針對小鼠Chmp1b基因的可誘導(dǎo)shRNA表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建及功能鑒定

蔡瑩，劉柳，連博文，陳澄

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院發(fā)育細(xì)胞生物學(xué)教研室，教育部醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衛(wèi)生部細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110122）

針對小鼠Chmp1b基因的可誘導(dǎo)shRNA表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建及功能鑒定

蔡瑩，劉柳，連博文，陳澄

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院發(fā)育細(xì)胞生物學(xué)教研室，教育部醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衛(wèi)生部細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110122）

目的設(shè)計(jì)構(gòu)建針對小鼠Chmp1b基因的可誘導(dǎo)shRNA表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體，以用于制備相關(guān)轉(zhuǎn)基因小鼠，并在體外驗(yàn)證其有效性。方法剔除pcDNA3.1載體的CMV啟動(dòng)子以及多克隆位點(diǎn)，然后接入帶有LacZ?fLoxP插入失活的小鼠U6啟動(dòng)子并引入適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)，裝入設(shè)計(jì)好的shRNA片段，測試shRNA抑制Chmp1b表達(dá)的效率與專一性，檢查Cre重組酶介導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組去除LoxP位點(diǎn)之間的lac基因后U6啟動(dòng)子活性恢復(fù)情況。結(jié)果設(shè)計(jì)的shRNA片段可明顯降低Chmp1b的表達(dá)，抑制效率達(dá)90%以上；成功構(gòu)建針對小鼠Chmp1b基因的可誘導(dǎo)shRNA表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體，插入U(xiǎn)6啟動(dòng)子中的LacZ?fLoxP片段既可以控制U6啟動(dòng)子活性又可以起到報(bào)告基因的作用。結(jié)論針對小鼠Chmp1b基因的可誘導(dǎo)shRNA表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體可以用于制備相關(guān)轉(zhuǎn)基因小鼠。

shRNA；Chmp1b；Cre/LoxP；轉(zhuǎn)基因載體，構(gòu)建

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RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)提供了一種高效的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控方法，可以特異性降解靶基因mRNA［1］。利用這一原理設(shè)計(jì)的小發(fā)卡狀RNA分子（shRNA）可以在培養(yǎng)細(xì)胞以及模式生物中抑制特定的靶基因表達(dá)，抑制效率可以達(dá)到90%以上，接近基因敲除水平，也被稱為基因敲減［2?3］。RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子（U6或H1啟動(dòng)子）常被用于細(xì)胞或模式生物體內(nèi)啟動(dòng)shRNA的表達(dá)［4］。

Chmp1b（charged multivesicular body protein 1b）又稱染色質(zhì)修飾蛋白，是ESCRT?Ⅲ（endosormal sorting complex required for transportⅢ）的相關(guān)組成成分之一［5］。真核生物中Chmp1b和ESCRT家族其他成員一起參與多泡體（MVBs）的形成、泛素化標(biāo)記的膜蛋白分選、胞質(zhì)分裂等重要細(xì)胞生命活動(dòng)［6］。從小鼠基因組中敲除ESCRT家族成員多導(dǎo)致小鼠胚胎期死亡，影響后續(xù)功能基因組學(xué)研究［7］。因此誘導(dǎo)條件性基因敲除或敲減是研究ESCRT家族基因功能的必要手段。

相對其他轉(zhuǎn)錄后調(diào)控手段，shRNA技術(shù)因?qū)Ｒ恍院谩⒉僮鞅憬莩蔀楣δ芑蚪M學(xué)研究的有力工具。為了實(shí)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)條件性表達(dá)shRNA，本研究參照文獻(xiàn)［8］改造了常用的pcD?NA3.1質(zhì)粒，選擇lacZ作為報(bào)告基因，將帶有LoxP側(cè)翼序列的LacZ片段（floxed?LacZ）插入小鼠U6啟動(dòng)子，使U6啟動(dòng)子處于失活狀態(tài)，不能啟動(dòng)shRNA表達(dá)。利用Cre重組酶介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組，將插入小鼠U6啟動(dòng)子中位于2個(gè)LoxP位點(diǎn)間的LacZ表達(dá)框切除，恢復(fù)U6啟動(dòng)子活性，實(shí)現(xiàn)針對靶基因shRNA的組織特異性誘導(dǎo)表達(dá)，降低靶基因轉(zhuǎn)錄，為功能基因組學(xué)研究提供有力工具。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器

