不同溶解氧間歇曝氣對亞硝酸鹽氧化菌的影響

包 鵬，王淑瑩，馬 斌，張 瓊，彭永臻 （北京工業大學，北京市水質科學與水環境恢復工程重點實驗室，北京污水脫氮除磷處理與過程控制工程技術研究中心，北京 100124）

不同溶解氧間歇曝氣對亞硝酸鹽氧化菌的影響

包 鵬，王淑瑩*，馬 斌，張 瓊，彭永臻 （北京工業大學，北京市水質科學與水環境恢復工程重點實驗室，北京污水脫氮除磷處理與過程控制工程技術研究中心，北京 100124）

為了解溶解氧對間歇曝氣模式下亞硝酸鹽氧化菌（NOB）種群結構的影響，在以城市污水為處理對象，以間歇曝氣方式運行的SBR反應器中，檢測兩種主要 NOB菌（Nitrospira、Nitrobacter）在低溶解氧運行時期（55d）和高溶解氧運行時期（113d）數量及結構的變化.結果表明，在低溶解氧運行時期Nitrospira的含量遠高于Nitrobacter的含量，與Candidatus Nitrospira defluvii相似性較高的菌種為Nitrospira的優勢菌種；而進入高溶解氧運行時期后，Nitrospira含量逐漸降低，相反 Nitrobacter含量逐漸升高成為主要 NOB菌群，并且其大多數菌種與Nitrobacter winogradskyi菌相似.另外，在低溶解氧運行轉變為高溶解氧運行階段出現了一定的亞硝酸積累，并在Nitrobacter成為優勢NOB菌群過程中逐漸消失.

溶解氧；亞硝酸鹽氧化菌；Nitrospira；Nitrobacter

亞硝酸鹽氧化菌（NOB）是生物法脫氮過程中硝化反應主要參與菌種之一［1-4］，其數量及種群結構也直接影響著污水處理工藝的硝化效果.然而在生物法污水處理工藝中，DO、pH值、溫度等工藝參數或特殊運行方式均可能對NOB的種群結構產生的影響.因此，探究各類工藝參數及運行方式對NOB種群結構的影響對生物法脫氮技術具有較大理論及實際意義的.近年來，間歇曝氣逐漸成為一種新型的運行方式應用于活性污泥法生物脫氮處理工藝中［5-8］.關于間歇曝氣的研究主要集中于處理效果及啟動短程硝化等方面，如：Li等［6］啟動的間隙曝氣反應器能夠穩定的處理高氨氮廢水；Yang等［5］運行的移動床生物膜反應器利用間隙曝氣模式成功實現了短程硝化反硝化的脫氮方式.然而，關于間隙曝氣模式中相關工藝參數（如溶解氧、pH值、間歇曝氣時間）對硝化微生物影響的研究較少，且大多集中于硝化菌在活性污泥中的相對含量上［5-7］.關于對硝化微生物菌群結構，尤其是NOB菌菌群結構變化的研究一直鮮有報道.研究表明，Nitrospira和Nitrobacter是污水生物處理系統中最為常見的NOB種類［2-3］.其中 Nitrospira屬于 Nitrospirae菌門并適合在低底物濃度條件下生長. Nitrobacter屬于α-Proteobcateria菌門且更適應高底物濃度.而溶解氧是NOB菌完成硝化作用的必要因素之一，同時也是間隙曝氣模式重要的工藝參數［2］.因此，本文以間歇曝氣城市污水SBR硝化反應器為對象，研究不同DO濃度對兩種主要NOB菌（Nitrospira、Nitrobacter）數量及種群結構變化的影響，進一步豐富間歇曝氣運行方式的基礎理論知識，為實際運行提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 試驗裝置與運行方式

試驗裝置SBR反應器容積為12L，有效容積10L，排水比為50%，污泥齡為30d.溫度控制在（25 ±1）℃左右，pH值為 7.1～7.8，機械攪拌器轉速為100r/min.每周期分為進水、曝氣攪拌、沉淀、排水、閑置5個階段，其中進水10min，曝氣攪拌時間由 DO值實時檢測系統控制（見 1.3），沉淀30min，排水10min，閑置10min.

