人源細粒棘球蚴喙鉤形態學參數分析

張爾夫,王 斯,杜 峰,安春麗

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人源細粒棘球蚴喙鉤形態學參數分析

張爾夫1,2,王 斯1,杜 峰1,安春麗1

目的 測定本地區人源細粒棘球蚴喙鉤的形態學參數，為棘球蚴的分類及流行病學研究提供依據。方法 以外科手術的方法從患者肝臟分離肝包蟲，取囊液等內容物離心沉淀制成涂片標本，光學顯微鏡下觀察，根據形態確定棘球蚴原頭蚴的喙鉤，應用計算機圖像分析系統采集喙鉤總長、總寬、柄長、刀長4個形態學參數數據，用統計學軟件進行統計分析。結果 棘球蚴的原頭節上具有上下兩層喙鉤，上層為大鉤，下層為小鉤。分別采集到游離狀態的大鉤56個，小鉤49個，測量并獲得了兩種喙鉤的4個形態學參數：大鉤的總長、總寬、柄長、刀長的平均值分別為12.38 μm、4.58 μm、5.51 μm和6.51 μm；小鉤的總長、總寬、柄長、刀長的平均值分別為10.41 μm、3.76 μm、5.04 μm和4.72 μm。大鉤和小鉤的各項形態學參數比較結果具有統計學意義(P<0.05)。結論 本研究應用計算機圖像分析系統獲得本地區人源細粒棘球蚴喙鉤的形態學參數，為棘球蚴的分類鑒定及流行病學研究提供了可靠的形態學資料。

細粒棘球蚴；人源；喙鉤；形態學；計算機圖像分析系統

由細粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)幼蟲引起的棘球蚴病(Hydatid disease)，又稱囊型包蟲病(cyctic echinococcosis, CE)，或簡稱為包蟲病，是一種危害極大的人畜共患寄生蟲病。包蟲病呈全球性分布，主要流行于地中海地區，俄羅斯，中亞，中國，澳大利亞，南美洲，北美洲和非洲東部亞洲。我國也是棘球蚴病流行比較嚴重的國家之一，目前有27個省(市)自治區有本病的分布[1]，其中甘肅、寧夏、青海、新疆、內蒙、西藏及四川西部等地區流行更為嚴重[2]。國家已將棘球蚴病列為《國家中長期動物疫病防治規劃》(2012-2020年),并將其列入國家免費救治的重大傳染病之一[3]。

細粒棘球絳蟲的幼蟲，即棘球蚴，宿主廣泛，可寄生于羊、牛、馬、驢、騾、駱駝及豬等多種動物及人體內,不同地區、不同宿主源和不同寄生部位的棘球蚴存在形態、大小及致病性等方面的差異。雖然伴隨著分子生物學技術的發展，對細粒棘球絳蟲的認識已經上升到了基因水平，但是對該蟲的形態學觀察與鑒定依然是診斷該病的一種簡單、快速、經濟、可靠的常用手段，也在蟲種鑒定、分類及流行病學分析等方面起到了不可或缺的作用。Gholamreza等[4]認為，對來自不同中間宿主和終宿主體內的幼蟲和成蟲進行形態學特征的測量是一種確實可行的分型方法。還有一些學者[5-6]指出，細粒棘球絳蟲的喙鉤在從中間宿主轉移到終宿主的過程中其形態特征將保持不變，可以通過測量該蟲喙鉤的形態學特征參數來追蹤終宿主的感染源。

國外已有對細粒棘球蚴喙鉤形態學研究的相關報道，國內僅有對動物體內細粒棘球幼喙鉤測量數據的報道[7]，尚未見對人體內細粒棘球蚴喙鉤形態特征參數的報道。本文應用計算機圖像分析系統(computer image analysis system, CIAS)對從我國遼寧西部一例人體分離的細粒棘球蚴喙鉤形態特征進行研究分析，獲得我國人源棘球蚴原頭節喙鉤的形態資料，對比國外資料進行分析，期望為棘球蚴的分類學、流行病學以及防治策略等方面的研究提供形態學參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 樣本來自遼寧西部1例女性肝包蟲病患者，通過外科手術從其肝臟切除完整囊包，用生理鹽水沖洗后收集其囊內容物，加入75%的酒精，置4 ℃保存待用。取囊液及其囊內容物1 000 r/min 5 min 離心2次后取沉淀，制成涂片標本置光學顯微鏡(OLYMPUS BX53，日本)觀察。

