利用文蛤生物標志物評價尾水-海水混合體系污染水平

林怡辰，孟范平，萬 茹，杜永祥，王曰杰，崔鴻武 （中國海洋大學海洋環境與生態教育部重點實驗室，山東 青島 266100）

利用文蛤生物標志物評價尾水-海水混合體系污染水平

林怡辰，孟范平*，萬 茹，杜永祥，王曰杰，崔鴻武 （中國海洋大學海洋環境與生態教育部重點實驗室，山東 青島 266100）

采用不同濃度（體積比0%～40%，經天然海水稀釋而成）的市政污水處理廠（MSTP）尾水對文蛤（Meretrix meretrix）連續培養9d，通過測定9種生化因子水平評價污染暴露對雙殼類的生物學效應包括：內臟中的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽（GSH）、乙酰膽堿酯酶（AChE）、金屬硫蛋白（MTs）、硫代巴比妥酸反應物（TBARs）以及血細胞的溶酶體膜穩定性（LMS）.SOD、CAT除外的所有生化因子均能對尾水污染產生敏感響應，其中，GPx、MTs、AChE和LMS的響應與尾水濃度呈顯著相關（P＜0.05或P＜0.01），適于作為尾水污染的生物標志物；依據這些生物標志物計算的綜合生物標志物響應指數值（IBRv2=0.61～2.65）隨尾水濃度上升而增大，且兩者間存在顯著相關性（P＜0.01）.研究結果表明，基于生物標志物響應值計算IBR指數的方法適于MSTPs尾水-海水混合體系的綜合污染評價.

尾水；市政污水處理廠；海水；綜合評價；雙殼類動物；生物標志物

近岸海域往往是市政污水處理廠（MSTPs）尾水的受納水體.由于進入MSTPs的生活污水和工業廢水中含有重金屬、表面活性劑、農藥、多環芳烴（PAHs）、多氯聯苯（PCBs）等眾多種類的化合物和內分泌干擾物，而現有的污水處理工藝難以將其有效去除［1-2］，因此這些化學物質大多隨著尾水外排進入海洋中.研究證明，某些異源物質在痕量水平時即能對水生生物產生急性或亞致死毒性效應［3］.針對此類含有復雜污染成分的混合體系，采用化學分析方法逐一監測出所有污染物幾乎是不可能的，因而無法滿足海水綜合質量評價的需要.海洋生物長期生存于一定范圍的海洋環境中，能夠在生物化學和細胞學水平上對化學污染物產生靈敏的響應.這些在亞致死劑量有毒化合物暴露下發生異常變化的分子學、細胞學指標統稱為生物標志物，它們在區域環境污染預警方面具有重要作用.

海洋環境（特別是尾水受納海域）中常常同時存在著幾十種甚至上百種污染物，而每種生物標志物能夠提供環境中一種或數種污染物質的有用信息，這意味著海洋環境質量綜合評價需要篩選一套適宜的生物標志物作為評價指標.近十多年來，法國、英國、德國、意大利等歐洲學者提出利用多種生物標志物的同步響應聯合指示海洋污染水平，并在對這些標志物響應信息進行綜合統計的基礎上，發展了多種綜合指數方法用于某些海域污染特征的綜合診斷，取得了良好應用效果，其中以綜合生物標志物響應（IBR）指數應用最為廣泛［4］.鑒于不同國家、城市的經濟發展水平存在差異，其MSTPs尾水中的污染成分種類也必然不同.只有根據一定區域尾水的性質和特征，篩選出針對性強的生物標志物組合，才能滿足納污海域的水質評價需要.

