乳腺癌局部微環(huán)境中免疫相關細胞因子mRNA表達狀態(tài)及臨床病理意義

崔 剛，張娜娜，閻 艷，鄧寶國，胡業(yè)佳，王鴻雁，王一理

(1.西安交通大學基礎醫(yī)學院癌癥研究所，陜西 西安，710061；2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院病理科，陜西 西安，710061)

?

乳腺癌局部微環(huán)境中免疫相關細胞因子mRNA
表達狀態(tài)及臨床病理意義

崔 剛1，張娜娜1，閻 艷1，鄧寶國1，胡業(yè)佳1，王鴻雁2，王一理1

(1.西安交通大學基礎醫(yī)學院癌癥研究所，陜西 西安，710061；2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院病理科，陜西 西安，710061)

目的 研究乳腺癌局部微環(huán)境中免疫相關細胞因子干擾素(IFN)-γ、白介素(IL)-10和轉化生長因子(TGF)-β mRNA表達的狀況，并與臨床病理特征相比較，探討其意義。方法 48例乳腺浸潤性導管癌手術切除標本，根據(jù)是否淋巴結轉移分為兩組，采用地高辛末端標記的寡核苷酸探針，以原位雜交技術檢測腫瘤浸潤單個核細胞和腫瘤細胞IFN-γ、IL-10和TGF-β mRNA的表達狀況。結果 淋巴結轉移組乳腺癌細胞TGF-β和IL-10 mRNA表達明顯高于無淋巴結轉移組(TGF-β [%/積分指數(shù)]：46.25±12.88/0.49±0.27 vs 19.33±7.69/0.28±0.18; IL-10[%/積分指數(shù)]: 39.08±17.49/ 0.42±0.19 vs 22.58±7.87/0.33±0.17,t=4.330,P<0.01;t=2.962,P<0.05)，TGF-β mRNA在乳腺癌細胞中表達的差別更為明顯。未檢出IFN-γ mRNA陽性腫瘤細胞。腫瘤間質(zhì)浸潤的單個核細胞中，淋巴結轉移組IFN-γ mRNA陽性細胞明顯低于TGF-β、IL-10 mRNA陽性細胞(TGF-β:35.58±13.62/0.40±0.25, IL-10:40.83±15.49/0.47±0.22 , IFN-γ:18.17±8.41/0.18±0.08,t= 3.005,P<0.05;t=4.390,P<0.01;t=3.563,P<0.01)。結論 乳腺癌組織局部微環(huán)境中，調(diào)節(jié)T細胞和Th2免疫相關細胞因子mRNA表達明顯占優(yōu)勢，使得腫瘤免疫微環(huán)境趨于抗瘤免疫反應抑制狀態(tài)。

乳腺癌；細胞因子；原位雜交；信使核糖核酸(mRNA)

腫瘤免疫微環(huán)境影響荷瘤宿主的抗瘤免疫反應已得到共識[1]。已知腫瘤局部免疫微環(huán)境主要由影響免疫反應的細胞因子所決定，Th1型(T help type 1)細胞因子主要介導細胞免疫，而Th2型(T help type 2) 細胞因子有利于體液免疫，調(diào)節(jié)T細胞相關細胞因子的狀態(tài)，可反映調(diào)節(jié)T細胞的狀態(tài)。分析腫瘤局部不同細胞因子的狀態(tài)，能夠反映腫瘤免疫微環(huán)境是有利于抗瘤免疫擬或偏向于抑制抗瘤免疫反應[2]。乳腺癌組織中浸潤淋巴細胞的程度與患者的預后相關，乳腺癌局部引流淋巴結的組織學反應亦很早就受到人們的關注[3]。而對于腫瘤局部浸潤灶中單個核細胞的細胞因子分泌模式，以及腫瘤細胞分泌免疫相關細胞因子的模式報道較少，然而腫瘤組織中單個核細胞的功能在很大程度上取決于所處的細胞因子微環(huán)境，因而分析乳腺癌表達特定免疫相關細胞因子的腫瘤局部浸潤灶中單個核細胞和腫瘤細胞狀況，更能明確其臨床病理意義。本研究采用原位雜交技術檢測了48例手術切除的乳腺浸潤性導管癌及其淋巴結干擾素(IFN-γ,Interferon-γ)、(IL-10,Interleukin-10 )、轉化生長因子(TGF- 1，Transforming growth factor- 1) 3種細胞因子mRNA表達, 比較其差異并進行半定量分析，探討細胞因子表達與腫瘤病理分期的關系。

