Msx2條件性基因敲除小鼠動物模型的建立和表型的初步研究

于紫燕，王春霞，孫琦，趙江月，2，張勁松

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，中國醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院，遼寧省晶狀體學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110005；2.浙江大學(xué)醫(yī)院院附屬第二醫(yī)院眼科，杭州 310009）

·論著·

Msx2條件性基因敲除小鼠動物模型的建立和表型的初步研究

于紫燕1，王春霞1，孫琦1，趙江月1，2，張勁松1

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，中國醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院，遼寧省晶狀體學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110005；2.浙江大學(xué)醫(yī)院院附屬第二醫(yī)院眼科，杭州 310009）

目的利用Cre/LoxP系統(tǒng)建立晶狀體組織特異性Msx2基因敲除小鼠模型，并初步研究其表型。方法設(shè)計基因敲除方案，獲得條件基因敲除小鼠Msx2cko和對照野生型小鼠Msx2wt。通過PCR技術(shù)對小鼠或E10.5和E14.5胚鼠進(jìn)行基因型鑒定，通過整胚LacZ染色鑒定Le?Cre重組酶活性，同時通過對P1小鼠晶狀體組織行HE染色進(jìn)行初步表型觀察。結(jié)果通過基因型檢測證實(shí)了Msx2基因敲除小鼠模型建立成功，LacZ染色顯示Le?Cre重組酶特異性表達(dá)在發(fā)育中的小鼠胚胎形成晶狀體板的表面外胚葉特定區(qū)域。Msx2cko P21小鼠表現(xiàn)為小眼球畸形，眼周至鼻線性脫毛。HE染色顯示Msx2cko小鼠晶狀體體積減小及晶狀體莖形成。結(jié)論初步建立了Msx2條件性基因敲除小鼠模型，Msx2條件基因敲除后引起小鼠晶狀體發(fā)育異常，小眼球畸形。

晶狀體；條件基因敲除；小鼠；Msx2

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晶狀體作為眼屈光間質(zhì)，具有屈光和調(diào)節(jié)等重要功能。同時，晶狀體在眼組織發(fā)育過程中也起著至關(guān)重要的作用。由于晶狀體接近胚胎表面，易于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，所以近1個世紀(jì)以來，各國學(xué)者對晶狀體的發(fā)生發(fā)育進(jìn)行了廣泛深入的研究。

同源盒基因Msx（muscle segment homeobox）屬于Hox基因家族成員，脊椎動物中已有3個Msx基因被識別，均為染色體上不相連續(xù)但結(jié)構(gòu)極為相似的成員。Msx2基因位于5號染色體長臂5q34?q35，編碼由263個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，它可以與核心轉(zhuǎn)錄復(fù)合物作用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄［1］。以往的研究［2］多集中在Msx2對顱骨、乳腺等組織發(fā)育的影響上，Doheny眼科研究所LIU等［3］首次發(fā)現(xiàn)Msx2是晶狀體發(fā)育調(diào)控因子，過表達(dá)或缺失均引起晶狀體發(fā)育異常、視網(wǎng)膜和視神經(jīng)發(fā)育不全、小眼球畸形。研究［4］發(fā)現(xiàn)，Msx2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠中，Msx2過表達(dá)可抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，抑制發(fā)育的視泡背側(cè)視網(wǎng)膜骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4）表達(dá)，上調(diào)BMP7表達(dá)；在小鼠晶狀體上皮細(xì)胞中，Msx2抑制細(xì)胞增殖和分化，觸發(fā)凋亡［5］。Msx2傳統(tǒng)基因敲除小鼠中，E10.5晶狀體組織FoxE3mRNA表達(dá)下調(diào)，Sox2蛋白在晶狀體中表達(dá)正常，但視網(wǎng)膜組織中其表達(dá)下降，Pax6蛋白及Six3蛋白表達(dá)正常。

本研究擬應(yīng)用Cre?LoxP系統(tǒng)建立Msx2條件性基因敲除小鼠模型，需要2種轉(zhuǎn)基因動物，一種是在靶向敲除基因組序列中引入LoxP序列的Msx2轉(zhuǎn)基因小鼠［6］，另一種是通過Pax6啟動子驅(qū)動的Cre轉(zhuǎn)基因小鼠。在獲得全身性攜帶Msx2條件性等位基因小鼠后，與Le?Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配，并對子代通過基因型鑒定及Lac?Z染色進(jìn)行驗(yàn)證，為后續(xù)表型研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