雙殼類動物在世界范圍內廣泛分布，對污染物具有高富集能力，還能以籠養方式移植到指定站位作為流動性生物監測工具，有利于全面監測排污區的污染程度［5］.文蛤是青島海域乃至我國北方近岸海域常見的優勢雙殼類動物，易馴養且生命力強，對污染物有較敏感響應.本研究在前期探討青島市李村河污水處理廠尾水對文蛤抗氧化酶影響［6］的基礎上，采用青島市另一家污水處理廠——團島 MSTPs的尾水（預先經清潔海水稀釋至不同體積比濃度）對文蛤進行暴露培養，目的是掌握更多有關雙殼類對MSTPs尾水的響應特征，同時篩選出響應敏感性強、線性好的生物標志物構成評價指標，并采用IBR指數進行尾水濃度的識別，以便為納污海域綜合污染評價提供有用工具.

1 材料與方法

1.1 材料

文蛤：購于水質清潔的青島市嶗山灣大管島養殖區，健康充滿活力且大小基本一致（平均殼長 40mm）.在室內采用清潔海水（取自青島市石老人海域，pH=7.90±0.02，鹽度32）馴養7d，每天更換新鮮的清潔海水，溫度、溶解氧（DO）分別控制為（15±1）℃和（6±0.5）mg/L，定時投加海水小球藻（Chlorella autotrophica），密度為 1.3×107cells/（L·d）.

尾水：取自青島市團島污水處理廠出水排放口，每6h采集1次，采樣持續24h.將采集好的4個尾水樣品等體積混合并于 4℃保存，當天使用.該污水處理廠的進水以生活污水為主，工業廢水僅為數量不多的食品工業廢水，氮磷含量相對較高，所以其廢水處理主要采用改良型A2/O（厭氧-缺氧-好氧活性污泥法）和MBBR（生物膜）相結合的復合式生物處理系統.

尾水與海水混合液：混合液中尾水濃度（即：尾水體積比，EVR）設置0%、1%、5%、10%、20%、30%、40%七個梯度，其中 0%濃度組為對照組.暴露培養前，首先向尾水中添加適量海水晶，調節鹽度為 32，再與天然清潔海水按一定比例混合，以消除各處理組中因尾水加入量不同造成的培養體系鹽度差異.

試劑：冰醋酸、NaH2PO4、Na2HPO4、EDTA-2Na、鄰苯二甲醛（OPT）、甲醇、苯甲基磺酰氟（PMSF）、二甲基亞楓（DMSO）、β-巰基乙醇、三羥甲基胺基甲烷（Tris）、四乙氧基丙烷、HCl、NaCl均為國產分析純.0.9%NaCl注射溶液、中性紅染料為國產生化試劑.多聚賴氨酸（MW150000～300000）、5，5-雙二硫代（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、碘化硫代乙酰膽堿（ATChI）、還原型谷胱甘肽（GSH）由 Sigma公司提供.1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）由Merk公司提供.海水晶為山東濰坊市海佳海水晶廠以純凈海水為原料生產.

1.2 文蛤暴露培養

暴露培養于2013年11月進行.將經過馴養的文蛤投放于21個10L玻璃缸中（每個尾水處理組設3個重復），每個玻璃缸投放30只，加入相應濃度的尾水-海水混合液，采用與馴養相同的條件連續培養9d.預實驗結果表明，暴露培養9d的文蛤生物標志物響應效果較好.為保證培養期間污染物濃度的相對穩定，每24h更換一次相應濃度的混合液.暴露期間未見文蛤死亡.暴露培養結束后，每個玻璃缸中隨機取出 15只個體，其中 2只抽取定量的血淋巴液，分別進行溶酶體膜穩定性（LMS）測定，以兩者的平均值表示該重復的測定結果；剩余個體在冰上解剖分離出內臟組織，切細混合均勻，于-80℃保存，用于另外 8種生化因子的分析.

