梅州地區(qū)小兒感染肺炎支原體生物群分布與耐藥性差異研究

肖光文，李舟文，張國雄，徐美蘭，喬亞峰，曾令斌

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梅州地區(qū)小兒感染肺炎支原體生物群分布與耐藥性差異研究

肖光文1，李舟文1，張國雄2，徐美蘭1，喬亞峰1，曾令斌1

目的 了解梅州地區(qū)兒童肺炎支原體流行株的基因分型及不同型別間對大環(huán)內酯類藥物的耐藥性差異。方法對2015年1月到2015年12月期間865例小兒肺炎患兒進行咽拭子肺炎支原體培養(yǎng)，并檢測對紅霉素、羅紅霉素、阿奇霉索、乙酰螺旋霉素、克林霉素和克拉霉素6種藥物的敏感性。采用基于MpP1基因的巢式多重PCR方法進行Mp基因亞型的監(jiān)測并分析不同基因型對大環(huán)內酯類藥物的耐藥性差異。結果 對肺炎支原體培養(yǎng)的結果表明，Mp培養(yǎng)陽性數為289例，總陽性率為33.41%。其中P1-I型為246例，占85.12%，P1-II型為43例，占14.88%。196例出現大環(huán)內酯類抗菌藥物耐藥的Mp陽性標本中，P1-I型為191例，占P1-I型的77.64%；P1-II型僅5例，占P1-II型的11.63%。P1-I型的耐藥率明顯高于P1-II型(χ2=73.09，P<0.01)。結論Mp仍是梅州地區(qū)兒童肺炎的主要病原體之一，其流行基因型以P1-I型為主，同時也存在P1-II型菌株；在控制Mp的感染方面應重視耐藥菌株的克隆傳播。

肺炎支原體；兒童；基因型；耐藥性差異

Supported by the Guangdong Medical Scientific Research Funds (No. B2015036) and the Meizhou City Science and Technology Plan Projects (No. 2015B041)

肺炎支原體 (Mycoplsmapneumoniae，Mp)是引起成人和兒童支氣管肺炎，間質性肺炎的常見病原體之一。隨著對Mp感染的認識的加強，其檢測技術、分型及耐藥等方面的研究迅速在國內外開展。Mp感染過程中，主要通過黏附蛋白-P1基因編碼的P1蛋白完成對宿主細胞的粘附與定植。目前對Mp的分型主要是基于P1基因序列通過巢氏多重PCR法建立的分型體系[1]，將肺炎支原體分為1型、2型菌株和Variant 2型。檢測P1基因分型可以明確Mp暴發(fā)流行情況，同時明確耐藥Mp菌株之間是否存在克隆傳播的可能性，為預防和干預梅州地區(qū)小兒肺炎支原體肺炎( Mycoplasma Pneumonia Pneumonia，MPP)的發(fā)生及臨床治療提供理論指導。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2015 年 1 月到 2015 年 12月，本市3家綜合醫(yī)院兒科門診及住院部治療的符合《社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南》 診斷標準的小兒肺炎患兒 865例，其中，男 453例，女 412例；支氣管肺炎 642 例，大葉性或節(jié)段性肺炎110 例，支氣管炎 79 例，毛細支氣管炎 24 例。病程為3～15 d。

1.2 主要儀器與試劑 離心機為美國 Beckman公司產品，基因擴增儀、電泳儀為美國Biorad公司產品，凝膠成像系統(tǒng)為法國VL公司產品，細菌基 因組 DNA 提取試劑盒為北京康為世紀公司產品，快速培養(yǎng)及藥敏試劑盒為陜西百盛園公司產品。MpP1-I型標準株 M129 和 P1-II型標準株Mp-FH 均由由美國 Type Culture Collection 公司提供。