1.2 試驗用水及接種污泥

由于進水中有機物會導致反應器中異養菌大量生長，進而降低硝化菌含量.為此將反應器進水設定為一個城市污水有機物去除反應器的出水，從而提高反應器中硝化菌比例，更有利于開展反應器硝化菌菌群變化方面的研究.其水質指標為：pH：7.2～7.8；NH4+-N：50.2～80.4mg/L；NO2－-N：0.12～5.43mg/L；NO3--N：0.04～1.24mg/L，COD：40～55mg/L，其中COD多為不可降解有機物.接種污泥取自處理某居民區生活污水的低 DO中試SBR反應器，中試SBR硝化效果良好.

1.3 試驗方案

反應器共運行165d，根據DO值不同可以分為2個階段：I階段為低DO運行階段（0～55d），反應器DO濃度控制在0.2～0.5mg/L左右.當硝化結束時DO值出現驟升現象，實時控制裝置在DO值到達 0.75mg/L時停止曝氣攪拌進入沉淀階段；II階段為高 DO運行階段（55～165d），反應器DO濃度控制在1.5～2.3mg/L左右.當硝化結束時DO值出現驟升現象，實時控制裝置在DO值到達3mg/L時停止曝氣攪拌進入沉淀階段.

1.4 檢測指標及分析方法

溫度，pH及DO值均采用WTW Multi-340i及相應檢測探頭（WTW 公司，德國）進行在線監測；進出水中NH4+-N，NO2－-N 及NO3

－-N 濃度由Quickchem?8500流動注射儀（Hach公司，美國）進行檢測；利用 Fast DNA Spin Kit for Soil（QBIOgen Inc.，Carlsba，CA，美國） DNA提取試劑盒提取反應器活性污泥樣品的總DNA.

表1 試驗所用引物及退火溫度Table 1 Primers list and annealing temperature

定量PCR采用SYBR-Green法，Nitrobacter和Nitrospira所用引物見表1.定量 PCR擴增的20μL體系配置如下：10μL SYBR?Premix Ex Taq? （Takara，Dalian，China）、 0.4μL ROX Reference Dye50，、0.2μL 前后引物、2μL 樣品DNA.反應條件為：預加熱96℃ 3min；隨后進行35周期擴增反應（變性95℃ 30s，退火條件見表1，延伸72℃，30s）.對階段I和II末的活性污泥樣品中Nitrobacter和Nitrospira進行PCR反應，所用引物見表1.將擴增產物與pGEM-T Easy （Progmega，Madison， WI， USA）載體進行連接后，轉化到BMJM109感受態細胞中，進行LB平板培養.經過藍白斑篩選后，隨機選取 100個陽性菌落進行PCR擴增鑒定，所用引物見表1.利用Hha I內切酶進行酶切分型，每種酶切類型選取至少 1個克隆菌株測序.所得序列應用NCBI-BLAST搜索相似序列，使用MEG4.1軟件以鄰接法構建進化樹.

1.5 批次試驗

批次試驗用于檢測低溶解氧末期反應器活性污泥氨氧化及亞硝酸氧化能力.試驗如下：在低溶解氧末期，分別向5個2.5L錐形瓶中接種反應器活性污泥，MLSS為2000mg/L.人工配水使混合液NH4+-N為40mg/L、NO2－-N為 20mg/L，并控制溫度24 ℃，pH值為7.2.5個錐形瓶DO濃度分別為 0.3、0.5、1.0、1.5、2.0mg/L.每隔 10min取樣一次，取樣6次.檢測NH4+-N、NO2－-N：及NO3

－-N含量，并根據結果計算氨氧化速率及亞硝酸氧化速率.