1.3 生化因子測定方法

1.3.1 血細胞LMS 采用Lowe等［7］的中性紅保持時間（NRRT）法：用注射器在文蛤后閉殼肌部位抽取 0.5mL血淋巴液于預冷的硅烷化離心管中，加入 0.5mL 0.9%NaCl注射液，混勻，放置30min.吸取40μL混合液于多聚賴氨酸處理后的載玻片上，恒溫恒濕（15～16℃）放置 3min使細胞附著.倒掉載玻片上多余液體，加入 40μL中性紅染液，每隔 15min鏡檢一次，當觀察到視野中約30%的細胞因中性紅滲漏到細胞漿中而變紅時，改為每隔5min觀察一次，直至細胞變紅數量達到50%，即為NRRT（min）.NRRT出現在兩個相鄰鏡檢時刻之間時，采用內插法計算 50%細胞變紅時間并取整.

1.3.2 內臟生化因子 提取液制備：本研究所測內臟生化因子有8種，包括：GSH、硫代巴比妥酸活性物質（TBARs）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽還原酶（GR）、乙酰膽堿酯酶（AChE）和金屬硫蛋白（MTs）.除了MTs的提取液單獨制備外，其它生化因子采用以下方法進行提取.將內臟樣品按質量體積比 1：4加入 pH值 7.8的 Tris-HCl（0.02mol/L）緩沖溶液中勻漿，離心后取上清液于4℃下保存待測.測定GSH、TBARs的勻漿液離心參數為：5000r/min，15min；測定 SOD、AChE、CAT、GR、GPx的離心條件為：10000r/ min，15min.

GSH測定：采用張迺哲等［8］的熒光分光光度法.在堿性條件下，GSH中的氨基酸、肽可與OPT反應生成熒光復合物.在激發波長為350nm，發射波長為430nm時，熒光強度與GSH濃度呈線性關系.根據標準曲線查得GSH的μmol值，計算內臟組織蛋白中GSH含量，單位為μmol/g prot.

MTs測定：采用肖靜等［9］優化的測定海洋雙殼類動物MTs含量的分光光度法.按質量體積比1：5將 Tris-HCl緩沖液（含 0.5mo1/L蔗糖，0.02mo1/L Tris-HCl，0.5mmo1/L PMSF，0.01% β-巰基乙醇）與內臟樣品混合勻漿，之后于 4℃下25000r/min離心30min，得到MTs提取液.經過除雜和N2吹干得到MTs干粉，然后利用Ellman試劑與之發生顯色反應，溶液中的DTNB與MTs的-SH反應生成黃色物質，可在412nm處進行MTs定量測定.MTs含量采用單位質量濕組織（ww）中-SH含量間接表示，單位μmol-SH/g.

AChE測定：采用Ellman等［10］的可見光分光光度法.提取液中的AChE將底物ATChI分解為乙酸和碘化硫代膽堿，后者與DTNB發生反應生成黃色絡合物（5-巰基-2-硝基苯甲酸），通過測定412nm處酶促反應的初速度（吸光度隨時間的變化率）計算AChE活性，酶活力定義為：每mg組織蛋白每 min水解 ATChI的 nmol數，單位為nmol/（min·mg prot）.

SOD、CAT、GPx、GR、TBARs均使用南京建成生物工程研究所產品試劑盒測定.其中，SOD采用黃嘌呤氧化酶法，單位為 U/mg prot.CAT采用紫外分光光度法，以240nm處測定的底物H2O2消耗量表征酶活性，單位為U/g prot. GPx采用可見光分光光度法，以412nm處測定的酶促反應中 GSH消耗量表示酶活力，單位為U/mg prot.GR采用紫外分光光度法，以340nm處測定的底物還原型輔酶 II（NADPH）減少量表示酶活力，單位為U/g prot. TBARs采用硫代巴比妥酸法，單位為nmol/mg prot.

1.3.3 內臟蛋白質測定 蛋白質含量用于除LMS、MTs外的所有生物標志物活性/含量的計算.采用南京建成生物工程研究所的試劑盒（考馬斯亮藍法）測定：考馬斯亮藍染料的陰離子與蛋白質分子中的-NH3+特異性結合，使溶液呈藍色，通過測定595nm處吸光度可計算出蛋白含量，單位為g/L.