1.3 培養(yǎng)及藥敏試驗Mp采用快速鑒定培養(yǎng)法，其其檢測原理為Mp利用培養(yǎng)基內快速生長因子進行增殖，在分解糖類過程中產生的氫離子使培養(yǎng)基的 pH值降低而使酚紅指示劑由紅色變成淡黃色，培養(yǎng)基由紅變黃并液體澄清為有Mp生長。同時利用藥敏孔中抗菌藥物的高低濃度在體外對微生物的抑制作用，對Mp作耐藥性分析。藥敏結果判讀:兩孔均呈紅色為敏感；低濃度孔呈黃色、 高濃度孔呈紅色為中介；兩孔均呈黃色為耐藥。咽拭子標本統(tǒng)一入院次日早晨采集并立即送檢。操作步驟如下：1)取1支分裝干粉培養(yǎng)基，在無菌條件下打開蓋子，加入1.5 mL超純水，完全溶解至澄清后，在藥敏板陰性孔中加入50 μL培養(yǎng)液。2)將棉拭子置于培養(yǎng)瓶內，攪動數次，提取棉拭子并對著瓶壁盡量擠壓出其中液體，取出棉拭子棄之，用加樣器吹打數次后分別吸取50 μL 加入各藥敏板孔中。3)在每個板孔中滴加1滴石蠟油封口后，將瓶中剩余培養(yǎng)基棄去，藥敏板置于 37 ℃電熱培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。4)取出觀察結果并統(tǒng)計陽性標本及陽性標本紅霉素、羅紅霉素、阿奇霉索、乙酰螺旋霉素、克林霉素、和克拉霉素6種藥物的藥敏結果。

1.4Mp-DNA提取和用巢式PCR分型 根據DNA提取試劑盒說明提取陽性培養(yǎng)物中的Mp-DNA。根據MpP1基因多態(tài)性，參照Kenri等[2]方法運用對P1基因上RepMp4和RepMp2/3兩個可變區(qū)域設計合成引物，引物位置見圖1，各組引物序列參照李東等[3]相關報道，引物Invitrogen公司合成。利用引物ADH2F/ ADH2R、 ADH3F/ ADH3R、ADH3/ Mp2/3-R1、Mp2/3-R2/ Mp2/3-F2對陽性培養(yǎng)物的Mp-DNA擴增。 PCR反應體系為10×loading緩沖液 5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L 上下游引物各 1 μL， DNA 3 μL，AmpliTaq(Amplitaq酶購自上海TaKaRa公司)0.3 μL，加入ddH2O直至反應體系達25 μL。反 應條件為：98 ℃，預變性2 min； 98℃變性15 s， 58℃退火15 s， 72℃延伸1 min， 30 個循環(huán)；72 ℃ 延伸 3 min。擴增產物稀釋 1 000 倍作為模板進行巢式PCR，RepMP4區(qū)域分型擴增所用引物為ADH4F、N1、2N2C，RepMp2/3 區(qū)域分型擴增所用引物為 Mp2/3-F3、R31、R32、R32V。PCR反應體系和條件同前。取12 μL PCR產物樣品中 加入1 μL 6×Loading緩沖液，用移液器反復吸取數次 后在2.5%瓊脂糖凝膠中電泳。用凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察并保存結果。

圖1 P1基因序列構成及相關引物Fig.1 Composition of P1 gene sequence and related primers

1.5 測序 在紫外自動成像儀下，用刀片割下含目的 DNA 片段的凝膠塊，放入 EP 管中-20 ℃保存，送上海生工進行測序。

1.6 統(tǒng)計學分析 數據采用 SPSS 20.0軟件進行分析，對于不同型別Mp耐藥性進行分析，采用χ2檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 2015年Mp的流行情況 865例CAP患兒咽拭子標本中，Mp培養(yǎng)陽性數為289例，總陽性率為33.41%。男性感染161例，感染率為35.54%；女性感染128例，感染率為31.07%。男性感染率略高于女性，對2組進行比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.94，P>0.05)。4個不同季節(jié)組Mp感染陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=35.58，P<0.05)。其中春(2～4月)夏(5～7月)感染率明顯高于秋(8～10月)冬(11～1月)季節(jié)。其中又以春季最高達到41.36%。