1.2 測量方法 經顯微鏡放大400×觀察，可見喙鉤在原頭蚴內的排列情況(圖1)以及原頭蚴頂突外翻后喙鉤的排列情況(圖2)，原頭蚴的喙鉤分為上下兩排，依據國外學者[8-10]對大、小喙鉤的鑒定標準，區分和測量本例標本的喙鉤，并依據這些特征定義大鉤與小鉤(圖3)。通過計算機圖像分析軟件(OLYMPUS cellSens)對所選取形態規整的喙鉤進行測量，其中大鉤56個、小鉤49個為測量對象，測量參數包括喙鉤的長徑長度(總長total length, TL)、短徑垂直長度(總寬total width, TW)、喙鉤頭到鉤衛的長度(柄長handl length, HL)及鉤衛到喙鉤尾的長度(刀長blade length, BL)(圖4)。

1.3 統計方法 應用軟件Excel 2003及GraphPad Prism 5.0對所測得的參數數據進行整理、統計學分析，P<0.05具有統計學意義。

圖1 原頭蚴體內喙鉤(箭頭所指)Fig.1 Hooks in protoscoleces (arrow)

圖2 原頭蚴頂突外翻后的喙鉤(箭頭所指)Fig.2 Hooks of evaginated protoscolex(arrow)

圖3 大鉤(右)與小鉤(左)Fig.3 Large hook (right) and small hook (left)

2 結 果

2.1 測量結果 分別測量了56個大鉤和49個小鉤的總長、總寬、柄長、刀長4個形態參數的數據，得到大鉤的總長、總寬、柄長、刀長平均值分別為12.38 μm(11.04～13.77 μm)、4.58 μm(3.75～5.77 μm)、5.51 μm(3.83～6.92 μm)、6.51 μm(5.30～8.57 μm)，小鉤的總長、總寬、柄長、刀長平均值分別為10.41 μm(7.88～11.81 μm)、3.76 μm(3.08～4.93 μm)、5.04 μm(2.68～6.83 μm)、4.72 μm(3.23～5.81 μm)，其它形態學參數統計指標數據見表1。

2.2 統計結果 應用軟件GraphPad Prism 5.0采用Unpaired t test進行統計學分析，結果大鉤與小鉤的總長、總寬、柄長、刀長差異都具有統計學意義，其中總長、總寬、刀長的差異極具有統計學意義(P<0.000 1)(圖5)，同時又對大鉤的總長分別與總寬(r=0.328 9)、柄長(r=0.497 3)、刀長(r=0.312 4)及小鉤的總長與總寬(r=0.488 2)、柄長(r=0.577 3)、刀長(r=0.625 9)的相關性做了統計分析，結果顯示具有相關性，有統計學意義(P<0.005)(圖6)；而分別對大鉤的柄長和刀長及小鉤的柄長和刀長做相關性分析，沒有得出相關性結論，無統計學意義。

黑色箭頭分別指示出喙鉤的頭、衛、尾3個位置，黃色線段表示總長、白色線段表示總寬、紅色線段表示柄長、藍色線段表示刀長The arrows indicate respectively handle, guard, blade; the yellow line indicates TL; the white line indicates TW; the red indicates HL; the blue line indicates BL.圖4 喙鉤及測量參數標示圖Fig.4 Pictorial view of rostellar Hook and parameters

表1 喙鉤形態學參數統計指標數據(μm)
Tab.1 Morphological parameters of rostellar hooks (μm)

大鉤(n=56)Largehook(n=56)小鉤(n=49)Smallhook(n=49)總長Totallength總寬Totalwidth柄長Handlelength刀長Bladelength總長Totallength總寬Totalwidth柄長Handlelength刀長Bladelength平均值Average12.384.585.516.5110.413.765.044.72最大值Maximum13.775.776.928.5711.814.936.835.81最小值Minimum11.043.753.835.307.883.082.683.23標準差Standarddeviation0.680.450.630.670.890.410.870.65變異系數CV0.060.100.110.100.090.110.170.14