親代Msx2flox/flox小鼠（C57BL背景），Msx2flox/ flox ROSA26 Le?Cre小鼠和Le?Cre小鼠，均由美國南加州大學(xué)Yi?Hsin LIU教授贈予。動物飼養(yǎng)于恒溫恒濕SPF級房間，喂以標(biāo)準(zhǔn)飼料。

1.2小鼠的飼養(yǎng)和繁殖

將親代Msx2flox/flox小鼠（C57BL/6背景）與Msx2flox/flox ROSA26 Le?Cre小鼠雜交，獲得基因型Msx2flox/floxROSA26 Cre（+/-）（敲除型Msx2cko）小鼠和Msx2flox/floxROSA26 Cre（-/-）（野生型Msx2wt）小鼠。以觀察到母鼠體內(nèi)陰道栓為受孕第1天標(biāo)志計數(shù)胚胎時間，選擇胚胎發(fā)育E10.5和E14.5的小鼠胚胎待用。在整個模型小鼠繁殖過程中，雄性和雌性小鼠以1∶4的比例合籠交配。實(shí)驗(yàn)均采用同籠出生的野生型小鼠和基因敲除小鼠。

1.3小鼠子代基因型鑒定

根據(jù)打靶載體構(gòu)建時Flox區(qū)域設(shè)計的位置，利用PCR方法擴(kuò)增野生型和敲除型基因片段，并根據(jù)基因片段長度或產(chǎn)物的有無判斷小鼠的基因型。

1.3.1DNA提取及PCR鑒定基因型：取小鼠尾尖約0.5 cm，置于1.5 mL Eppendorf管中，每管加入鼠尾裂解緩沖液100 μL，55℃恒溫箱孵育過夜。震蕩組織并混勻，85℃加熱1 h，獲取小鼠基因組DNA，保存于4℃待用。

PCR反應(yīng)引物由南加州大學(xué)合成，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系：總計25 μL，其中Q反應(yīng)液5 μL，PCR緩沖液2.5 μL，dNTP 0.5 μL，Taq酶0.125 μL，引物各1 μL，DNA模板1 μL，H2O 13.875 μL。 PCR擴(kuò)增條件：94℃4 min；94℃1 min，56℃1 min，72℃1min，35個循環(huán)；72℃10 min；4℃保溫。

1.3.2Cre基因型鑒定：取E11?E14.5胚鼠的胎膜組織，獲取胚鼠基因組DNA方法同1.3.1，保存于4℃待用。PCR反應(yīng)引物，由南加州大學(xué)合成，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件同1.3.1。Cre（+）PCR片段大小為380 bp。

表1　Msx2cko基因表型檢測所需PCR引物Tab.1　PCR primers for Msx2 gene genotyping

1.4LacZ全胚染色

E10.5和E14.5小鼠胚胎標(biāo)本取材，4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗（5 min×3次）。X?gal染色液37℃黑暗中孵育過夜，待見到組織出現(xiàn)藍(lán)染，即可終止染色。胚胎保存在4℃70%乙醇中。

1.5HE染色

將出生后1 d（P1）小鼠眼球組織切片在二甲苯中脫蠟，梯度乙醇水化后，經(jīng)蒸餾水轉(zhuǎn)入染液。蘇木精染液染色10 min，伊紅染液染色10 min。乙醇脫水，二甲苯透明，封片后光學(xué)顯微鏡下觀察，并照相。

2　結(jié)果

2.1Msx2條件性基因敲除小鼠及轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型鑒定

PCR基因型分析：用Msx2引物a和b進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增fl等位基因條帶和野生型條帶。如圖1所示，Msx2野生型大小條帶347 bp，Msx2條件性等位基因條帶大小為381 bp。左一和左五泳道上方條帶代表fl等位基因，下方條帶代表野生條帶，提示該小鼠基因型為Msx2fl/+；左二泳道可見1條381 bp的電泳條帶，代表基因型為Msx2fl/fl；左三、左四泳道可見1條347 bp的電泳條帶，代表基因型為Msx2+/+；左六為空白對照。Cre PCR片段大小380 bp，右一、右三為Cre+，右二、右四為Cre-。