pcDNA3.1真核表達(dá)載體、Lipofectamine 2000及相關(guān)試劑均購于Invitrogen公司；MLE12細(xì)胞、限制性內(nèi)切酶及其他工具酶等購自大連寶生物公司；β?tubulin抗體（Abmart公司）、EGFP抗體（天根公司）；HRP耦聯(lián)的抗兔、鼠二抗（中杉金橋公司），1640培養(yǎng)基（Gibco公司）、FBS（Hyclone公司），凝膠成像系統(tǒng)及相關(guān)軟件為上海天能公司提供；其余為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2shRNA表達(dá)載體以及其他研究用載體的構(gòu)建

本研究所用shRNA表達(dá)載體改造步驟簡述如下：利用分子克隆技術(shù)，自pcDNA3.1載體中去除BglⅡ和BamhⅠ酶切位點(diǎn)間原有的CMV啟動(dòng)子和多克隆位點(diǎn)，去掉pcDNA3.1載體中ApaⅠ酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增小鼠U6啟動(dòng)子序列通過EcoRⅠ酶切位點(diǎn)裝入新載體中，在U6啟動(dòng)子下游引入新的ApaⅠ、XhoⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)用于后續(xù)裝入合成的shRNA，該載體命名為pcsh1。在pcsh1載體的U6啟動(dòng)子中剔除-82 bp至-129 bp序列，引入BglⅡ和EcoRⅤ酶切位點(diǎn)，裝入含有Sv40 Ori和TK?PolyA的LacZ?fLoxP序列，該載體命名為pcsh41，是可誘導(dǎo)shR?NA表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體，將用于制備相關(guān)轉(zhuǎn)基因小鼠。

參照文獻(xiàn)［9］設(shè)計(jì)了針對小鼠Chmp1bcDNA序列（NM_024190.2）的shRNA序列，核心序列為：5′?GGACAAATTCGAACACCAG?3′；用作實(shí)驗(yàn)對照的scrambleshRNA核心序列為：5′?GTAGATGGTCGAC CTTCAC?3′。委托上海生工合成由核心序列-莖環(huán)序列-核心序列反向互補(bǔ)序列相應(yīng)酶切位點(diǎn)組成的寡核苷酸片段及其互補(bǔ)序列，退火，并通過ApaⅠ/HindⅢ位點(diǎn)裝入pcsh1中構(gòu)建pcshsic（表達(dá)scramble shR?NA），pcshcmb7（表達(dá)針對小鼠Chmp1b的shRNA）和將針對Chmp1b的shRNA裝入pcsh41載體，構(gòu)建成pcsh41cmb7質(zhì)粒。pcsh41cmb7質(zhì)粒在Cre存在的條件下切除floxed?LacZ片段，恢復(fù)U6啟動(dòng)子活性，表達(dá)針對Chmp1b的shRNA。

參照Cre序列設(shè)計(jì)引物將相應(yīng)的全長cDNA克隆到pcDNA3.1mychis載體上，表達(dá)相應(yīng)的帶有my?chis標(biāo)簽的蛋白，質(zhì)粒命名為pcCre。將psingle質(zhì)粒（Clonetech，Cat#630933）的EcoRⅠ和XbaⅠ間序列剔除，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增EGFP和Chmp1b全長cDNA，裝入其中使之表達(dá)EGFP?Chmp1b融合蛋白，命名為psgCMB01。使用同樣的策略構(gòu)建表達(dá)EGFP?Chmp1a融合蛋白的質(zhì)粒psgCMA01。

1.3質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染及shRNA功能分析

將MLE12細(xì)胞以85%匯集度接種到24孔板中，參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑手冊，將200 ng的psgCMB01質(zhì)粒分別與600 ng的pcshsic和600 ng的pcshcmb7混合，加入Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染。48 h后檢查EGFP熒光，確認(rèn)針對小鼠Chmp1b的shRNA有效性。利用同樣的策略，將pc?shcmb7質(zhì)粒與pcCMB和pcCMA，按1∶2的比例混合共轉(zhuǎn)染MLE12細(xì)胞，以pcshsic質(zhì)粒為對照，Western blotting檢查設(shè)計(jì)的shRNA抑制Chmp1b表達(dá)的效率和專一性。

