體液調控神經元在調控秀麗線蟲固有免疫中的研究進展

馬安然

（東南大學醫學院臨床醫學系，南京210009）

體液調控神經元在調控秀麗線蟲固有免疫中的研究進展

馬安然

（東南大學醫學院臨床醫學系，南京210009）

秀麗隱桿線蟲在受到病原菌感染時，會迅速激活固有免疫。神經免疫間的交流可以通過神經系統釋放神經遞質、神經肽及激素來調控固有免疫反應，包括已知的多巴胺信號通路、TGF-β信號通路和胰島素信號通路。近年來的研究表明，NPR-1神經環路也參與固有免疫的調控，并且三個體液調控神經元AQR、PQR和URX是通過NPR-1神經環路調節固有免疫的。線蟲的神經系統只有302個神經元，結構也相對簡單，線蟲的npr-1基因可編碼與哺乳動物神經肽Y(neuropeptide Y，NPY)具有受體相似的GPCR，這些優勢為研究高等生物神經免疫間交流的分子機制提供了基礎。本文就體液調控神經元在調控秀麗線蟲固有免疫方面展開討論，希望可以為高等生物神經免疫間的調節機制提供重要的思路和方法。

秀麗隱桿線蟲；神經免疫交流；NPR-1神經環路；體液調控神經元

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）是一類生活在溫度恒定的土壤中，以細菌為食的線蟲類生物［1］。其個體小，長度約1mm，通體透明，可用Ca2+成像技術檢測神經元的活化［2］。1963年，Brenner［3］提出了將線蟲作為模式生物用于動物神經發育的研究，線蟲是第一個完成基因組全序列測定的多細胞生物，可提供構建整個動物所用的全部遺傳信息。截至2012年，線蟲體內所有神經元之間的實觸連接和神經通路網絡模式都已繪制完成［4-5］，這更加有利于研究神經環路對行為和有機體生命活動的調節，當然也包括固有免疫。此外，線蟲的神經系統相對簡單、基因操作方便、生長周期短（在實驗室20°C的情況下，繁殖一代平均要3.5d［1］），是用于研究動物感覺和行為的常用模式動物。線蟲能感受外界環境的變化，在應對病原菌感染時，可誘導固有免疫包括分泌抗菌肽、溶菌酶、凝集素等。

1　體液調控神經元在固有免疫中的功能

1.1體液調控神經元

圖1　體液調控神經元（gcy-32::gfp）AQR、URX位于頭部，PQR位于尾部Fig.1 Body fluid neurons（gcy-32::gfp）,AQR、URX located at head, PQR at tail

體液調控神經元包括AQR、PQR和URX。線蟲呈蠕蟲狀、兩側對稱、無分節，有四條主要的表皮索狀組織及一個充滿體液的假體腔［6］，而AQR、PQR、URX是除了CEP之外直接暴露于體腔液中的神經元，因此被稱為體液調控神經元［7］。AQR和PQR的感覺纖毛末端直接暴露于體腔液中，而URX沒有纖毛結構的末端于是伸入頭部最前端［8］，如圖1所示。

1.2體液調控神經元主要感受高氧環境

線蟲的神經系統共有302個神經元［3］，每個神經元都有其特點，基于電鏡三位重建的結果顯示，按照神經元的形態、神經連接及位置將線蟲302個神經元分為118類，每一類中神經元的數目為1～13［9-11］。

線蟲神經元按其功能可分為三類，分別為感覺神經元、中間神經元和運動神經元。感覺神經元的感器可以分為兩類，一類具有向外開口的通道，這類通道使部分神經結構直接暴露在外界化學環境中，另一類則沒有通道結構。前者主要是化學感受器，后者主要是機械感受器及其他一些未知功能的感受器［12］。

本文主要敘述感受氧濃度的化學感受器。土壤中存在不間斷的大腸桿菌代謝活動，導致土壤局部氣體濃度變動，線蟲要在土壤中生存就必須要感受環境中的氣體濃度，如O2和CO2的變化。實驗證明線蟲對中氧氣濃度(5%～12%)有極強的偏好性，而對過高或過低的氧濃度都表現出躲避效應［13］。作為需氧生物，線蟲需要氧氣來維持生存，同時也要躲避高氧對DNA和其他大分子的氧化損傷。最主要感受正常水平氧濃度的神經元是AQR、PQR、URX和BAG。

AQR、PQR和URX主要感受高氧環境，BAG則主要感受周圍的低氧環境。遺傳學和鈣成像的實驗表明，線蟲對高氧的感受需要可溶性鳥苷酸環化酶GCY-35的參與，對低氧的感受需要GCY-31和GCY-33的參與［14］。升高氧氣濃度在BAG中激發一個鈣上升，而降低氧氣濃度則在AQR中激發一個鈣上升［15-16］。氧氣調節線蟲的聚集行為，并形成社會性進食行為，聚集在一起的社會性進食行為可被氧氣濃度降低所抑制，URX、AQR和PQR在形成社會性進食中起到關鍵作用，并很可能是氧氣調節社會性進食的關鍵神經元［17-18］。

