Jhdm1d在小鼠胚胎發育中后期的表達及表觀調控研究

劉宇帥，賀洪娟，吳瓊

（1.黑龍江省科學院高技術研究院，哈爾濱150010；2.黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱150020；3.哈爾濱工業大學生命科學與技術學院發育生物學實驗室，哈爾濱150080）

Jhdm1d在小鼠胚胎發育中后期的表達及表觀調控研究

劉宇帥1,2,3，賀洪娟3，吳瓊3

（1.黑龍江省科學院高技術研究院，哈爾濱150010；2.黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱150020；3.哈爾濱工業大學生命科學與技術學院發育生物學實驗室，哈爾濱150080）

本研究通過實時定量PCR(qRT-PCR)和免疫組織化學等技術，分析了Jhdm1d基因在小鼠胚胎發育中后期的表達模式。qRT-PCR結果顯示，在胚胎發育中后期，Jhdm1d基因在各組織中的表達量明顯不同，Jhdm1d在E12.5時期的腦和肝組織中表達最高，而在舌和肺組織中表達最低；在E15.5時期的肝臟組織中該基因的表達量最高，在肺和腎組織中的表達最低；在E18.5時期各組織中的表達均普遍較低。同時利用免疫組織化學的方法分析其在E15.5時期的表達，結果顯示Jhdm1d在蛋白水平上的表達與定量結果基本相符。同時，亞硫酸氫鹽測序的結果說明Jhdm1d的表達不受甲基化的影響。

Jhdm1d；胚胎發育；免疫組織化學；DNA甲基化

自從組蛋白去甲基化酶被發現以來，便受到越來越多的關注。迄今為止，已鑒定出來的組蛋白去甲基化酶可以歸為兩類，包括KDM1（賴氨酸去甲基化酶1）蛋白家族和含有典型JmjC結構域的組蛋白去甲基化酶［1］。許多報道已證實組蛋白去甲基化酶可以參與細胞分化、減數分裂及器官形成等重要的生物發育過程。研究報道，在胚胎干細胞中敲除Kdm1a基因會削弱生長和分化過程［2］，甚至將導致早期胚胎的致死［2,3］。一項對秀麗隱桿線蟲和小鼠減數分裂過程中組蛋白修飾的研究發現，減數分裂前期H3K4me和H3K9me的修飾水平伴隨著染色體配對、聯會以及DNA雙鏈斷裂等動態變化［4］。研究人員發現H3K4me存在于線蟲常染色體，而在失活的X染色體上不存在H3K4me修飾［5］。人們針對這些甲基化動態模式，發現多種靶向H3K4me和K3K9me的酶在減數分裂中起到重要作用，比如LSD1/KDM1［6］、JARID1/KDM5家族［7］。

Jhdm1d位于小鼠第6號染色體，編碼一種含有940個氨基酸并且包含JmjC結構域的組蛋白去甲基化酶，對H3K9me2和H3K27me2有特異性去甲基化作用，從而參與轉錄抑制和染色質調節過程［8］。研究報道，在營養缺陷條件下，組蛋白去甲基化酶Jhdm1d能夠通過調控血管的生成從而抑制腫瘤的生長［9］。目前對于該基因在小鼠胚胎發育中的表達模式及表觀調控機制尚不明確，因此，本課題分別從轉錄和蛋白水平研究了該基因在小鼠胚胎發育中后期的時空表達譜以及表觀調控機制。

1　實驗材料與方法

1.1實驗材料

本課題中所使用的小鼠品系分別為DBA/2J、C57BL/6J、ICR及FVB小鼠，均購于上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.2實時定量qRT-PCR

本部分實驗包括總RNA提取、RNA反轉錄成cDNA以及實時定量qRT-PCR三部分。

總RNA提取：獲取實驗樣本后，利用RNAisoTM Plus試劑（TaKaRa），根據試劑盒說明書的操作流程提取RNA。

反轉錄：利用M-MLV reverse transcriptase反轉錄試劑盒(Promega,USA)說明進行。

實時定量qRT-PCR：利用Perfect Real Time SYBRPremixExTaq TMII試劑盒，依據說明書提供的操作條件及流程進行，分析該基因在小鼠不同發育階段的表達模式。

1.3免疫組織化學

胚胎樣品的前處理：獲取新鮮的小鼠胚胎樣品于4%多聚甲醛中過夜固定，梯度脫水及透明化處理，多次浸蠟后包埋成塊。

切片、粘片：用石蠟切片機進行連續切片，厚度為10μm左右，于水中將切片展平后放于干凈的多聚賴氨酸載玻片上，42 C雜交爐中干燥過夜。

免疫組化抗體反應：在通風櫥中利用二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水后進行抗原修復以及滅活內源性過氧化物酶操作，2%BSA/PBS室溫封閉1h，抗體過夜雜交后添加BCIP/NBT發色液暗處進行顯色，經脫水、透明化處理后用中性樹脂膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.4甲基化分析