1.4 IBRv2指數計算方法

采用 IBR指數創立者 Burgeot［5］研究團隊2013年提出的改進型綜合生物標志物響應（Integrated Biological Responses version 2，IBRv2）指數［11］.同改進前的 IBR 指數法相比，IBRv2指數法避免了繪制星狀圖時因生物標志物排序不同造成的計算結果偏差，同時能夠反映多種生物標志物在不同污染條件下的誘導和抑制效應，但是需要預先確定清潔站位作為對照［11］.由于本研究不是現場調查項目，因此采用不含尾水（即EVR= 0%）時的生化因子測定值作為對照.

首先根據公式（1）對各尾水處理組中每種生物標志物測定值進行標準化處理，式中，Xi為各處理組中該生物標志物響應值，X0為對照組的響應值；

然后根據公式（2）計算每個處理組中每種生物標志物的均一化值，式中，Yi為某生物標志物標準化值，M和S分別為其在所有濃度組中的總平均值和標準差；

計算每個處理組中每種生物標志物的偏離指數見式（3），式中Zi和Z0分別為某處理組和對照該生物標志物的均一化值，Ai＞0或 Ai＜0時，分別表示該生物標志物被誘導或受到抑制；

最后，將每個處理組中所有生物標志物的 Ai絕對值相加后，再除以所用生物標志物個數 n，即得到IBRv2指數值，公式如下：

2 結果與討論

1.5 數據統計分析

對于每個處理組（或對照組），各種生物標志物測定結果均以 3個重復測定值的平均值±標準差表示.采用 SPSS18.0軟件進行數據統計分析，通過單因素方差分析（ANOVA）中 Tukey（方差齊性）和 Games-Howell（方差非齊性）檢驗法進行某生物標志物響應值在不同濃度處理組間的差異性檢驗.同時，對生物標志物含量（活性）與尾水濃度、IBR指數值與尾水濃度，進行雙變量Pearson相關性分析，顯著性水平設為P＜0.05和P＜0.01.

2.1 對尾水暴露無敏感響應的生化因子

SOD和CAT是生物細胞內兩種重要的抗氧化酶，共同抵御污染逆境下的活性氧（ROS）毒性

［12］.前者存在于細胞質和線粒體內外膜之間，主要作用是清除機體產生的O2-生成 H2O2；后者是一種末端氧化酶，能夠將 H2O2水解以減輕H2O2對細胞的氧化損傷.

由圖1（A）、（B）可見，在EVR1%～40%范圍內，文蛤的內臟SOD活性雖有波動，但是均與對照組（0%尾水濃度處理組）無明顯差異；CAT活性則僅在 EVR40%處理組中受到顯著抑制（P＜0.05），為對照組的55.06%，其他處理組的CAT活性與對照組差異均不顯著.筆者之前采用青島市李村河污水處理廠的尾水（EVR1%～20%）培養文蛤（M. meretrix）所得到的結果［6］有所不同：暴露9d時，各尾水處理組的內臟 SOD活性均顯著增加（P＜0.05），CAT活性則全部受到顯著抑制（P＜0.05），且與 EVR呈顯著負相關（P＜0.01）.兩期研究中SOD、CAT對尾水暴露的敏感性差異較大，可能與不同來源的MSTPs尾水中化學污染成分存在差異有關.根據筆者調查，李村河 MSTPs所接受的污水中，工業廢水約占 40%，相應的，所排尾水中毒性強的污染物（重金屬等）濃度可能較大，即使在較低EVR時也會在文蛤體內產生較高的氧化逆境，誘導內臟 SOD活性以消除積累的O2