2.3 本例測定的結果與文獻報道的數據對比 將本例測定的大鉤和小鉤的長度與文獻報道的數據進行比較，結果如表2所示，本例測量結果與國外學者Yildiz[11]報道的土耳其羊源和牛源棘球蚴測量的大鉤與小鉤長度結果較相近，與Layla[12]報道的利比亞的羊源和駱駝源、Ahmadi[13]報道的伊朗人源和羊源及Ponce[14]報道的西班牙人源和羊源棘球蚴的大鉤和小鉤長度差異較大；與國內王虎[7]報道的青海細粒棘球蚴藏羊株和牦牛株的喙鉤長度具有差異，與王光雷[15]及趙玲玲[16]報道的新疆和黑龍江地區的棘球絳蟲成蟲頭節頂突上的大鉤與小鉤長度存在顯著差異。

*** High significant difference P<0.000 1, **Slight significant difference P<0.001 9.圖5 大鉤與小鉤的形態學參數統計學意義標示圖Fig.5 Statistical figure of morphological parameters between large hooks and small hooks

A: TH and TW of large hooks (r=0.328 9); B: TH and TW of small hooks (r=0.488 2); C: TH and BL of large hooks (r=0.312 4);D: TH and BL of small hooks(r=0.625 9); E: TH and HL of large hooks (r=0.497 3); F: TH and HL of small hooks (r=0.577 3).

圖6 大鉤小鉤的各形態學參數之間相關性分析圖

Fig.6 Correlation analysis diagram of morphological parameters between large hooks and small hooks

表2 本研究測量及文獻報道的大鉤與小鉤的長度
Tab.2 The length of large and small rostellar hooks from this study and literature references

文獻/作者/宿主/蟲期/地區Reference/Author/Host/Stage/Region大鉤(μm)Largehook(μm)小鉤(μm)Smallhook(μm)[7]/王虎/藏羊株/棘球蚴/中國青海24.8±1.620.6±1.3牦牛株/棘球蚴/中國青海23.64±1.519.15±1.7藏羊株/成蟲/中國青海28.88±2.0422.95±2.84牦牛株/成蟲/中國青海29.65±1.9521.33±2.55[11]/Yildiz/牛/棘球蚴/土耳其11～147～9羊/棘球蚴/土耳其9～156～12[12]/Layla/駱駝/棘球蚴/利比亞30.2923.69羊/棘球蚴/利比亞21.5816.29[13]/Ahmadi/人/棘球蚴/伊朗22.217.5/羊/棘球蚴/伊朗23.619.4[14]/Ponce/人/棘球蚴/西班牙21.9～23.919.3～20.3/羊/棘球蚴/西班牙23.7～25.420.7～22.4[15]/王光雷/家犬/成蟲/中國新疆3628[16]/趙玲玲/家犬/成蟲/中國黑龍江40～4530～38[N]/本研究/人/棘球蚴/中國遼寧11.04～13.777.88～11.81

3 討 論

細粒棘球絳蟲需要兩個哺乳動物宿主才能完成生活史，一是終宿主：犬、狼、狐等食肉動物；二是中間宿主羊、牛、駱駝等偶蹄類，人也可作為細粒棘球絳蟲的中間宿主。在一定的地理條件下，終末宿主和中間宿主間形成了較為固定的動物間循環關系鏈：森林型(北極型)，分布于較寒冷地帶，以狼、犬和鹿之類的野生動物循環為特點；畜牧型，呈世界分布，以狼和偶蹄類家畜之間循環為特點。我國主要有綿羊/犬與牦牛/犬型動物循環鏈，其分布較廣[17]。人體的感染是因誤食細粒棘球絳蟲的蟲卵所致。蟲卵經口進入人體，在十二指腸孵化出六鉤蚴，六鉤蚴侵入腸粘膜隨血流到達肝臟，約經3 w左右發育為棘球蚴。細粒棘球蚴在發育過程中會形成上下兩排喙鉤，數量20～60個[18]。由于喙鉤的形態學特征的變化依賴于原頭蚴在其中發育的中間宿主的種類，通常情況下，幼蟲的喙鉤特征在成蟲期明顯保留，在不同的終宿主體內并無改變，喙鉤的形態大小在不同的中間宿主傳遞過程中也基本保持不變，故可根據自然感染的終宿主體內寄生蟲的喙鉤特征，確定其從何種中間宿主獲得感染，這對細粒棘球絳蟲傳播途徑的確認提供了有力的判定依據[6]。

