0.5 mL)作為熒光染料，由凝膠成像分析儀(上海勤翔，Genosens1560)采集電泳結果。每次實驗中，均設置質粒陽性對照和模板空白對照，所有測試組均重復2次。

1.7 實時熒光定量PCR反應

PCR儀為ABI 7500 Real-Time PCR System。反應體系為20 μL，含2× Premix Ex Taq(SYBR)10 μL，ROX(50×)0.4 μL，上下游引物各0.2 μM，補加無菌水至20 μL。反應條件為95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸31 s，采集信號，40個循環；95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，95℃變性15 s，60℃ 15 s繪制溶解曲線。每次實驗中，均設置質粒陽性對照和模板空白對照，所有測試組均重復2次。

1.8 擴增產物測序與比對

部分PCR產物送交蘇州金唯智生物技術有限公司測序。序列比對分析軟件為DNAMAN 6.0。

2 結果

2.1 PCR方法建立

以各自相應的質粒為模板，10-1～10-12做系列梯度稀釋，用于3種引物的敏感性實驗，結果表明HSPP767和H.M8的普通PCR檢測下限為1 132拷貝/5 μL，HP-P1引物的qPCR檢測下限為68拷貝/5 μL。3對引物均不會擴增雞白痢沙門氏菌、志賀氏菌、小腸結腸耶爾森氏菌、大腸埃希氏菌及空腸彎曲桿菌等細菌的核酸，表明3對引物用于糞便提取核酸的PCR特異性好。這一部分的結果未展示。

2.2 獼猴中螺桿菌屬細菌檢測

以HSPP767引物對恒河猴和食蟹猴的糞便提取DNA樣本進行PCR擴增，45份恒河猴糞便樣本均為螺桿菌陽性；90份食蟹猴糞便樣本中有89份為螺桿菌陽性，僅有1份樣本為螺桿菌陰性。陽性樣本擴增產物大小與目的擴增片段相同，為767 bp。結果見圖1和圖2。

2.3 獼猴中幽門螺桿菌的檢測

用HP-P1引物對恒河猴和食蟹猴的糞便提取DNA樣本進行qPCR檢測，135份獼猴的糞便樣本檢測結果全部為幽門螺桿菌陽性，隨機選取3份樣本的擴增產物送交測序并與靶序列進行分析比對，確認擴增產物均為幽門螺桿菌。擴增產物見結果圖3。

2.4 獼猴中“獼猴螺桿菌”的檢測

以H.M8引物對恒河猴和食蟹猴的糞便提取DNA樣本進行PCR擴增，45份恒河猴糞便樣本均為“獼猴螺桿菌”陽性；90份食蟹猴樣本中，有88份為“獼猴螺桿菌”陽性，2份陰性。陽性樣本擴增產物大小與目的片段相同，為493 bp。隨機選取3份擴增產物送交測序，結果表明擴增子與靶序列高度相似，確認為“獼猴螺桿菌”。結果見圖4和圖5。另外，圖4中展示了這對引物以Helicobacterpylori菌株DNA為模板時，擴增結果是陰性的，表明該引物不擴增幽門螺桿菌。以上六項檢測結果的匯總見表1。

表1 恒河猴和食蟹猴中螺桿菌感染統計

M：100 bp marker ladder；BC：不含核酸模板的空白對照組；PC：陽性質粒對照PC12；泳道1～45：為45份恒河猴糞便提取DNA樣本擴增產物圖1 恒河猴45份樣本中螺桿菌的檢測結果M, 100 bp marker ladder; BC, blank control without nucleic acid template; PC, positive control with plasmid PC12; Lane 1-45, 45 DNA samples from feces of rhesus macaques.Fig.1 PCR results of 45 rhesus macaques stool samples with HSPP767 primers for Helicobacter.

M：100 bp marker ladder；BC：不含核酸模板的空白對照組；PC：陽性質粒對照pc12；泳道1～90：90份食蟹猴糞便提取DNA樣本圖2 食蟹猴90份樣本的螺桿菌檢測結果M, 100 bp marker ladder; BC, Blank control without nucleic acid template; PC, positive control with plasmid pc12; Lane 1-90, 90 DNA samples from feces of cynomolgus monkeys.Fig.2 PCR results of the HSPP767 primers for Helicobacter in 90 cynomolgus monkeys.