-［12-13］.孟范平等［12］綜合國內外文獻發現，大多數研究中重金屬對雙殼類CAT活性呈現抑制作用.而PAHs、有機氯農藥等有機污染物常常誘導雙殼類內臟 CAT活性［14］.由此推測，前文所發現的CAT活性受抑可能因為李村河MSTPs尾水中含有較高濃度的重金屬污染物所致.相反，進入團島MSTPs的污水中只有少量食品工業廢水，高毒污染物的來源較少，尾水中此類污染物的濃度相對較低，在文蛤內臟中產生的脅迫效應不足以引起SOD的應激反應和CAT活性的抑制，因此認為，文蛤內臟SOD、CAT對尾水暴露的弱敏感性將限制其在團島MSTPs尾水排放海域生物監測中的應用.

圖1 暴露于不同尾水濃度的文蛤內臟SOD、CAT活性變化Fig.1 Activities of SOD and CAT in the viscera of M. meretrix exposed to increasing concentrations of effluents

2.2 對尾水暴露響應敏感但與 EVR無顯著相關性的生化因子

GSH是在動物肝臟中合成的富含-SH的三肽，在清除細胞內 ROS過程中起到重要作用［15］：在GPx催化下，可將H2O2還原為H2O；在谷胱甘肽轉硫酶（GST）催化下，能與外源親電子化合物結合，使其轉化為無毒或低毒的化合物排出體外.在這些反應中，兩分子GSH通過二硫鍵連接形成一分子氧化態谷胱甘肽（GSSG）.在輕微氧化逆境下，作為生物體內抗氧化酶的GR可利用NADPH作為電子供體，催化GSSG的二硫鍵還原，重新生成 GSH，以保持細胞正常代謝所需的適宜GSH/GSSG比值，即維持細胞內一定-SH水平.換言之，如果GR活性受到抑制，將引起GSH/GSSG比例失衡，使細胞處于氧化脅迫狀態.由圖2（A）、（B）可見，暴露于尾水9d后，文蛤內臟的GR、GSH總體上的響應特征是活性抑制或含量降低.對于GR，只在 EVR5%處理組與對照組差異不顯著，EVR30%處理組的抑制率最大，活性降至（8.21± 0.23） U/g prot，為對照組的64.04%.文獻［16］報道，海水中重金屬能夠抑制地中海貽貝（Mytilus galloprovincialis）內臟GR的活性.這意味著本研究所用尾水中可能含有某些種類的重金屬（雖然其濃度可能低于李村河 MSTPs）.GSH在大多數處理組（除EVR20%、40%處理組外）的含量明顯低于對照組（P＜0.05），最低值出現在 EVR30%處理組中，為對照組的 82.15%.但是，尾水暴露期間，內臟GR與GSH之間的消長關系并不完全遵循上述抗氧化機理，例如，在EVR5%處理組中，雖然GR活性未受到明顯抑制而保持在較高水平，但是GSH含量顯著低于對照組；在EVR20%、40%處理組中，GR活性受抑的同時觀察到較高的GSH含量.這可能是因為，除了受到GR活性調節外，GSH含量的高低還受到GST催化下的GSH消耗速率、GPx催化下的 GSH氧化速率以及GSH合成速率等多因素的影響［15，17］.相關性分析表明，在EVR1%～40%范圍內，無論是GR還是GSH，其響應值與EVR之間均不存在顯著相關性，無法對不同尾水濃度產生規律性的響應，因而不適于作為團島MSTPs尾水污染的生物標志物.