1.4體外Cre介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組測試

將pcCre質(zhì)粒用SalⅠ酶切，回收帶有Cre表達(dá)框的片段，取0.5 μg，按操作手冊要求加入20 μL的TNT?Quick Master Mix（Promega，Cat#L1170），1 μL 0.1mol/L的Met，加ddH2O至總體積25 μL，37℃孵育70 min，加入0.1 μg的pcsh41cmb7質(zhì)粒，繼續(xù)孵育20 min，取適量反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)化E.coli.DH5α，涂Ampr平板，選單克隆過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，EcoRⅠ酶切鑒定，對選中克隆測序。將得到的正確重組質(zhì)粒命名為pcshkdcmb7，參照上一步共轉(zhuǎn)染的方法測試pcshkdcmb7抑制Chmp1b表達(dá)的能力和專一性。

1.5LacZ細(xì)胞化學(xué)染色

將MLE12細(xì)胞以85%匯集度接種到24孔板中，參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑手冊，用pc?sh41cmb7質(zhì)粒和pcshkdcmb7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MLE12細(xì)胞，經(jīng)戊二醛-多聚甲醛固定，Triton X?100通透，用X?gal染液［0.1 mol/L PBS緩沖液（pH7.3）、5 mmol/L鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6）、5 mmol/L亞鐵氰化鉀（K4Fe（CN）6·3H2O）、1 mg/mL X?gal］染色，觀察。

2　結(jié)果

2.1誘導(dǎo)表達(dá)shRNA的pcsh41cmb7質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)及鑒定

經(jīng)過復(fù)雜的克隆步驟，本研究得到了可誘導(dǎo)表達(dá)針對Chmp1b的shRNA的pcsh41cmb7質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定無誤。帶有LoxP側(cè)翼序列長約3.6×103的 LacZ表達(dá)框（floxed?LacZ）插入小鼠U6啟動(dòng)子的近端核心序列和遠(yuǎn)端核心序列之間，使U6啟動(dòng)子處于失活狀態(tài)，無法表達(dá)shRNA分子。如果存在位點(diǎn)特異性重組酶Cre，位于U6啟動(dòng)子中兩個(gè)通向LoxP位點(diǎn)之間的LacZ表達(dá)框被切除，同時(shí)保留1個(gè)LoxP位點(diǎn)，U6啟動(dòng)子恢復(fù)正常的長度（315 bp），該啟動(dòng)子命名為U6?kd。見圖1。

圖1　pcsh41cmb7質(zhì)粒結(jié)構(gòu)及鑒定圖Fig.1　Structure and identification map of pcsh41cmb7 plasmid

2.2針對Chmp1b的shRNA可以高效抑制Chmp1b的表達(dá)

本研究用pcshcmb7和pcshsic分別與表達(dá)EGFP?Chmp1b融合蛋白的psgCMB01質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MLE12細(xì)胞。從EGFP?Chmp1b融合蛋白免疫印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到1泳道的pcshcmb7和psgCMB01共轉(zhuǎn)染后EGFP?Chmp1b融合蛋白表達(dá)量比2泳道的pcsh?sic和psgCMB01共轉(zhuǎn)染組降低（圖2 A、2B），定量分析顯示降低約90%（圖2C）。將表達(dá)靶基因和報(bào)告基因融合蛋白的載體與表達(dá)針對該靶基因shRNA的載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞測定shRNA的抑制效率是目前比較常用的做法。針對Chmp1b的shRNA可以高效識別EGFP?Chmp1b融合蛋白的mRNA中的Chmp1b靶序列，使之被切割降解。

2.3插入的LacZ可使U6啟動(dòng)子失活并具備報(bào)告基因功能

MLE12細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcsh41cmb7質(zhì)粒并經(jīng)LacZ染色顯示有大量藍(lán)色細(xì)胞出現(xiàn)（圖3A），說明插入到U6啟動(dòng)子中的LacZ基因具有活性，具有報(bào)告基因的功能。MLE12細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pcsh41cmb7和psgC?MB01質(zhì)粒后檢查發(fā)現(xiàn)有大量帶有GFP熒光的細(xì)胞（圖3B），說明插入LacZ報(bào)告基因后U6啟動(dòng)子失去活性，EGFP?Chmp1b融合蛋白表達(dá)未被抑制。