2　NPR-1在調控線蟲固有免疫中的作用

2.1NPR-1神經環路

自然條件下，NPR-1僅有2個等位基因在215位點上的氨基酸有所不同，分別是NPR-1(215V)和NPR-1(215F)。N2線蟲基因是NPR-1(215V)，而npr-1突變體（ad609）的是NPR-1(215F)，NPR-1(215V)的活性比NPR-1(215F)強得多［19］。

因為體液調控神經元的活性要GCY-35、TAX-2和TAX-4的參與，因此NPR-1可以通過抑制GCY-35、TAX-2和TAX-4的活性來抑制AQR、PQR和URX。當線蟲為NPR-1(215F)時，對AQR、PQR和URX的抑制作用降低，也就促進了線蟲對高氧的躲避。而高氧是npr-1突變體形成聚集行為最重要的因素，為了躲避高氧損傷，npr-1突變體聚集在PA14菌落的邊緣，因為那里是細菌濃度最高、氧濃度最低的地方，也因此增加了對PA14的易感性，從而抑制了固有免疫［19］，如圖2所示。

圖2　調控秀麗線蟲固有免疫的NPR-1神經環路模式圖Fig.2 NPR-1 nerves circuit model of regulating of innate immunity in Caenorhabditis Elegans

2.2NPR-1對線蟲固有免疫的調控

當有食物時，線蟲可以分散進食也可以社會性進食，這是由NPR-1神經環路所調控的。NPR-1(215F)和NPR-1功能喪失型線蟲會產生聚集行為，成群聚集在細菌菌苔的邊緣，而含有NPR-1(215V)的N2線蟲沒有這樣的行為，但對PA14具有菌落逃逸行為［17］。如圖3所示。

圖3　NPR-1功能喪失型線蟲增加對PA14的易感性Fig.3 NPR-1 function-loss type elegans promotes munity to PA14

Styer和Reddy兩個研究組的研究發現，npr-1突變體（ad609）線蟲比N2線蟲對PA14的易感性增加［1 8-1 9］。為了檢測N2線蟲和npr-1突變體線蟲(ad609)的運動行為差異是否會影響他們對PA14的易感性，兩個研究組都利用了滿菌落分析方法。即將PA14涂滿整個板子，這樣做是為了限制了npr-1突變體線蟲(ad609)成群地聚集在細菌菌落的邊緣和N2線蟲菌落逃逸行為，然后檢測這兩種株系線蟲對PA14的易感性。Reddy等［19］發現npr-1突變體（ad609）線蟲與N2線蟲相比，對PA14的易感性無明顯差別，Styer等［18］研究發現N2線蟲在PA14滿菌落上的死亡率明顯高于在培養基中央涂一塊PA14，而npr-1突變體線蟲（ad609）并沒什么差別。這說明N2線蟲的菌落逃逸行為是造成易感性差異的原因。但同時，他利用滿菌落發現npr-1突變體線蟲（ad609）比N2線蟲易受PA14感染，綜合以上結果他認為，運動行為的差異只是導致易感性差別的一個原因而不是全部原因。Styer等［18］還發現NPR-1調節多種固有免疫基因的表達，因此他認為NPR-1不僅可以調節線蟲的運動行為，也可以直接調節線蟲的固有免疫來調控它對致病菌的易感性。但同時，Reddy等［19］發現npr-1突變體在PA14感染后的24h，腸道內的積累情況比N2線蟲要嚴重得多，但在涂滿PA14的測試條件下沒有區別。因此他認為npr-1突變體（ad609）線蟲和N2線蟲對致病菌易感性的差異是依賴其行為差異的。為了進一步研究NPR-1是否參與調控固有免疫的靶點基因及其信號通路，Capra等［20］做了全基因組微陣列分析。結果表明，npr-1突變以后差別表達的基因大部分是參與固有免疫調控的，并且被DAF-16、DBL-1和PMK-1/p38 MAPK信號通路所調控。Aballay等［21］發現PMK-1通路相關基因在npr-1突變體（ad609）線蟲中的活性遠低于N2線蟲，全基因組微陣列分析證明了npr-1調控秀麗線蟲的固有免疫相關基因，并且不依賴于致病菌的逃逸行為。

圖4　插入gcy-32啟動子后npr-1突變體線蟲（ad609）對PA14的易感性降低Fig.4munity of npr-1 mutant elegans to PA14 de cline a fter inserted the gcy-32 promoter