1 材料與方法

1.1組織樣本與探針標記

有48例手術切除的乳腺浸潤性導管癌及其淋巴結標本，均來自西安交通大學第一附屬醫(yī)院，患者均為女性，年齡30～72歲, 中位年齡51歲。術前均未接收放化療。依據(jù)是否淋巴結轉移將標本分為兩組，即淋巴結轉移組和淋巴結未轉移組。探針設計則根據(jù)Genebank中人IFN-γ、IL-10和TGF-β基因序列，利用Primer 6軟件輔助設計引物如下： IFN-5′-TCA GTT ACC GAA TAA TTA GTC AGC TTT-3′，IL-105′-AGG CTT CTA TGT AGT TGA TGA AGA TGT-3′，TGF-15′-CCA AGG TGC TCA ATA AAT AGA TCT AAC-3′。3種細胞因子寡核苷酸探針由上海博亞生物技術公司合成。寡核苷酸地高辛標記試劑盒購自德國羅氏公司(Roche, Mannheim, Germany )。探針標記依據(jù)試劑盒操作流程進行。

1.2 mRNA原位雜交

細胞因子TGF-β、IL-10和IFN-γ mRNA石蠟切片原位雜交操作過程，均在無RNA酶的環(huán)境中按常規(guī)操作進行。切片經(jīng)脫蠟、消化和再固定，并經(jīng)梯度酒精脫水后，DEPC處理15分鐘。在42℃預雜交2h，然后在42℃下雜交22h。以梯度檸檬酸鈉鹽溶液(SSC)充分洗滌后，加堿性磷酸酶標記的抗DIG抗體于37℃作用2h，用NBT/BCIP底物顯色18h，甲基綠復染。結果判定：光鏡下細胞質(zhì)中出現(xiàn)紫藍色沉淀者為陽性雜交信號。在裝有網(wǎng)格目鏡的高倍鏡下，每張切片隨機取5個高倍視野，計數(shù)200個細胞，計算陽性細胞的百分數(shù)，并根據(jù)細胞中陽性顆粒數(shù)的多少及顏色的深淺分為：陰性(-)、弱陽性(+)、陽性(++)、強陽性(+++)并分別記為0、1、2、3分，將陽性細胞的百分率與染色強度積分的乘積作為積分指數(shù)。檢測TGF-β、IL-10和IFN-γ mRNA在乳腺癌組織以及在腫瘤間質(zhì)浸潤性淋巴細胞中的表達情況。

1.3統(tǒng)計學方法

2結果

2.1乳腺癌細胞中轉化生長因子-β和白介素-10 mRNA的表達

免疫相關細胞因子在腫瘤細胞中的表達，在癌巢中呈現(xiàn)IL-10 mRNA陽性腫瘤細胞(見圖1)，TGF-β mRNA陽性細胞的分布與IL-10 mRNA陽性癌細胞相似。分別計數(shù)兩類細胞因子陽性癌細胞，顯示局部淋巴結轉移組原發(fā)癌組織中陽性細胞明顯高于淋巴結未轉移組，見表1。引人注意的是，在癌細胞中未檢出IFN-γ mRNA陽性癌細胞。

表1 TGF-β和IL-10 mRNA陽性癌細胞分布狀態(tài)

圖1 代表性乳腺癌組織中IL-10 mRNA表達陽性癌細胞，腫瘤浸潤單個核細胞(標尺50μm)

Fig.1 IL-10 mRNA positive cancerous cells and tumor infiltrating mononuclear cells in representative breast cancer tissues (scale 50μm)