生物體在逆境脅迫下積累的ROS攻擊細胞膜上的多不飽和脂肪酸（PUFA），會引發脂質過氧化作用，形成脂質過氧化物，這是細胞氧化性損傷的一個典型標志.脂質過氧化產物常通過測定MDA或TBARs的含量表征，其水平升高往往意味著污染程度超出生物體抗氧化防御系統的調節能力，機體內氧化還原平衡受到破壞［18］.尾水暴露期間，文蛤內臟的脂質過氧化較為明顯，表現為TBARs含量在EVR1%～10%范圍內呈單調增加，在 EVR20%～40%范圍內也有類似變化趨勢，最 高 值 ［（4.65±0.04）nmol/mg prot］出 現 在EVR10%處理組中，為對照組的1.36倍，見圖2（C）.與低EVR尾水相比，高EVR尾水對TBARs的誘導作用較弱，這與2.3節圖3中高EVR尾水暴露下內臟MTs含量較高相一致，表明MTs的大量合成有利于減輕尾水中重金屬離子對文蛤內臟細胞的毒害作用.但是，由于在研究所設置的 EVR范圍內TBARs含量與EVR之間的相關性未達到顯著水平，因此，該因子同樣不適于客觀指示海水中尾水污染程度.

圖2 暴露于不同尾水濃度的文蛤內臟GR、GSH、TBARs活性（含量）變化Fig.2 Activity of GR and contents of TBARs and GSH in the viscera of M. meretrix exposed to increasing concentrations of effluents

2.3 對尾水暴露響應敏感且與 EVR呈顯著相關的生化因子

LMS可以從細胞水平上反映環境脅迫造成的功能完整性受損程度，是雙殼類動物細胞的總逆境因子［19］.采用 NRRT評價雙殼類動物的LMS不僅操作簡便、成本較低并可快速測定［20］.以往的研究證實，有機污染物和重金屬的暴露均能造成NRRT降低［21-22］.Steven等［23］利用天然氣加工廠生產廢水對紫貽貝（Mytilus edulis）進行5周暴露實驗，所有處理組（EVR為0.01%、0.1%、0.5%和1%）的NRRT表現出敏感的單向響應（持續降低）.聯合國環境規劃署“地中海污染監測項目（MEDPOL）”的專家認為，LMS是水質評價中最可靠的生物標志物［24］.本研究中（圖3（A）），經過 9d培養，對照組 NRRT平均值為97.41min，各處理組的 NRRT均出現大幅降低，除 EVR1%處理組外，均與對照組差異顯著（P＜0.05），以 EVR40%處理組的溶酶體膜穩定性最差，NRRT（58.93min）降為對照組的 59.33%.隨著EVR增加，NRRT基本上呈單調降低趨勢，相關性分析表明，兩者之間具有顯著的劑量-效應關系：NRRT= -75.721EVR+ 84.501（R= -0.785，P＜0.05）.因此，由NRRT表征的LMS適于作為監測尾水污染的生物標志物.

GPx是與CAT具有相同催化底物的一類重要抗氧化酶，能夠催化GSH與H2O2或氫過氧化物反應，有效阻止細胞內ROS引起的氧化損傷［14］.根據圖3（B），對照組GPx活性為8.72U/mg prot，暴露于尾水的各處理組GPx活性均受到顯著抑制（P＜0.05），降幅在8.83%-21.67%.相關性分析顯示，內臟GPx活性與EVR之間呈顯著負相關：GPx = -3.154EVR+8.045（R= -0.758 ，P＜0.05）.孟范平等［12］綜合國內外研究成果發現，重金屬暴露一般會抑制雙殼類內臟的GPx活性.Almeida等［25］研究重金屬暴露后褐貽貝（Perna perna）體內生物標志物的響應指出，GPx是對重金屬具有較好劑量-效應關系的暴露性生物標志物.此外，有機氯農藥、PCBs等有機污染物也能導致鯡魚（Sprattus sprattus）體內 GPx活性顯著下降［26］.本研究觀察到文蛤內臟 GPx對尾水污染有靈敏響應且與EVR顯著相關，表明該生化因子適于作為污染組分復雜的尾水的生物標志物.需要指出的是，筆者于春季［6］采用青島市李村河MSTPs尾水對文蛤的暴露研究中，內臟GPx受到普遍抑制出現在尾水暴露 12d和 15d，這可能與不同季節的 文蛤生理狀態存在差異有關.