表1 2015梅州地區(qū)CAP患兒不同季節(jié)Mp的感染率
Tab.1 Infection-rates of Mp in different season groups in children with CAP in Meizhou area in 2015

Seasongroup(month)Mp+-TotalInfectionrate(%)2～413419032441.365～78116925032.408～103811315125.1611～13610414025.71Total28957686533.41

注：四個不同季節(jié)組間感染陽性率比較，χ2=17.65，P<0.05。

Note： The comparison of infection positive rate between four different seasons groups, χ2=17.65,P<0.05.

2.2 藥敏結果 有196份Mp陽性培養(yǎng)物對兒童常用的 6 種大環(huán)內酯類抗菌藥物紅霉素、羅紅霉素、阿奇霉索、乙酰螺旋霉素、克林霉素和克拉霉素的一種或幾種出現了耐藥，其針對6 種抗菌藥物的耐藥率分別為59.17%(171/289)、52.60%(152/289)、35.64%(103/289)、32.87%(95/289)、28.37%(82/289)和34.26%(99/289)。

2.3 巢式PCR分型結果 針對可變區(qū)域 RepMP4，用巢式PCR 方法對289例Mp陽性培養(yǎng)物及標準株 M129、Mp-FH進行擴增產生兩種特征性條帶。其中有243例臨床標本得到343 bp的基因片段， 與 M129標準株擴增到的基因片段相同， 即為 P1-I型； 40例臨床標本得到560 bp的基因片段，與MP-FH標準株擴增到的基因片段相同，即為P1-II型。(見圖2)針對可變區(qū)域RepMP2/3，Mp陽性培養(yǎng)物及標準株 M129、Mp-FH也產生兩種特征性條帶。其中有243例臨床標本得到394 bp的基因片段，與 M129標準株擴增到的基因片段相同， 即為 P1-I型； 40例臨床標本得到617 bp的基因片段，與MP-FH標準株擴增到的基因片段相同，即為 P1-II型。(見圖4)。另外6例沒有出現目標基因片段，可能為假陽性。最終確認289份Mp陽性中P1-I型為243例，占85.87%(243/283)，P1-II型為40例，占14.13%(40/283)。

1: standard strains Mp-FH; 2: P1-IIstrains; 3: standard strains M129; 4: P1-Istrains.圖2 Mp陽性培養(yǎng)物及標準株針對RepMP4的基因分型Fig.2 Mp positive cultures and standard strains of genotyping for RepMP4

1: standard strains M129; 2: P1-Istrains; 3: standard strains Mp-FH; 4: P1-IIstrains圖3 Mp陽性培養(yǎng)物及標準株針對RepMP2/3的基因分型Fig.3 Mp positive cultures and standard strains of genotyping for RepMP4

2.4 大環(huán)內酯類耐藥菌種與Mp基因型別的關系 196例出現大環(huán)內酯類抗菌藥物耐藥的Mp陽性標本中，P1-I型為187例，占P1-I型的76.95%(187/243)；P1-II型僅5例，占P1-II型的12.5%(5/40)；另外4例可能為假陽性。兩組比較，P1-I型的耐藥率明顯高于P1-II型(χ2=73.09，P<0.01)。

2.5 測序結果和同源性分析 分別隨機各選取2～4月間感染的10份對紅霉素耐藥和敏感的P1-I型以及全部5份對紅霉素耐藥的P1-II型和5份敏感的P1-II型陽性標本的測序結果遞交 GenBank 數據庫進行 BLAST 搜索，結果顯示前20份標本均屬于 MP P1-I型，后10份標本均為P1-II型；其中對紅霉素耐藥的10份P1-I型標本具有高度的同源性，互相間比較同源性介于99.6%～100%；而對紅霉素敏感的10份P1-I型標本雖然也有較高的同源性，卻只是介于97.2%～100%。后10份P1-II型標本，相互間同源性介于97.1%～100%，紅霉素耐藥株與敏感株間同源性無明顯差異。