NPR-1至少表達在20多種神經元中，包括鳥苷酸環化酶GCY-35表達的神經元AQR、PQR和URX，為了證明AQR、PQR和URX參與了NPR-1神經環路對固有免疫的調控，Styer等［18］用egl-1表達在gcy-36啟動子（特異性表達在AQR、PQR和URX）殺死AQR、PQR和URX神經元感染PA14后，易感性明顯降低。推測AQR、PQR和URX神經元是可以抑制秀麗線蟲固有免疫反應的。此外，他還用gcy-32這個啟動子的特異性啟動npr-1在AQR、PQR和URX的表達，結果發現，插入了gcy-32啟動子的線蟲對PA14的易感性降低了，如圖4所示。綜合以上結果，說明AQR、PQR和URX是通過npr-1神經環路調節固有免疫的。

Tiewen Liu等［14］利用激光切除的方式切除URX后，線蟲的壽命從13.3±0.4d下降到10.4±0.4d，和對照組相比，URX切除的線蟲表型和繁殖行為沒有明顯改變，因此這種壽命的減少并不是由于缺陷。進一步研究GCY-35和GCY-36這兩種可以介導URX感受高氧環境的鳥苷酸環化酶，發現GCY-35和GCY-36突變體線蟲的壽命顯著降低。將GCY-35和GCY-36的cDNA分別置于兩者的啟動子下發現突變體的表型得到恢復。

遺傳學研究表明NPR-1對神經元AQR、PQR和URX活性的抑制要有可溶性的鳥苷酸環化酶GCY-35、TAX-2和TAX-4的共同參與，TAX-2和TAX-4蛋白是cGMP門控離子通道的2個亞基［21］。研究者還發現這三個神經元的活性能選擇性地被一種鉀離子通道EGL-2功能增強型突變體所抑制，這種突變體也能抑制線蟲的聚集行為。因此推測這些神經元的作用是依賴于cGMP門控離子通道的［18］。

2.3討論

筆者認為，NPR-1至少能從2種機制抑制固有免疫。NPR-1可以通過調控線蟲的行為來調節它對致病菌的易感性，也能直接調節線蟲的固有免疫反應。這些發現為研究高等生物神經免疫間的分子交流機制提供了基礎。哺乳動物的NPY可通過交感神經系統來調節免疫反應［22］，雖然線蟲缺乏編碼NPY的基因，但線蟲的基因組可編碼多種作為NPR-1配體的神經肽，推測這些神經肽有一些與NPY相似的功能。實際上，FMRF酰胺相關神經肽FLP-18和FLP-21在調節氧傳感中就是NPR-1的內源性配體［23］。因此，相關神經肽在固有免疫中的作用有待于進一步研究。

3　展望

雖然已有研究表明，線蟲神經免疫間的相互作用主要依賴于胰島素信號通路、多巴胺信號通路、TGF-β信號通路和NPR-1神經環路，但這些信號通路的研究仍需深入。例如，npr-1基因具體是如何抑制三個體液調控神經元的，AQR、PQR和URX三個神經元分別對固有免疫有什么作用，低氧誘導因子（HIF-1）是否能與GCYs以相似的通路共同調節線蟲的固有免疫，等等。Chen D等［24］研究發現，激活HIF-1能延長線蟲的壽命，Mehta R等［25］利用HIF-1功能增強型RNAi（去除egl-9，egl-9編碼一種使HIF-1降解的酶）使線蟲的壽命延長了，利用這種HIF-1功能增強型RNAi能緩解GCY突變體的表型，如圖5所示。相信隨著線蟲神經免疫間相互作用的研究不斷深入，最終將為人類高等生物神經免疫間的調節機制提供重要的思路和方法。

圖5　HIF-1功能增強型RNAi能緩解GCY突變體的表型Fig.5HIF-1 function enhanced RNAi can relieve the phenotype of GCY mutant

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Research progress of body fluid neurons in the regulation of innate immunity in Caenorhabditis Elegans

MA An-Ran
（Department of clinical medicine,School of medicine,Southeast university,Nanjing210000,China）

Caenorhabditis elegans would rapidly activate innate immunity once being infected with pathogens. Neuro-immune interactions which are through the nervous system to release such as neurotransmitters,neuropeptides and hormones to regulate the innate immune response.Those pathways include known dopamine signaling pathway,TGF-β signaling pathway and insulin signaling pathways.Recent studies showthat NPR-1 neural circuits are also involved in the regulation of innate immunity and three neurons AQR,PQR and URX exposed to body fluid are under the regulation of NPR-1 neural circuits.Elegans nervous system has only 302 neurons and the structure is relatively simple and the npr-1 gene of elegans can encode GPCR which is similar to the mammalian neuropeptide Y(neuropeptideY,NPY)receptor, providing an edge for studying higher organisms on neuro-immune interactions.Research progress in relation to the field has been reviewed in present paper.

Caenorhabditis elegans;neuro-immune interactions;NPR-1 neural circuit;neurons exposed to body fluid

Q291

A

1674-8646（2016）19-0019-04

2015-07-15

東南大學基于教師科研的SRTP項目（T15412007）

馬安然（1994-），女。