圖3 暴露于不同尾水濃度的文蛤血細胞LMS以及內臟GPx、MTs、AChE變化Fig.3 GPx， MTs and GSH in the viscera as well as hemocyte LMS of M. meretrix exposed to increasing concentrations of effluents

MTs是生物體內一類分子量較低、半胱氨酸含量極高的金屬結合蛋白質.當體內非必需重金屬（Pb2+、Cd2+等）過多時，MTs會與這些重金屬發生特異性結合，避免細胞受到損傷.AChE主要位于突觸后膜，鄰近乙酰膽堿的受體，是生物神經傳導中的一種關鍵酶，能降解乙酰膽堿，終止神經遞質對后膜的刺激作用，保證神經沖動在突觸間的正常傳導. 當有機磷農藥與AChE特異性結合后，會導致生物體出現不同程度的神經損害.海洋污染監測中常將雙殼類的MTs和AChE分別作為重金屬［27-28］、有機磷農藥［29-30］的特異性生物標志物用于水體中這兩類污染物的監測預警.由圖 3（C）可見，各濃度的尾水暴露均能顯著誘導內臟 MTs合成（P＜0.05），MTs含量最大值（0.921μmol-SH/g）出現在 EVR30%處理組，是對照組的1.5倍；根據圖3（D），內臟AChE活性雖然在低濃度尾水暴露時變化較小，但是當EVR大于20%時，酶活受到明顯抑制（P＜0.05），其中，EVR40%處理組的酶活最低，降幅為41.92%.這種變化規律同樣見于以往的文獻報道中：Kamel等

［31］研究突尼斯蘇賽市的市政尾水（EVR為0%、1%、3%和 10%）對溝紋蛤仔（Ruditapes decussatus）的影響發現，各處理組的MTs含量均有所升高；Gagne等［32］將一種淡水貝類（Elliptio complanata）在不同濃度（EVR1%、3%、10%和20%）經初級處理的市政廢水中暴露培養 30d，其體內AChE活性均顯著低于對照組.相關性分析進一步表明，內臟MTs含量與EVR呈顯著正相關：MT = 0.695EVR+ 0.669（R= 0.907，P＜0.01）；而內臟AChE活性與EVR呈顯著負相關：AChE =-2.760EVR+2.699， R= -0.976，P＜0.01）.由此認為，文蛤內臟MTs、AChE均與尾水暴露存在良好的劑量-效應關系，適于作為尾水受納海域的生物標志物應用于尾水-海水體系的污染監測.

2.4 IBRv2指數計算及其對尾水污染的指示效果

在利用 IBR指數法進行環境污染綜合評價時，所采用的生物標志物既要對不同濃度的尾水產生較大響應，又要與尾水 EVR顯著相關.根據2.1～2.3節文蛤生化因子的響應特征分析，血細胞LMS以及內臟GPx、MTs、AChE符合上述要求，可作為尾水-海水混合體系綜合污染的評價指標.在此基礎上，本研究以零濃度（EVR=0%）的培養體系作為對照組，分別利用各尾水處理組中上述4種生物標志物的實測值計算IBRv2指數，見圖4.各處理組的IBRv2指數值隨著EVR的增大而逐漸升高，相關性進行分析發現兩者之間存在顯著正 相 關 關 系 （IBRv2=5.4781EVR+0.5579，R= 0.9295，P＜0.01）.這表明，基于上述4種生物標志物構成的評價指標所計算的綜合指數可以清晰識別混有尾水的海水污染水平.由此推測，今后的應用研究中，如果采用籠養移植方式將文蛤投放到納污海域進行主動性監測時，經過現場暴露 9d，有望利用這些生物標志物對尾水污染的良好響應計算各站位 IBRv2指數值，以區分尾水對海水的污染水平.目前，有關利用生物標志物進行尾水排放海域污染監測的研究報道不多，少數歐洲學者利用海域現場雙殼類體內多種生物標志物進行海灣、河口區域海水污染程度評價（表1）.這些研究中所選用的評價指標體系各不相同，表明針對污染源類型不同的海域進行環境質量評價時，篩選適宜的生物標志物組合十分必要.另外，本研究中，各處理組的暴露實驗均在非污染因子（溫度、DO、鹽度）調控一致的情況下進行.但是，在受納尾水的海域現場，不同站位間的鹽度、溫度、DO可能存在差異而且不可能像室內研究那樣進行調節，因此，在現場應用生物標志物進行綜合水質評價之前，必須進一步確定非污染因子變化對生物標志物響應值的干擾程度，并提出可行的校正方法.