Rogan[8]、Antoniou[9]及Almeida[10]等研究闡明了鑒別大鉤和小鉤的基本方法。他們指出，棘球蚴原頭節的上、下兩排喙鉤形態大小存在差異，上排的喙鉤較大稱為大鉤，下排的喙鉤較小稱為小鉤。兩者在形態上區別為：大鉤比小鉤長徑更長，整體略彎、形態更尖，相對小鉤沒有那么粗壯。另外，大鉤有比較瘦窄的鉤衛而小鉤的鉤衛則比較圓潤和粗大，大鉤柄突出部分表面光滑而小鉤則有鋸齒形邊。本研究依據上述特征描述定義了所研究的大鉤與小鉤，通過計算機圖像分析軟件對所選取形態典型的喙鉤進行了測量，獲得了我國遼西地區人源細粒棘球幼喙鉤形態參數。這些參數會對我國流行的棘球蚴病的形態學研究以及其流行病學調查與診治提供參考依據。

Yildiz[11]及Ahmadi[13]等學者認為可以依據喙鉤數量和喙鉤的長度兩個主要的特征參數來區別種屬；Ponce[14]等學者認為大鉤和小鉤的總長是最合適的形態特征用來種屬鑒定； Harandi[19]等研究指出喙鉤的總長和刀長在種型鑒定上有一定意義；Harandi[20]近期的研究顯示大鉤和小鉤的總長在G1和G6型間有差別；Layla[12]認為大鉤的特征在鑒定種屬上更具有特異性。檢驗和驗證這些差異，可為區分棘球蚴的種類及種屬朔源提供依據。本研究將本例測定的參數與國外學者報道的數據進行了對比，結果如表2所示，本例測得數據與Yildiz[11]報道的土耳其羊源和牛源棘球蚴測量的大鉤與小鉤數據結果較相近，與Layla[12]報道的利比亞的羊源和駱駝源、Ahmadi[13]報道的伊朗人源和羊源及Ponce[14]報道的西班牙人源和羊源棘球蚴的大鉤和小鉤長度差異較大；與國內王虎[7]報道的青海藏羊株和牦牛株棘球蚴喙鉤長度具有差異，與王光雷[15]及趙玲玲[16]報道的細粒棘球絳蟲成蟲的大鉤與小鉤的長度也存在顯著差異。表明來自不同地區、不同宿主的喙鉤形態學參數確實存在明顯差異，而這些差異的原因是否與前人[5-7,13,19]所述與該蟲的基因型、寄生的中間宿主類型以及流行地區環境等不同有關，尚有待于進一步研究。

此外，本研究表明，采用CIAS對棘球蚴喙鉤進行形態學觀察測量，不失為檢測棘球蚴或其他微小寄生蟲的一種實用而方便的好方法。

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Morphological parameters of the protoscoleces hooks ofEchinococcusgranulosusderived from the human body

ZHANG Er-fu1,2, WANG Si1, DU Feng1, AN Chun-li1

(1.DepartmentofPathogenicBiology,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,China;2.AnshanDiseasePreventionandControlCenter,Anshan114002,China)

To analyze the morphological parameters of protoscoleces hooks ofEchinococcusgranulosusderived from the human body and to provide the basis for the classification and epidemiology ofE.granulosus, hydatid cysts were isolated from liver of patient, and protoscoleces and the hooks were observed by light microscope. The parameters of the protoscoleces and the hooks were collected and measured using the computer image analysis system (CIAS). All of defined criteria data were calculated and analyzed statistically by the GraphPad Prism 5.0. Totally, 105 rostellar hooks were collected and measured, including 56 large hooks and 49 small one. The mean value of TL, TW, HL, BL of large hook respectively was 12.38 μm, 4.58 μm, 5.51 μm and 6.51 μm; the mean value of TL, TW, HL, BL of small hook respectively was 10.41 μm, 3.76 μm, 5.04 μm and 4.72 μm. These findings appeared that there was a significant statistical difference between the large and small hooklets (P<0.05). The morphological parameters of the hooklets of theEchinococcusgranulosusin local source and derived from the human were identified. The data is useful to classification and epidemiological studies onEchinococcusgranulosus.

Echinococcusgranulosus; derived from the human body; protoscoleces hook; morphology; computer image analysis system

An Chun-li, Email:cmucl@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.001

國家自然科學基金(No.81370189)

安春麗，Email：cmucl@126.com

1.中國醫科大學基礎醫學院病原生物教研室，沈陽 110122；

2.鞍山市疾病預防控制中心，鞍山 114002

R383.3

A

1002-2694(2016)10-0855-06

2016-06-06；

2016-08-21

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81370189)