由于Jhdm1d基因在胚胎各組織中的表達存在明顯差異，因此利用亞硫酸氫鹽測序法對Jhdm1d基因啟動子區的甲基化模式進行分析。

提取小鼠E15.5時期的腦、舌和肝組織的基因組DNA，然后根據試劑盒進行亞硫酸氫鹽處理。設計甲基化分析用引物，進行目的基因PCR擴增。對PCR產物進行回收純化，經過連接、轉化以及藍白斑抗性篩選后對陽性克隆擴大培養，利用Axygen試劑盒提取質粒。測序后利用軟件DNAMAN6.0分析。

2　結果與討論

2.1Jhdm1d在小鼠胚胎發育中后期各組織中的表達

選取小鼠E12.5、E15.5和E18.5三個時期的胚胎作為研究對象，分別獲取各時期的腦、舌、肝臟、肺、心以及腎6個組織，用qRT-PCR分析Jhdm1d在各組織中的表達。結果如圖1所示，Jhdm1d在E12.5d的小鼠胚胎各組織中持續表達，在腦組織中的表達最高，舌和肺組織表達最弱，在腦組織中的表達量約為肺組織的11倍，在肝組織中的表達量幾乎與腦組織的相同。在E15.5d的胚胎各組織中Jhdm1d基因呈現相對較高的表達水平，在肝臟中的表達最高，在舌、腦和心組織中次之，而在腎和肺組織中的表達最弱。在E18.5d，Jhdm1d在各組織中的表達普遍較低。

綜合對比這三個時期的結果發現，該基因在各組織中的表達基本均呈現先升高后降低的趨勢，即從E12.5到E15.5逐漸升高，然后從E15.5到E18.5逐漸降低，在E15.5各組織中的表達基本處于最高水平，舌組織除外。

圖1　qRT-PCR檢測Jhdm1d基因在E12.5、E15.5和E18.5小鼠胚胎各組織中的表達Fig.1Jhdm1dexpression in E12.5、E15.5 and E18.5 various organizations of mouse embryos by qRT-PCR

2.2免疫組織化學分析Jhdm1d在胚胎發育中期的表達

E15.5為胚胎發育中的關鍵時期，隨著發育的進行，此時的小鼠胚胎大多數組織器官形態已基本建成。

圖2　免疫組織化學檢測Jhdm1d在小鼠E15.5的表達Fig.2 Immunohistochemical detection of Jhdm1d expression in mice E15.5

我們選取E15.5d的小鼠胚胎作為實驗材料，利用免疫組化技術在蛋白水平對Jhdm1d進行分析，結果顯示Jhdm1d基因在這個時期的蛋白表達廣泛（圖2）。表達信號較強的區域集中在造血組織、呼吸器官以及內分泌器官中。其中在肝臟組織中的表達最強，說明組蛋白去甲基化酶Jhdm1d在肝中的含量很高。在前腦、心、肺、胸腺、腎、垂體等組織器官中的表達相對較強。而在中腦、后腦、脊柱軟骨原基和舌中的表達則處于一個相對較低的水平。綜合來看，Jhdm1d在各組織中的表達存在明顯差異，而且圖2中的表達信號強弱基本與定量qRT-PCR結果相符。

2.3DNA甲基化對Jhdm1d基因的表觀遺傳調控

通過生物信息學分析，該基因啟動子區存在一個CpG島，我們選取CpG島中大小為148bp的片段，其中含有12個CpG位點，為了明確該CpG島是否會影響Jhdm1d基因的表達，我們對該啟動子區內的相應位點進行甲基化動態模式分析。亞硫酸氫鹽測序結果表明，在小鼠E15.5的各組織中，無論是表達量高的肝臟組織，還是表達量較低的腦和舌組織，Jhdm1d基因啟動子區的CpG位點均處于低甲基化狀態（圖3）。說明在小鼠活體各組織中Jhdm1d基因的表達不受甲基化的調控。

圖3　小鼠E15.5肝、腦和舌中Jhdm1d基因在其啟動子區CpG位點的甲基化動態Fig.3 Methylation dynamic of Jhdm1d in its promoter region CpG locus in liver,brain and tongue of mice E15.5