2 結果與討論

2.1 溶解氧對Nitrospira及Nitrobacter數量的影響

Nitrobacter和Nitrospira是活性污泥處理工藝中主要的NOB種類，許多研究以這兩種NOB種群來代表活性污泥中絕大多數NOB菌種［12-16］.因此，本研究利用定量PCR檢測間歇曝氣硝化反應器運行全周期過程中Nitrospira 和Nitrobacter含量的變化.如圖1所示，在整個運行周期過程中均能檢測到Nitrospira 和Nitrobacter的存在，但其相對含量隨著溶解氧濃度的變化而變化.在低溶解氧運行階段（DO：0.2～0.5mg/L），Nitrospira的拷貝數從 1.62×106copies/mL 增加至 3.52× 106copies/mL，而 Nitrobacter并沒有顯著增加，一直維持在 1.41×105～1.96×105copies/mL范圍. Nitrospira的拷貝數在低溶解氧階段高于Nitrobacter的拷貝數一個數量級，是此階段反應器 NOB的優勢菌種.其原因可能是某些Nitrospira能夠適應低底物濃度的環境，在溶解氧匱乏的情況下Nitrospira較Nitrobacter更易生長繁殖［17］.當反應器進入高溶解氧運行階段（DO：1.5～2.3mg/L）后，Nitrospira的拷貝數逐漸從3.52×106copies/mL下降至7.69×105copies/mL.相反地，Nitrobacter的拷貝數則顯著增加最終上升至 7.39×106copies/mL，從而取代 Nitrospira成為反應器在高溶解氧階段的優勢 NOB菌種.研究表明，Nitrobacte與Nitrospira不同，其更適應高濃度底物環境，如高亞硝濃度、高溶解氧濃度［17］.因此，Nitrobacter可能同樣能夠適應高溶解氧間歇曝氣的方式.

圖1 反應器中Nitrospira和Nitrobacter含量的變化Fig.1 Number of Nitrospira and Nitrobacter in the reactor

與本研究結果相似，Liu等［15］證實其長期低溶解氧持續曝氣的生物反應器中主要NOB菌種同樣為 Nitrospira，且隨著運行時間的增加Nitrospira含量不斷增長；Zhang等［13］也證實在一個實際連續流短程硝化污水處理系統中Nitrobacter的含量隨著溶解氧濃度的上升而增加.由此可見，在間歇曝氣反應器中 NOB受溶解氧的影響趨勢與已知的非間歇曝氣反應器中沒有較大的區別.

2.2 溶解氧對Nitrospira及Nitrobacter種群結構的影響

分別在低溶解氧階段末期和高溶解氧階段末期提取活性污泥進行克隆測序實驗.基于Nitrospira 16s基因建立的系統發育樹如圖2所示.在低溶解氧周期末的活性污泥樣品中，對 100個Nitrospira克隆子進行酶切分型可得到4個酶切類型（DL-1、DL-2、DL-3、DL-4）.從系統發育樹可以看出，屬于DL-1、DL-2和DL-3的克隆子與Candidatus Nitrospira defluvii有著較高的相似性，并且占總克隆子的94%.由于2.1結果顯示Nitrospira為間歇曝氣反應器低溶解氧階段主要的 NOB菌群，因此可以推測出在低溶解氧間歇曝氣模式下 NOB主要種群為 Candidatus Nitrospira defluvii菌屬.Candidatus Nitrospira defluvii是一種常見 Nitrospira菌屬，經常出現于低溶解氧環境下，如Park等［16］在其低溶解氧硝化反應器中發現 NOB的主要菌種為 Candidatus Nitrospira defluvii.

圖2 Nitrospira系統發育樹Fig.2 Phylogenetic trees constructed with the neighbor joining algorithm of Nitrospira sequences

圖3 Nitrobacter系統發育樹Fig.3 Phylogenetic trees constructed with the neighbor joining algorithm of Nitroacter sequences

而高溶解氧樣品中Nitrospira可得到3個酶切類型（DH-1、DH-2、DH-3），其中屬于DH-1的克隆子與仍與Candidatus Nitrospira defluvii有著較高的相似性，并且占總克隆子的84%.而與低溶解氧樣品不同的是，約有10%的克隆子（DH-2）相似于 Nitrospira.mosocoviensis菌屬，這是一類已被證實能夠在較高濃度溶解氧條件下生長的Nitrospira菌種［16］.由此可見，當間歇曝氣由低溶解氧轉化為高溶解氧運行110d后，Nitrospira種群結構仍然以Candidatus Nitrospira defluvii菌種為主，同時也出現了一定含量的偏好高溶解氧的Nitrospira菌種.