圖4 各尾水處理組的IBRv2指數值隨EVR的變化Fig.4 IBRv2values based on four biomarkers in clams exposed to different concentrations （EVR） of effluents

表1 文獻中利用綜合生物標志物指數進行近岸海域污染評價的基本信息Table 1 Basic information on environmental assessment of coastal waters with integrated biomarker response index reported in some literatures

續表1

3 結論

3.1 在尾水-海水混合體系中，文蛤有 4種生物標志物（血細胞LMS以及內臟GPx、MTs、AChE）能夠產生敏感響應并與尾水 EVR呈顯著相關，適于作為混合體系綜合污染評價的生物學指標.

3.2 依據評價指標所計算的 IBRv2指數值與尾水濃度呈顯著正相關（R=0.9295，P＜0.01），證明IBRv2指數法適于受納尾水的海域綜合污染評價.

3.3 為使 IBRv2指數法更好應用于尾水排放海域綜合評價，應針對MSTPs所處理的廢水類型不同篩選適宜的生物標志物組合，并注意非污染因子變化對生物標志物響應值的干擾及消除方法研究.

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Integrated assessment of pollution level in the effluent/seawater mixture based on the biomarker’s response in clam Meretrix meretrix.

LIN Yi-chen， MENG Fan-ping*， WAN Ru， DU Yong-xiang， WANG Yue-jie， CUI Hong-wu （Key Laboratory of Marine Environment and Ecology， Ministry of Education， Ocean University of China， Qingdao 266100，China）. China Environmental Science， 2016，36（9）：2774～2783

Bivalve Meretrix meretrix were exposed for 9days to mixture of Tuandao MSTP effluents and seawater （volume ratio ranged from 1% to 40%， resulted from dilution with natural seawater）. Biological effects of contaminant exposure on bivalves were evaluated by measuring nine biochemical parameters including superoxide dismutase-SOD， catalase-CAT，glutathione peroxidase-GPx， glutathione reductase-GR， reduced glutathione-GSH， thiobarbituric acid reactive substances-TBARs， acetylcholinesterase-AChE and metallothioneins-MTs in digestive gland， as well as hemocyte lysosomal membrane stability-LMS. All the biochemical parameters except SOD and CAT had sensitive responses to effluent exposure， Among which four biomarkers， namely LMS， GPx， MTs and AChE， were more effective for indicating effluent pollution because of the significant correlation with concentrations of effluents （P＜0.05 or P＜0.01）. The calculated IBR（integrated biomarker response） index value （0.61～2.65）， based on the responses of these biomarkers， increased with the rise of ratio of effluents， and a significant positive correlation between them was observed （P＜0.01）. The results proved the usefulness of integrated biological effects measurements and IBR index for the assessment of complicated chemical contamination in seawaters receiving MSTPs effluents.

effluent；municipal sewage treatment plants （MSTPs）；seawater；integrated assessment；bivalve； biomarkers

X835

A

1000-6923（2016）09-2774-10

2015-12-23

國家自然科學基金項目（41240040）

? 責任作者， 教授， mengfanping@ouc.edu.cn

林怡辰（1992-），女，山東招遠人，中國海洋大學碩士研究生，主要從事海洋環境生物監測研究.