——：完全一致序列；….:空缺序列圖3 恒河猴3個樣本HP-P1產物測序結果比對“——”: The identical sequence; “….”: Absence of sequence.Fig.3 The alignment results of 3 amplicons of HP-P1F/ HP-P1R in rhesus macaques

M：100 bp marker ladder；BC：不含核酸模板的空白對照組；PC：質粒陽性對照pc20；HP：H. pylori對照；泳道1～45：45份恒河猴糞便提取DNA樣本；泳道46～135：90份食蟹猴提取DNA樣本圖4 恒河猴和食蟹猴樣本中“獼猴螺桿菌”PCR產物電泳結果M, 100 bp marker ladder; BC, blank control without nucleic acid template; PC, positive control with pc20; HP, H. pylori DNA; Lane 1-45, 45 DNA samples from feces of rhesus macaques; Lane 46-135, 90 DNA samples from feces of cynomolgus monkeysFig.4 PCR results of the Helicobacter macacae in rhesue and cynomolgus monkeys.

——：完全一致序列；….：空缺序列圖5 恒河猴3份樣本H.M8擴增產物測序結果比對——: The Identical sequence;….: Absence of sequence.Fig.5 The alignment result of the amplicon of H.M8 primers with 3 rhesue macaques samples.

3 討論

本研究建立了PCR用糞便樣本檢測實驗猴幽門螺桿菌和“獼猴螺桿菌”的方法，并證實我國人工繁育的恒河猴和食蟹猴中普遍存在這兩種螺桿菌感染。

恒河猴和食蟹猴中自然感染幽門螺桿菌后，通常都不會表現出明顯的臨床癥狀。內窺鏡檢常見胃黏膜紅斑、表層粘膜增生及單核細胞浸潤等炎癥反應，但未見萎縮性胃炎或胃癌的發生[2，12]。1988年，Baskerville等在11只恒河猴中以組織學檢查和胃黏膜微生物分離培養法確認其中有6只被幽門螺桿菌感染，感染率為54.5%[7]；1990年，Arther等以上述相同的方法在34只恒河猴中檢測到12只被幽門螺桿菌自然感染，感染率為35.5%[2]；1995年，Dubios等用ELISA法檢測血清中抗幽門螺桿菌IgG水平，在196只不同年齡段和飼養方式(包括野生)的恒河猴中，發現在1歲恒河猴的幽門螺桿菌感染率已達到50%以上，2～6歲時感染率為80%左右，在7～10歲時感染率最高，可達到90%左右[16]；1997年，Laurence等用PCR檢測了23只1～3歲中國來源恒河猴的胃部活檢組織樣本，其中有21只幽門螺桿菌陽性，感染率為91.3%；而同時用培養的方法檢出率僅52%[5]。這些結果表明，血清學或PCR方法檢測幽門螺桿菌的敏感性遠高于組織學檢查或微生物培養。本文用16S rRNA特異性引物對45只恒河猴糞便樣本的篩查表明，在2～4歲的恒河猴群中，幽門螺桿菌感染率為100%。此結果說明PCR檢測糞便樣本幽門螺桿菌在實驗動物健康監測應用的可行性，并證明我國恒河猴群體中幽門螺桿菌感染的普遍性。

目前，對食蟹猴感染幽門螺桿菌的研究很少[12]。由于恒河猴資源有限，而食蟹猴的人工養殖更普遍，生物醫藥研究中應用更廣泛。早期用內窺鏡檢、胃黏膜樣本組織學檢查和微生物培養法進行的調查研究認為食蟹猴既不會自然感染幽門螺桿菌，也對人工感染的人源和恒河猴源的幽門螺桿菌不敏感[2，6]。相反，Takahashi等在1993年成功地用幽門螺桿菌人工感染了食蟹猴[10，11]。Reindel等1999年也報道了與上述相同方法進行的調查，發現食蟹猴可以自然感染幽門螺桿菌，在63只2～4歲的食蟹猴中，幽門螺桿菌陽性感染率達69.8%，病理研究也確認感染造成組織炎癥改變[12]。目前，尚未見有用PCR方法對食蟹猴中幽門螺桿菌感染情況的調查。本文首次用16S rRNA特異性引物對90只雌雄各半的4歲食蟹猴的糞便樣本進行調查研究，結果表明幽門螺桿菌感染率為100%，比以往國外報道的感染率都高，與本文中恒河猴群中感染率相同，而傳統的分離培養或血清學方法檢測幽門螺桿菌有低敏感性的局限。