2.2Le?Cre；R26R雙轉(zhuǎn)基因胚鼠LacZ染色

圖1　鼠尾基因組DNA及Cre重組酶的PCR鑒定結(jié)果Fig.1　PCR results for the genotyping of mouse tail DNA exaction

E10.5胚鼠晶狀體泡可分辨，出現(xiàn)特異性藍(lán)染，眼周外胚葉也因Cre重組酶的表達(dá)出現(xiàn)藍(lán)染，此時已可辨認(rèn)視網(wǎng)膜色素層，但未見染色（圖2A、2B）；E14.5胚鼠LacZ染色顯示晶狀體、角膜、結(jié)膜、眼瞼及眼周至鼻皮膚的特異性藍(lán)染（圖2D），而對照小鼠無任何染色（圖2C）。提示Le?Cre重組酶特異性表達(dá)在發(fā)育中的小鼠胚胎形成晶狀體板的表面外胚葉特定區(qū)域。

圖2　LacZ染色檢測Le?Cre重組酶活性Fig.2　LacZ staining of mouse embryos

2.3Msx2條件基因敲除小鼠初步眼表型分析

比較Msx2cko出生后21 d（P21）小鼠（圖3A）與Msx2wt小鼠（圖3B）的眼球，可觀察到顯著區(qū)別。Msx2cko P21小鼠眼窩凹陷，眼瞼及瞼裂縮小，無睫毛，眼瞼周圍及眼角到鼻側(cè)的線性脫毛。P1組織學(xué)切片HE染色可見，與Msx2wt小鼠（圖3D）相比，Msx2cko小鼠（圖3C）晶狀體體積減小，纖維細(xì)胞核分布異常，晶狀體纖維細(xì)胞有空泡形成，角膜與晶狀體前部上皮細(xì)胞明顯粘連，晶狀體莖形成（圖3C黑箭頭所示）。

圖3　Msx2cko及Msx2wt小鼠P21眼球外觀及P1晶狀體組織切片HE染色Fig.3　Phenotype of P21 mice and HE staining of P1 mice

3　討論

小鼠Msx基因家族有3個成員：Msx1、Msx2和Msx3。Msx3只在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，Msx1和Msx2多表達(dá)在間充質(zhì)細(xì)胞與上皮細(xì)胞的交界處和存在細(xì)胞增殖的區(qū)域。在Msx1對心臟發(fā)育作用的研究［7］中，國外學(xué)者認(rèn)為Msx1通過引起上皮細(xì)胞提前分化而使細(xì)胞失去增殖的能力，而Msx2的作用與Msx1的作用相似。傳統(tǒng)基因敲除小鼠模型顯示，Msx1-/-小鼠表現(xiàn)為顱骨和牙齒發(fā)育缺陷，并在生后由于腭裂致死［8］。Msx2-/-小鼠可成活，表現(xiàn)為外胚葉的缺陷，如牙齒發(fā)育不良、脫毛、乳腺及小腦發(fā)育不良，頭蓋骨骨化異常［9］。Msx1-/-；Msx2-/-小鼠在胚胎E14.5即死亡［10］。

傳統(tǒng)基因敲除動物模型中，某些對生命活動至關(guān)重要的基因被完全敲除后，小鼠會出現(xiàn)胚胎致死或生后不久即死亡的現(xiàn)象，而條件性基因敲除技術(shù)是在Cre?LoxP系統(tǒng)介導(dǎo)下的1種位點(diǎn)特異性重組技術(shù)，使得對小鼠基因組的修飾處在時空可調(diào)控狀態(tài)。本研究利用Cre/LoxP系統(tǒng)成功構(gòu)建了Msx2條件基因敲除小鼠模型，通過Pax6第一啟動子驅(qū)動Cre重組酶在眼外胚葉衍生組織——晶狀體、角膜、結(jié)膜、眼瞼表皮及淚腺組織特異性表達(dá)，從而選擇性刪除這些組織細(xì)胞中的Msx2基因，研究Msx2基因?qū)@些眼組織發(fā)育的影響。通過對小鼠基因型的分析，明確了小鼠或胚鼠是否攜帶Msx2條件性等位基因和Cre重組酶基因，并通過LacZ染色對Cre重組酶的表達(dá)進(jìn)行檢測。LacZ染色結(jié)果顯示了Cre重組酶與眼部組織的時空表達(dá)，同時也確定了其表達(dá)的組織特異性。