2.4通過Cre引發(fā)的位點(diǎn)特異性重組恢復(fù)了U6啟動(dòng)子的活性

圖2　免疫印跡檢測針對Chmp1b的shRNA抑制效率Fig.2　The inhibitory effect of shRNA on Chmp1b was detected by Western blotting

圖3　報(bào)告基因功能顯示 ×10Fig.3　Display of the report gene function×10

TNT系統(tǒng)產(chǎn)生的Cre能夠介導(dǎo)pcsh41cmb7質(zhì)粒發(fā)生位點(diǎn)特異性重組，用EcoRⅠ酶切鑒定所得重組質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)：1，3泳道為正確重組質(zhì)粒（圖4），酶切片段長386 bp，該片段結(jié)構(gòu)如圖1D中所示，為U6?kd啟動(dòng)子以及其相鄰的shRNA，長386 bp，其他為錯(cuò)誤重組體。經(jīng)測序分析確認(rèn)無誤，將其命名為pcshkd?cmb7。

本研究發(fā)現(xiàn)pcshkdcmb7質(zhì)粒與psgCMB01共轉(zhuǎn)染的MLE12細(xì)胞，與pcshsic與psgCMB01共轉(zhuǎn)染的MLE12細(xì)胞相比，帶有EGFP熒光表達(dá)EGFP?Chmp1b融合蛋白的細(xì)胞明顯減少（圖5A、5B），這說明U6?kd啟動(dòng)子恢復(fù)了U6啟動(dòng)子的活性，由其啟動(dòng)表達(dá)的shRNA能引發(fā)針對EGFP?Chmp1b融合蛋白mRNA的高效切割降解。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pcshkdc?mb7質(zhì)粒與psgCMA01共轉(zhuǎn)染的MLE12細(xì)胞也可以看到大量帶有EGFP熒光，表達(dá)EGFP?chmp1a融合蛋白的細(xì)胞（圖5C），這說明pcshkdcmb7中針對Chmp1b的shRNA序列不能識別同一基因家族的Chmp1a的mRNA序列，具有抑制Chmp1b表達(dá)的專一性。

圖4　正確重組載體酶切電泳圖Fig.4　Correct recombinant vector enzyme electrophoresis

3　討論

圖5　pcshkdcmb7抑制Chmp1b表達(dá)的能力 ×10Fig.5　The ability of pcshkdcmb7 to inhibit the expression of Chmp1b×10

目前可以采用3種策略實(shí)現(xiàn)可誘導(dǎo)條件性表達(dá)shRNA：（1）使用Cre/LoxP系統(tǒng)，通過控制在U6啟動(dòng)子中插入DNA片段與否調(diào)控啟動(dòng)子活性［10］；（2）使用Cre/LoxP系統(tǒng)通過控制在shRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)插入DNA片段與否控制shRNA結(jié)構(gòu)完整性調(diào)控其活性［11］；（3）通過改造U6/H1啟動(dòng)子，引入四環(huán)素調(diào)控元件，達(dá)到在小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)shRNA抑制特定的靶基因表達(dá)目的［12?13］。其中第2種策略在Cre介導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組后殘留的LoxP位點(diǎn)可能會影響shRNA的抑制效率和專一性；第3種策略雖然可以實(shí)現(xiàn)可誘導(dǎo)shRNA表達(dá)，但難以實(shí)現(xiàn)組織特異性shRNA表達(dá)；而現(xiàn)有的第1種策略可以實(shí)現(xiàn)可誘導(dǎo)組織特異性shRNA表達(dá)，但是因?yàn)闆]有使用報(bào)告基因，不方便追蹤小鼠體內(nèi)發(fā)生位點(diǎn)特異性重組表達(dá)shRNA的細(xì)胞。本研究借鑒了第1種策略思路，將floxed?LacZ插入U(xiǎn)6啟動(dòng)子中，即能控制U6啟動(dòng)子活性，又可以作為報(bào)告基因評估轉(zhuǎn)基因動(dòng)物靶組織中的shRNA表達(dá)的范圍。凡是LacZ染色陽性的細(xì)胞都是不能表達(dá)shRNA的未發(fā)生基因敲減的細(xì)胞。這為評估可誘導(dǎo)條件敲減轉(zhuǎn)基因鼠靶組織基因敲減范圍，追蹤相應(yīng)細(xì)胞的增殖分化情況提供了便捷的手段。