2.2乳腺癌組織浸潤單個核細胞中免疫相關細胞因子mRNA表達

腫瘤浸潤單個核細胞中可見3種細胞因子mRNA陽性細胞分布，而IFN-γ mRNA陽性信號僅見于浸潤的單個核細胞(見圖2)。總體來說，TGF-β mRNA和IL-10 mRNA陽性細胞多于IFN-γ mRNA陽性細胞，在淋巴結受累組，TGF-β mRNA和IL-10 mRNA陽性細胞明顯多于淋巴結未受累組；即便IFN-γ mRNA陽性細胞少于其他兩種細胞因子陽性細胞，但仍可看到淋巴結未受累組IFN-γ mRNA陽性細胞多于淋巴結受累組，見表2。

表2 乳腺癌浸潤單個核細胞中免疫相關細胞因子mRNA表達狀態(tài)±S)

圖2 代表性乳腺癌組織中IFN-γ mRNA表達陽性腫瘤浸潤單個核細胞(標尺50μm)

Fig.2 IFN-γ mRNA positive tumor infiltrating mononuclear cells in representative breast cancer tissues (scale 50μm)

3討論

已經(jīng)明確，腫瘤局部是宿主免疫系統(tǒng)與腫瘤細胞直接相互作用的場所，而腫瘤浸潤單個核細胞是抵抗腫瘤擬或抑制抗瘤免疫反應最終取決于局部微環(huán)境的狀況，影響腫瘤免疫微環(huán)境的主要因素就是免疫相關細胞因子的狀態(tài)[4]。Th2型細胞因子有助于體液免疫反應，而Th1型細胞因子則使得免疫反應向細胞免疫偏移，有利于抗瘤免疫反應的形成。目前已經(jīng)認識到，TGF-β作為重要的調(diào)節(jié)T細胞相關細胞因子，在抑制抗瘤免疫反應中發(fā)揮重要作用[5]。

本研究利用細胞因子特異性探針，原位雜交方法，在乳腺癌組織局部檢測TGF-β、IL-10和IFN-γ mRNA的表達，結果顯示，腫瘤細胞能夠產(chǎn)生IL-10、TGF-β等免疫抑制性細胞因子，而腫瘤浸潤單個核細胞雖然產(chǎn)生IFN-γ，但仍以IL-10、TGF-β為主，腫瘤免疫微環(huán)境顯示抗瘤免疫抑制狀態(tài)。

3.1乳腺癌細胞表達免疫抑制性細胞因子

腫瘤免疫逃逸是抗瘤免疫反應不能奏效的主要原因，腫瘤局部微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)，除了腫瘤浸潤炎性細胞的影響外，與腫瘤細胞本身營造免疫抑制狀態(tài)密不可分。腫瘤細胞本身可表達免疫抑制分子，如PD-L1與腫瘤浸潤淋巴細胞相互作用，直接作用于局部浸潤的免疫潛能細胞，從而抑制抗瘤免疫反應[6]。另一方面，腫瘤細胞還可以分泌多種免疫抑制因子，影響腫瘤浸潤單個核細胞的分化和功能[7]，涉及腫瘤血管形成，侵襲以及免疫抑制，包括血管內(nèi)皮生長因子，TGF-β，巨噬細胞炎性蛋白(MIP)等。TGF-β作為多功能性細胞因子，可抑制免疫反應，刺激腫瘤血管和腫瘤基質(zhì)的形成。抑制淋巴細胞的分化、增殖和功能啟動，從而使腫瘤細胞逃逸機體的免疫監(jiān)視，促進腫瘤組織的轉移[8-9]。本研究結果顯示，腫瘤細胞可明顯產(chǎn)生IL-10、TGF-β等免疫抑制因子。無論是淋巴結轉移組或淋巴結未轉移組，均未發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞產(chǎn)生IFN-γ，這種免疫微環(huán)境有利于調(diào)節(jié)T細胞分化和體液免疫反應偏移，也反映了乳腺癌組織自主的免疫抑制微環(huán)境營造能力。