3　結論

通過實時定量qRT-PCR和免疫組織化學等方法對Jhdm1d基因在小鼠胚胎發育不同時期的時空表達譜的研究表明，無論在mRNA水平還是在蛋白水平，Jhdm1d基因在小鼠胚胎發育中后期的腦、心、舌、肺、腎和肝等組織中呈現一種廣泛的表達模式，并且各組織以及胚胎發育不同時期的表達量存在顯著差異。說明Jhdm1d基因對小鼠各組織的發育起重要作用。

在胚胎發育和分化過程中，由于多種細胞類型均是從同一個前體細胞分化而來，所以嚴格的基因表達模式的調控十分重要［1］。DNA甲基化是表觀遺傳學調控的一個重要因素，通常基因啟動子區的低甲基化與基因表達相關。本課題通過亞硫酸氫鹽測序法初步明確了在E15.5d小鼠胚胎的腦、舌和肝組織中，Jhdm1d基因的表達不受DNA甲基化的調控，可能受其他因素的影響，如組蛋白修飾、染色質構象等，這些仍需進一步驗證。組蛋白去甲基化酶的異常通常伴隨疾病的發生，其中引起基因異常表達的因素很多，表觀遺傳學修飾的突變就是很重要的原因之一，因此弄清基因的表觀調控機制對于預防和治療疾病具有重要意義。

本課題關于Jhdm1d的研究將有助于我們深入了解組蛋白去甲基化酶中JmjC結構域的作用，同時也為進一步明確Jhdm1d的生物學功能奠定理論基礎。

［1］Ikegami K,Ohgane J,Tanaka S,et al.Interplay between DNA methylation,histone modification and chromatin remodeling in stem cells and during development［J］.International journal of developmental biology,2009,53(2):203-214.

［2］Loenarz C,Ge W,Coleman M L,et al.PHF8,a gene associated with cleft lip/palate and mental retardation,encodes for an Nε-dimethyl lysine demethylase［J］.Human molecular genetics,2010,19(2):217-222.

［3］Yu L,Wang Y,Huang S,et al.Structural insights into a novel histone demethylase PHF8［J］.Cell research,2010,20(2):166-173.

［4］Rudolph T,Yonezawa M,Lein S,et al.Heterochromatin formation in Drosophila is initiated through active removal of H3K4 methylation by the LSD1 homolog SU(VAR)3-3［J］.Molecular cell,2007,26(1):103-115.

［5］Opel M,Lando D,Bonilla C,et al.Genome-wide studies of histone demethylation catalysed by the fission yeast homologues of mammalian LSD1［J］.PLoS One,2007,2(4):386.

［6］Jenuwein T,Allis C D.Translating the histone code［J］.Science,2001, 293(5532):1074-1080.

［7］Wang J,Scully K,Zhu X,et al.Opposing LSD1 complexes function in developmental gene activation and repression programmes［J］.Nature, 2007,446(7138):882-887.

［8］Shi Y.Histone lysine demethylases:emerging roles in development, physiology and disease［J］.Nature Reviews Genetics,2007,8(11): 829-833.

［9］Pasini D,Bracken A,Agger K,et al.Regulation of stem cell differentiation by histone methyltransferases and demethylases［M］. Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology,Vol.73,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2008:253-263.

Study of Expression and Epigenetic Regulation of Jhdm1d in Mouse Mid-later Gestation Period

LIUYu-shuai1,2,3,HE Hong-juan3,WUQiong3
(1.Institute ofAdvanced Technology，HeilongjiangAcademyofSciences,Haerbin 150010,China; 2.Institute ofMicrobiology,HeilongjiangAcademyofSciences,Harbin 150020,China; 3.School oflife science and technology,HIT,Harbin,150080,China)

In this study,we analyzed the expression patterns of Jhdm1d in mouse mid-later gestation period in detail by quantitative real-time PCR(qRT-PCR),and immunohistochemistry(IHC).qRT-PCR results showed that in the mid-later gestation period,the expression of Jhdm1d was significantly different in various tissues.At E12.5,Jhdm1d was expressed abundantly in brain and liver,accompanied by the lowest level in tongue and lung.At E15.5 Jhdm1d was expressed abundantly in liver,with the lowest level in lung and kidney.At E18.5,the expressions of Jhdm1d in various tissues were almost very low.The immunohistochemistry results at E15.5 were consistent with qRT-PCR.The results of bisulfite sequencing demonstrated that Jhdm1d expression was not regulated by DNA methylation.

Jhdm1d;Embryonic development;IHC;DNAmethylation

Q78

A

1674-8646（2016）19-0038-03

2015-08-19

劉宇帥（1988-），女，碩士，助理研究員。