為了在體外驗(yàn)證pcsh41cmb7在Cre介導(dǎo)下可否正確重組并恢復(fù)U6啟動(dòng)子的活性，本研究利用體外翻譯表達(dá)系統(tǒng)合成了Cre，加入pcsh41cmb7后得到了pcshkdcmb7質(zhì)粒，經(jīng)測序、以及共轉(zhuǎn)染功能檢測確認(rèn)其正確重組且恢復(fù)了U6啟動(dòng)子活性，能夠表達(dá)shRNA抑制包含有Chmp1b序列的融合蛋白的表達(dá)。在體外測試時(shí)也得到了許多錯(cuò)誤重組的質(zhì)粒，這是由于體外實(shí)驗(yàn)存在大量的pcsh41cmb7質(zhì)粒，Cre介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組不僅發(fā)生在同一個(gè)質(zhì)粒的2個(gè)LoxP位點(diǎn)之間，也有可能發(fā)生在不同質(zhì)粒的LoxP位點(diǎn)之間，因此產(chǎn)生了錯(cuò)誤重組質(zhì)粒。但是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中用該質(zhì)粒制被轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后，通過有計(jì)劃地繁殖育種，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因組中可以控制只存在1組pcsh41cmb7插入，此時(shí)Cre介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組被限制在1個(gè)經(jīng)過改造的U6啟動(dòng)子的2個(gè)LoxP位點(diǎn)之間，只產(chǎn)生恢復(fù)U6啟動(dòng)子活性的正確重組體，不會出現(xiàn)體外實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的錯(cuò)誤重組體。如果用pcsh41cmb7質(zhì)粒制備的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其體細(xì)胞能顯示出報(bào)告基因LacZ活性。這些體細(xì)胞不表達(dá)shRNA，未發(fā)生基因敲減。而一旦引入Cre，將引發(fā)位點(diǎn)特異性重組，切除LacZ，表達(dá)針對Chmp1b的shRNA。

綜上所述，本研究體外測試的結(jié)果證明了可誘導(dǎo)條件敲減質(zhì)粒pcsh41cmb7可以產(chǎn)生正確且有活性的pcshkdcmb7質(zhì)粒。將pcsh41cmb7用于后續(xù)體內(nèi)試驗(yàn)是可行的。構(gòu)建的可誘導(dǎo)條件敲減系統(tǒng)將為快速構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，進(jìn)行功能基因組學(xué)研究提供新的更有效的技術(shù)手段。

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（編輯武玉欣）

Construction and Functional Identification of Transgenic Vector Expressing shRNA for MiceChmp1b

CAI Ying，LIU Liu，LIAN Bowen，CHEN Cheng
（Department of Development Cell Biology，College of Basic Medical Science，China Medical University，The Ministry of Education Key Laboratory of Medical Cell Bi?ology，The Ministry of Public Health of China Key Laboratory of Cell Biology，Shenyang 110122，China）

ObjectiveTo design and construct a shRNA gene expression vector targetingChmp1bgene mouse，which can be used to prepare transgenic mice，and to verify its effectiveness in vitro.MethodsThe pcDNA3.1 vector CMV promoter and multiple cloning sites were first elimi?nated，thenLacZ?fLoxPinsertion inactivation of mouse U6 promoter and the appropriate restriction sites and shRNA fragments were introduced into the design.The efficiency and specificity of shRNA for inhibiting Chmp1b expression was tested，the Cre recombinase mediated by site?specific re?combination LoxP site between lac gene removal was determined，as well as the U6 promoter activity recovery.ResultsExpression of shRNA fragments could significantly reduce Chmp1b expression with an inhibition efficiency above 90%.An inducible shRNA expression transgenic vec?tor for mouseChmp1bwas successfully constructed，and insertion of U6 start of fragments LacZ?fLoxP can control U6 promoter activity.Conclu?sion The constructed shRNA expression vector can be used to prepare transgenic mice.

shRNA；Chmp1b；Cre/LoxP；transgenic vector；construction

Q28

B

0258-4646（2016）11-0968-05

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.11.003

國家自然科學(xué)基金（31271231，30600211）

蔡瑩（1987-），女，助理實(shí)驗(yàn)師，博士研究生.

陳澄，E-mail：chencheng@mail.cmu.edu.cn

2016-03-03

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