3.2腫瘤浸潤單個核細胞主要表達免疫抑制性細胞因子

腫瘤浸潤單個核細胞是荷瘤宿主對腫瘤細胞免疫反應的有力證據(jù)，但免疫反應是否奏效則取決于浸潤細胞的種類和局部免疫微環(huán)境。細胞因子的變化在腫瘤局部免疫微環(huán)境中所起的作用越來越受到人們的重視。過去認為大多數(shù)腫瘤細胞為弱免疫原性，不能激活宿主的免疫系統(tǒng)。近來發(fā)現(xiàn)，所謂不具免疫原性持續(xù)生長的腫瘤能夠活化腫瘤特異性T細胞，但這些腫瘤抗原特異性T細胞分泌Ⅱ型細胞因子(如IL-10和TGF- β)。相反，具有免疫原性的腫瘤能誘發(fā)Ⅰ型免疫應答，分泌大量腫瘤特異性IFN-γ 。這些實驗表明，所謂的不具免疫原性和具有免疫原性的腫瘤都能引起免疫應答，但其所誘發(fā)的免疫應答類型與腫瘤的結局緊密相關。誘發(fā)Ⅰ型應答的腫瘤可以被排斥，而誘發(fā)Ⅱ型應答的腫瘤則持續(xù)生長[10]。因此，腫瘤在體內(nèi)持續(xù)生長的原因也許并非是不能被機體免疫系統(tǒng)識別，而是主要刺激Th2細胞反應，腫瘤局部微環(huán)境中參與免疫抑制的Ⅱ型細胞因子占主導地位。本實驗結果顯示，乳腺癌組織浸潤的單個核細胞中，IL-10和TGF-β陽性細胞占主導地位，而IFN- 陽性細胞明顯少于前兩者，隨著腫瘤進展，這種現(xiàn)象愈加明顯。IL-10和TGF- β為典型的Ⅱ型細胞因子，通過影響機體免疫的多種途徑抑制抗腫瘤免疫應答，如抑制抗原提呈，抑制抗原特異性T細胞分化和Ⅰ型細胞因子產(chǎn)生，對形成乳腺癌患者的免疫抑制狀態(tài)起著十分關鍵的作用，也是重要的調(diào)節(jié)性T細胞相關細胞因子[11]。調(diào)節(jié)性T細胞和腫瘤相關巨噬細胞的抗瘤免疫抑制作用已被廣泛認可，雖然本實驗未對腫瘤浸潤單個核細胞進行分類，但通過檢測免疫抑制性細胞因子陽性細胞，也能夠揭示腫瘤組織中浸潤免疫潛能細胞的功能狀態(tài)。

毫無疑問，腫瘤局部微環(huán)境的變化是復雜的，僅僅分析數(shù)種免疫相關細胞因子難以全面闡明乳腺癌的免疫微環(huán)境，但TGF-β、IL-10和IFN-γ這3種代表性的細胞因子的變化趨勢，在一定程度上反映了乳腺癌局部微環(huán)境免疫抑制的狀態(tài)。

[1]Kline J, Zhang L, Battaglia L,etal. Cellular and molecular requirements for rejection of B16 melanoma in the setting of regulatory T cell depletion and homeostatic proliferation[J]. Immunol,2012,188(6):2630-2642.

[2]Dennis K L, Blatner N R, Gounari F,etal.Current status of interleukin-10 and regulatory T-cells in cancer[J].Curr Opin Oncol,2013,25(6): 637-645.

[3]Bierie B, Moses H L.Transforming growth factor beta (TGF-beta) and inflammation in cancer[J]. Cytokine Growth Factor Rev,2010, 21(1): 49-59.

[4]劉镕,趙琴平,董惠芬,等.TGF-β信號傳導通路及其生物學功能[J].中國病原生物學雜志，2014,9(1):77-83.

[5]Katz L H, Li Y, Chen J S,etal.Targeting TGF-β signaling in cancer[J].Expert Opin Ther Targets,2013,17(7):743-760.