與Nitrospira不同，反應器中Nitrobacter的種群結構在低DO與高DO階段有著較大的區別.如圖 3所示，在低溶解運行階段反應器Nitrobacter含量較少時，對100個Nitrobacter克隆子進行酶切分型可得到5個酶切類型（DL-1、DL-2、DL-3、DL-4、DL-5）.其中DL-1、DL-2相似于uncultured Nitrobacter sp.Clone 6，占總克隆子的 82%；DL-3相似于 uncultured bacterium clone MBR447，占總克隆子的10%；DL-4、DL-5相似于uncultured Planctomycetes bacterium，占總克隆子的 8%.而轉變高溶解氧運行模式后，反應器中Nitrobacter含量增加，高溶解氧末期污泥樣品分型可得到 4個酶切類型（DH-1、DH-2、DH-3、DH-4）.其 98%的克隆子與 Nitrobacter winogradskyi具有較高的相似性，2%的克隆子與uncultured Planctomycetes bacterium相似.結合反應器在高溶解氧運行過程中 Nitrobacter的數量逐漸增加最終成為優勢NOB菌種（見2.1節）的現象，可見高溶解氧間歇曝氣的方式有利用Nitrobacter winogradskyi菌種的生長和富集.

綜上所述，在間歇曝氣的模式下，低溶解氧條件導致NOB的種群結構以Candidatus Nitrospira defluvii為主；而高溶解氧條件則導致NOB種群結構從 Candidatus Nitrospira defluvii轉變為Nitrobacter winogradskyi為主.

2.3 NOB結構變化與出水水質變化的關系

由圖4可見.反應器首先在低溶解氧條件下（0.2～0.5mg/L）運行了55d.進過4d的活性污泥馴化，反應器成功啟動了較好的硝化效果.在這個低溶解氧階段，進水中的NH+-N全部硝化為NO－

43-N，出水中幾乎沒有NO2－-N的存在，反應器處在全程硝化狀態.然而在反應器進入高溶解氧階段的第一天其出水便產生了 NO2－-N的積累（6.1mg/L）.并且NO2－-N積累現象逐漸增加，在運行了35d后出水NO2－-N積累率達到95%以上，反應器形成了明顯的短程硝化狀態.但是反應器的短程硝化效果并不穩定，在維持了60d左右后逐漸消失.反應器在高溶解氧階段末期重新回歸全程硝化狀態.

許多研究表明，低溶解氧或間歇曝氣的運行模式有利用于短程硝化的形成［6，18-19］，然而本研究中反應器在低溶解氧階段并沒有發生短程硝化現象.如圖5所示，批次試驗結果顯示：在低溶解氧階段末期，反應器活性污泥在低溶解氧濃度下（0.3，0.5mg/L），亞硝酸氧化速率高于氨氧化速率.這說明此時反應器活性污泥中NOB菌活性要高于AOB菌.而由2.1及2.2節分子實驗結果可知，在低溶解氧階段運行時期反應器中NOB主要以Nitrospira 中的Candidatus Nitrospira defluvii菌種為主.Candidatus Nitrospira defluvii具有與其他亞硝酸氧化菌不同的亞硝酸氧化還原酶（nitrite oxidoreductase，NXR），使其可以適應低底物濃度的環境，并且常出現于低溶解氧運行活性污泥反應器中［20］.因此，本研究中的反應器在低溶解氧運行時期具有較好的全程硝化效果可能是由于大量Candidatus Nitrospira defluvii菌的存在所導致的.