Fox等在2007年從一例患有腺癌的恒河猴回腸內容物中分離出一種螺桿菌新種并命名為“獼猴螺桿菌”。此后，該研究團隊對飼養在一起的26只患有回結腸炎恒河猴的回腸內容物進行分離培養，其中有21只恒河猴為螺桿菌陽性；同時對35只沒有回結腸炎的恒河猴檢測發現也有20只為螺桿菌陽性[13，14]。但是作者僅選擇其中少數樣本進行16S rRNA分析，因此無法得知該群體中“獼猴螺桿菌”感染的實際數量。至今尚未見有關食蟹猴中“獼猴螺桿菌”感染的相關研究報道。文獻中獼猴螺桿菌是通過活組織培養，此培養方法有損動物健康；通過糞便培養分離獼猴螺桿菌難度太大，由于糞便中菌群復雜，且獼猴螺桿菌生長環境、形態特征普遍，進一步分純進行微生物培養鑒定難度大。因此我們針對“獼猴螺桿菌”的7個細菌株的16S rRNA序列進行比對分析后，設計了特異性引物。實驗表明該引物靈敏度高，且特異性好，與包括幽門螺桿菌在內的數種常見腸道菌無交叉。我們用該引物進行的調查結果表明，在45只2～4歲的恒河猴中“獼猴螺桿菌”的感染率為100%；在90只食蟹猴中有88只為“獼猴螺桿菌”陽性，感染率達97.8%，證明了我們建立的檢測該菌的PCR方法的可行性和實驗猴感染“獼猴螺桿菌”的普遍性。

在本研究中，有1份食蟹猴樣本的螺桿菌屬特異性引物PCR檢測結果為陰性，但幽門螺桿菌特異性引物qPCR檢測結果為陽性。由于qPCR比常規PCR靈敏度高20倍以上，因此該例結果的不符合可能是不同方法的敏感性的差異所致。需進一步建立螺桿菌和“獼猴螺桿菌”的qPCR檢測方法可提高檢測敏感性。

目前的研究表明，只有家貓和非人靈長類是幽門螺桿菌的自然感染動物宿主[5]。非人靈長類與人親緣關系非常緊密，幽門螺桿菌在非人靈長類中也分布于胃黏膜中，會引發不同程度的持續性胃炎，以及幽門螺桿菌在猴群中廣泛存在自然感染的情況，使得非人靈長類成為研究幽門螺桿菌感染人體后的致病機理、藥物篩選和疫苗開發的最佳實驗動物[5，16]。另一方面，由于幽門螺桿菌感染人群后，會造成胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍甚至胃癌，在實驗猴群中廣泛存在的幽門螺桿菌污染，可能會對飼養人員和實驗人員的身體健康造成威脅，因此應及時發現并清除實驗猴中自然感染的幽門螺桿菌[3]。而實驗猴感染幽門螺桿菌造成的胃炎以及“獼猴螺桿菌”造成的回結腸炎，可能會對使用這些動物進行的藥效學或藥物毒理學實驗造成干擾[14]。雖然目前國內外尚未有對實驗猴中的幽門螺桿菌感染的監測要求，但有必要建立不攜帶幽門螺桿菌的SPF級實驗猴應用于消化道藥物臨床前研究。

總之，本研究針對螺桿菌屬、幽門螺桿菌和“獼猴螺桿菌”的16S rRNA特異性區域建立的PCR方法，檢測實驗猴糞便樣本中這些細菌具有特異、敏感和可行的優勢，通過對人工繁育的恒河猴和食蟹猴的螺桿菌感染狀況初步調查，表明實驗恒河猴和食蟹猴都存在幽門螺桿菌和“獼猴螺桿菌”的復合感染。

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PCR test ofHelicobacterpyloriand “Helicobactermacacae” infections in rhesus and cynomolgus monkey breading colonies

WANG Li-peng, LI Yong-wang, GUO Lian-xiang, SHI Chang-jun

(Suzhou Xishan Biotechnology Inc., Suzhou Jiangsu 215123, China)

Objective To investigate the status ofHelicobacterpyloriand “Helicobactermacacae” infection in rhesus and cynomolgus monkeys in China. Methods With the use of 16S rRNA specific primers for Helicobacter spp andHelicobacterpylori(HP) from published literatures, and new 16S rRNA specific primers designed for “Helicobactermacacae” (HM), we investigated the infection status of these two Helicobacter spps in both of 45 rhesus and 90 cynomolgus monkeys by qPCR or conventional PCR on stool samples. Results All three primer sets for 16S rRNA exhibited excellently sensitivity and specificity. Both the infection rates of HP and HM were 100% among 45 young adult rhesus monkeys. The infection rate of HP and HM in 90 young adult cynomolgus monkeys were 100% and 97.8%, respectively. ConclusionsHelicobacterpyloriand “Helicobactermacacae” are present in almost every artificially bred adult rhesus and cynomolgus individuals which may adversely affect the health of laboratory monkeys and the accuracy of related animal experiments.

Rhesus monkey; Cynomolgus monkey;Helicobacterpylori; “Helicobactermacacae”; Infection; Diagnosis

王立鵬(1989-)，男，碩士。Email：wlpburry@126.com。

時長軍(1953-)，男，博士。Email：changjun.shi@vrl.net。

R-33

A

1671-7856(2016)10-0061-08

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.10.012

2016-05-09