3 討 論

近年來，Mp的感染呈遞增的趨勢，國內感染率在30%[4]左右，作者對2010-2014年梅州地區(qū)兒童Mp感染及耐藥情況進行回顧性分析[5]，表明總陽性率為35.11%，高于國內今年相關報道。從本研究繼續(xù)對該地區(qū)兒童Mp感染的情況分析，2015年度該地區(qū)兒童Mp感染率為33.41%，繼續(xù)保持了較高的感染率；男性和女性Mp感染率的差異仍無統(tǒng)計學意義；從季節(jié)來看，春夏感染率仍高于秋冬。其針對6 種抗菌藥物的耐藥率分別為59.17%(171/289)、52.60%(152/289)、35.64%(103/289)、32.87%(95/289)、28.37%(82/289)和34.26%(99/289)。與2010-2014年情況梅州地區(qū)耐藥情況比較，跟2014年[5]耐藥率相近。以上情況表明，2015年度該地區(qū)Mp流行特征沒有改變。

近年來,Mp的分型研究已經成為的流行趨勢[6]。對Mp全基因測序已經證實，在打的重復序列RepMp8內有個拷貝是RepMp2/3和RepMp4被證實位于P1操作子中，并且他們包含變異序列P1外源凝集素及粘附相關蛋白B/C。Mp大量重復元素在染色體上的蔓延使臨床分離株大量重復序列發(fā)生同源性重組成為可能，同時也使得Mp的基因分型變得較為困難。目前Mp的分型方法主要依賴于P1基因的RepMp2/3和RepMp4兩部分進行的多重巢式PCR、PCR-RFLP和基因測序等方法，以及不依賴于P1 基因的PFGE 和RAPD等方法。研究表明幾種方法對于相同菌株的分型結果基本一致[7]。基于P1基因的RepMp2/3和RepMp4兩部分的研究有助于我們掌握Mp的分型及不同菌株之間的同源性。本研究中我們采用了基于P1基因的RepMp2/3和RepMp4兩部分進行的多重巢式PCR法，結果顯示289份Mp陽性中P1-I型為246例(85.12%)，P1-II型為43例(14.88%)。表明在2015年期間該地區(qū)Mp的感染以P1-I型為主，與歐洲某些國家及我國大部分地區(qū)近幾年檢測的結果相似[3，8]。

Pl基因編碼的產物Pl蛋白是Mp的主要黏附素及毒力因子，同時作為一種重要的免疫原能刺激機體產生強烈的應答效應。就目前的研究表明，基于Pl基因的分型臨床分離菌株無論是P1-I型，P1-II型還是其他的變異新型株均有致病性[9]，型別的差異并沒有在Mp的致病性上體現出差異。但是有研究表明，不同基因型Mp對大環(huán)內酯類抗菌藥物耐藥之間存在重要的相關性[10]。本研究對大環(huán)內酯類耐藥菌株與Mp基因型別的關系進行了分析，研究結果表明P1-I型菌株對大環(huán)內酯類藥物的耐藥率顯著高于P1-II型。對Mp耐藥機制研究中，目前國內外的報道主要認為Mp對大環(huán)內酯類藥物的耐藥與其結合位點的基因突變有關，其中又以編碼23S rRNA V區(qū)和Ⅱ區(qū)的基因和編碼核糖體蛋白L4、L22的基因發(fā)生點突變密切相關，而不受Pl基因的點突變的影響。從基因測序的結果表明，選取的2～4月間感染的對紅霉素耐藥的10株P1-II型菌株具有高度的同源性(99.6%～100%)，這種同源性提示我們耐藥菌株間存在克隆傳播的可能。對紅霉素耐藥和不耐藥的P1-II型菌株互相間同源性(97.1%～100%)無明顯差異，可能與其為全年散發(fā)有關。因此，我們有理由相信，P1-I型菌株對大環(huán)內酯類藥物的耐藥率顯著高于P1-II型的原因與耐藥菌株間可能存在的克隆傳播密切相關。Kenri 等[2]、Pereyre 等[11]和 Martinez 等[12]都發(fā)現，Mp基因型別可以在P1-I型和P1-II型之間自然轉變交替流行的現象，其原因可能與人群免疫力有關，這種轉變的周期可能為8～10年。根據以上推測，當某地發(fā)生轉變而出現Mp的感染以P1-II型為主時，P1-II型耐藥菌株間也存在可能的克隆傳播，那么P1-II型對紅霉素的耐藥率也許不會像本研究一樣顯著低于P1-I型菌株了。