圖4 反應器進出水水質變化Fig.4 Influent and effluent nitrogen concentration in the reactor

然而批次試驗同時也表明，低溶解氧末期的活性污泥在高溶解氧條件下（1.0，1.5，2.0mg/L）亞硝酸氧化速率逐漸下降且均低于氨氧化速率，說明Candidatus Nitrospira defluvii菌活性被抑制.雖然具體的機理仍未明確，但推測可能是由于適應低溶解氧濃度的Candidatus Nitrospira defluvii菌種無法適應突然提高的溶解氧濃度，造成其亞硝化活性降低.而這種現象也導致了反應器從低溶解氧運行轉變為高溶解氧運行初期，出水中產生大量亞硝態氮的積累及短程硝化的形成.不過出水中充足的亞硝態氮及高溶解氧條件十分利于另一種NOB菌——Nitrobacter菌的生長繁殖.因此當偏好高底物濃度的 Nitrobacter菌數量逐漸增加，并在高溶解氧中后期慢慢取代Nitrospira成為反應器優勢 NOB菌種時，反應器中的短程硝化重新恢復為全程硝化.

圖5 低溶解氧末期不同溶解氧對活性污泥氨氧化及亞硝酸氧化速率的影響Fig.5 Effect of DO on ammonia oxidation and nitrite oxidation of activated sludge at the end of low-DO period

3 結論

3.1 在間歇曝氣硝化反應器中，低溶解氧有利于NOB菌中的Nitrospira的富集，而高溶解氧則有利于Nitrobacter的生長繁殖.

3.2 低溶解氧間歇曝氣模式下，Nitrospira菌主要為Candidatus Nitrospira defluvii類菌屬；高溶解氧間歇曝氣則會促使 Nitrobacter傾向于Nitrobacter winogradsky菌屬.

3.3 在溶解氧的轉變過程中短程硝化現象的發生及消失是由于反應器優勢 NOB菌從Nitrospira變為Nitrobacter而引起的.

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《中國環境科學》2011～2014年發表的論文中20篇入選“領跑者5000”提名論文

《中國環境科學》2011～2014年發表的論文中有20篇入選“精品期刊頂尖論文平臺——領跑者5000”提名論文.“領跑者5000（F5000）”平臺由中國科學技術信息研究所于2013年建設，旨在集中展示中國精品科技期刊上發表的最高端的學術研究成果，將與國際和國內重要檢索系統鏈接，擴大論文影響.該平臺將與湯森路透公司合作，擬利用WOK國際檢索系統平臺，與SCI數據庫在同一平臺內實現文獻鏈接和國際引文檢索，在更大范圍內向世界科技同行展示和推廣中國最重要的科研成果.提名論文均為 2011～2014年在學科領域內被引率排名居前的論文.本次環境學科共有65篇文章入選“領跑者5000”提名論文.

Effect of dissolve oxygen on the microbial community of the nitrite-oxidizing bacteria in an intermittent aeration reactor.

BAO Peng， WANG Shu-ying*， MA Bin， ZHANG Qiong， PENG Yong-zhen （Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environment Recovery Engineering， Engineering Research Center of Beijing， Beijing University of Technology， Beijing 100124， China）. China Environmental Science， 2016，36（9）：2696～2702

Nitrospira and Nitrobacter are two dominant types of nitrite-oxidizing bacteria （NOB）.To evaluate the effect of dissolved oxygen （DO） on microbial community of NOB under the intermittent-aeration mode， the population and microbial community of this two NOB types were investigated in an aeration reactor with low DO period （55d） and high DO period （113d）. Results showed the population of Nitrospira was much higher than that of Nitrobacter during the low DO period （0.2～0.5mg/L）， and most clones of Nitrospira was very similar to the clone Candidatus Nitrospira defluvii. After increasing DO to a high level （1.5～2.3mg/L） and operating for 113d， Nitrobacter turned to the dominant group. Most clones of Nitrobacter were distributed to the branch containin Nitrobacter winogradskyi. Furthermore， the nitrite accumulation occurred in this reactor during the shift of population between Nitrospira and Nitrobacter after increasing DO， and it gradually disappeared when Nitrobacter became the dominant NOB group.

dissolved oxygen；nitrite-oxidizing bacteria；Nitrospira；Nitrobacter

X703

A

1000-6923（2016）09-2696-07

2016-02-25

國家自然科學基金（51578014）

* 責任作者， 教授， wsy@bjut.edu.cn

包 鵬（1985-），男，黑龍江哈爾濱人，北京工業大學環能學院博士研究生，主要從事生活污水脫氮除磷方面的研究.