[6]Kim J R,Moon Y J,Kwon K S,etal.Tumor infiltrating PD1-positive lymphocytes and the expression of PD-L1 predict poor prognosis of soft tissue sarcomas[J].PLoS One,2013,8(12):e82870.

[7]Lievense L A,Cornelissen R,Bezemer K,etal.Pleural Effusion of Patients with Malignant Mesothelioma Induces Macrophage-Mediated T Cell Suppression[J].J Thorac Oncol,2016,11(10):1755-1764.

[8]Furuta C, Miyamoto T, Takagi T,etal.Transforming growth factor-β signaling enhancement by long-term exposure to hypoxia in a tumor microenvironment composed of Lewis lung carcinoma cells[J].Cancer Sci, 2015,106(11):1524-1533.

[9]Hassuneh M R, Nagarkatti M, Nagarkatti P S.Role of interleukin-10 in the regulation of tumorigenicity of a T cell lymphoma[J].Leuk Lymphoma,2013,54(4):827-834.

[10]Tanikawa T, Wilke C M, Kryczek I,etal.Interleukin-10 ablation promotes tumor development, growth, and metastasis[J].Cancer Res,2012,72(2):420-429.

[11]Matise L A, Palmer T D, Ashby W J,etal.Lack of transforming growth factor-β signaling promotes collective cancer cell invasion through tumor-stromal crosstalk[J].Breast Cancer Res,2012,14(4):R98.

[專業(yè)責任編輯：張冠軍]

Expression status of immune related cytokines mRNA in local microenvironment of breast cancer and its clinicopathologic significance

CUI Gang1, ZHANG Na-na1, YAN Yan1, DENG Bao-guo1, HU Ye-jia1, WANG Hong-yan2, WANG Yi-li1

(1.Institute of Cancer Research, School of Basic Medical Sciences, Xi’an Jiaotong University,Shaanxi Xi’an 710061, China;2.Department of Pathology, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Shaanxi Xi’an 710061, China)

Objective To investigate the expression status of immune related cytokines IFN-γ, IL-10 and TGF-β mRNA in breast cancerous microenvironment and make comparison with clinicopathologic features to explore its significance. Methods Forty-eight samples of breast cancer with excised axillary lymph nodes were included. The samples were divided into two groups according to lymph node metastatic status. Digoxin-labeled oligonucleotide probes and in situ hybridization technique were used to detect the expressions of IFN-γ, IL-10 and TGF-β mRNA in breast cancer cells and the tumor infiltrating mononuclear cells. Results The expressions of TGF-β and IL-10 mRNA in breast cancerous cells were significantly higher in node metastatic group compared to those of non-metastatic group (TGF-β[%/accumulative index]:46.25±12.88/0.49±0.27 vs 19.33±7.69/0.28±0.18; IL-10[%/accumulative index]: 39.08±17.49/0.42±0.19 vs 22.58±7.87/0.33±0.17,t=4.330,P<0.01;t=2.962,P<0.05). The difference in expression of TGF-β mRNA in breast cancer cells was more significant. IFN-γ mRNA positive cancer cell was not detected. In tumor infiltrating mononuclear cells, the IFN-γ mRNA positive cells in node metastatic group were significantly less than TGF-β and IL-10 mRNA positive cell (TGF-β:35.58±13.62/0.40±0.25, IL-10:40.83±15.49/0.47±0.22, IFN-γ:18.17±8.41/0.18±0.08,t=3.005,P<0.05;t=4.390,P<0.01;t=3.563,P<0.01).Conclusion Treg and Th2 related cytokines are predominated in local microenvironment of breast cancer and the microenvironments of breast cancer demonstrate an immunoinhibitory status in terms of anticancer immune response.

breast cancer; cytokine; in situ hybridization; mRNA

2016-07-12

崔 剛(1963-)，男，副教授，碩士，主要從事腫瘤病理的研究。

王一理，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.10.014

R737.9

A

1673-5293(2016)10-1207-03