本研究的結果表明，Mp仍是梅州地區(qū)兒童肺炎的主要病原體之一，其流行基因型以P1-I型為主，同時也存在P1-II型菌株。P1-I型耐藥菌株的克隆傳播可能引起耐藥菌株的廣泛流行，我們應特別的重視。同時我們也應該密切監(jiān)測P1-II型耐藥菌株可能的克隆傳播并關注Mp基因型轉換進而出現新的流行亞型。

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Mycoplasmapneumoniaeserotypes distribution and drug resistance in Meizhou area, China

XIAO Guang-wen1, LI Zhou-wen1, ZHANG Guo-xiong2,XU Mei-lan1, QIAO Ya-feng1, ZENG Ling-bin1

(1.MedicalCollege,JiayingUniversity,Meizhou514031,China;2.ClinicalLaboratory,thePeople’sHospital,Meizhou514000,China)

In order to survey the genotype ofMycoplasmapneumonia(Mp) strains isolated from children withMpinfection and the drug resistance difference of genotypes to large ring lactone class of drugs in Meizhou area, a total of 865 throat swabs were collected from children with pneumonia in Meizhou area from January 2015 to December 2015. The swabs were cultured to detectMp. The drug sensitivity ofMpto erythromycin, roxithromycin, azithromycin, acetylspiramycin, clindamycin and clarithromycin was evaluated. The nested-multiplex PCR based on MP P1 gene was performed to detect the subtype ofMPgene, and the drug resistance difference of genotypes was researched to large ring lactone class of drugs. According to the result of the cultivation ofMp, 289 (33.41%) wereMp-positive, the infection rate of spring and summer was significantly higher than that of autumn and winter. The antimicrobial drug resistant rate for six kinds were 59.17% (171/289), 52.60% (152/289), 35.64% (103/289), 32.87% (95/289), 28.37% (82/289) and 34.26% (99/289) respectively. From the result of classification, the 243 cases of type (85.87%) were P1-I strains, 40 cases (14.13%) were P1-II strains of` these. Among 196 cases with large ring lactone class antibiotic drug resistance ofMppositive samples, 187cases were P1-I strains, accounting for 76.95% (187/243) of the entire P1-I; 5 cases were P1-II, accounting for only 12.5% (5/40) of the entire P1-II. The resistant rate of P1-I strains was significantly higher than P1-II strains (χ2=73.09,P<0.01). In conclusion,Mpis still one of the main pathogen of pneumonia in children in Meizhou area, its popular genotype is given priority to with P1-I, at the same time there is also P1-II, strains.

Mycoplasmapneumonia; child; genotype; drug resistance

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.010

1.嘉應學院醫(yī)學院，梅州 514031；

2.梅州市人民醫(yī)院，梅州 514000

R375

A

1002-2694(2016)10-0898-05

2016-05-27；

2016-08-29

廣東省醫(yī)學科學研究基金(No.B2015036)和梅州市科技計劃項目(No.2015B041)聯(lián)合資助

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