本研究成功建立了Msx2條件性基因敲除小鼠模型，為研究Msx2基因的功能和分子調(diào)控機(jī)制提供了可靠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀１狙芯堪l(fā)現(xiàn)Msx2基因敲除后，P21小鼠表現(xiàn)為眼窩凹陷，眼瞼及瞼裂縮小，無睫毛，眼瞼周圍及眼角到鼻側(cè)的線性脫毛；P1小鼠晶狀體體積減小，纖維細(xì)胞核分布異常，晶狀體纖維細(xì)胞有空泡形成，角膜與晶狀體前部上皮細(xì)胞殘留粘連，晶狀體莖形成，可能是與晶狀體莖凋亡不足相關(guān)［11］。但Msx2基因在轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的具體作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

［1］SUN X，PARK CB，DENG W，et al.Uterine inactivation of muscle?segment homeobox（Msx）genes alters epithelial cell junction pro?teins duringembryo implantation［J］.FASEB J，2016，30（4）：1425-1435.DOI：10.1096/fj.15?282798.

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［4］ZHAO J，KAWAI K，WANG H，et al.Loss of Msx2 function down?regulates the FoxE3 expression and results in anterior segment dys?genesis resembling Peters anomaly［J］.Am J Pathol，2012，180（6）：2230-2239.DOI：10.1016/j.ajpath.2012.02.017.

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［8］YANG G，YUAN G，YE W，et al.An atypical canonical bone mor?phogeneticprotein（BMP）signaling pathway regulates Msh homeo?box 1（Msx1）expression duringodontogenesis［J］.J Biol Chem，2014，289（45）：31492-31502.DOI：10.1074/jbc.M114.600064.

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（編輯王又冬）

Establishment of Msx2 Conditional Knockout Mice Model and Preliminary Study on the Phenotypes

YU Ziyan1，WANG Chunxia1，SUN Qi1，ZHAO Jiangyue1，2，ZHANG Jinsong1
（1.Department of Ophthalmology，The Forth Affiliated Hospital，The Eye Hospital，China Medical University，Lens Science Research Key Laboratory of Liaoning Province，Shenyang 110005，China；2.Department of Ophthalmology，The Second Affiliated Hospital，Zhejiang University，Hangzhou 310009，China）

ObjectiveTo establish a Msx2 conditional knockout mousemodel and preliminary explore the phenotypes.MethodsThe knockout plan was designed and the Msx2cko homozygous mice with complete knockout ofMsx2and wild type control mice were obtained.Genotype type of mice and E10.5?E14.4 embryos were determined by PCR.The expression of Le?Cre from whole mount LacZ staining was visualized.Preliminary phenotype of Msx2cko mice were stained by hematoxylin?eosinand observed.ResultsThe mouse model of Msx2 knockout was determined through genotyping forMsx2andCre.LacZ staining showed Le?Cre recombinase was expressed in the specified ectoderm for lens placode forma?tion.TheMsx2conditional deletion causes adult eyes（P21）to be microphthalmia with missing fur and whiskers around the eye and snout.Hema?toxylin?eosin staining showed small lens size and persistence of the lens stalk.ConclusionThe mouse model of conditional knockout ofMsx2is established successfully.The lack of Msx2 in mutant mice results in the abnormality of lens formation and microphthalmia.

lens；conditional knockout；mice；Msx2

Q954.48

A

0258-4646（2016）11-0964-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.11.002

國家自然科學(xué)基金（81371003）；中國博士后科學(xué)基金（2015m570517）；沈陽市科學(xué)技術(shù)計劃（F13?318?1?09）

于紫燕（1981-），女，主治醫(yī)師，博士.

趙江月，E-mail：zhaojiangyue@hotmail.com

2016-04-27

網(wǎng)絡(luò)出版時間：