陸地棉萌發至幼苗期抗冷性的鑒定

王俊娟，王德龍，陰祖軍，王 帥，樊偉麗，陸許可，穆 敏，郭麗雪，葉武威，喻樹迅

（中國農業科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室/農業部棉花遺傳改良重點開放實驗室，河南安陽 455000）

陸地棉萌發至幼苗期抗冷性的鑒定

王俊娟，王德龍，陰祖軍，王 帥，樊偉麗，陸許可，穆 敏，郭麗雪，葉武威，喻樹迅

（中國農業科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室/農業部棉花遺傳改良重點開放實驗室，河南安陽 455000）

【目的】低溫脅迫是影響棉花正常生長的重要因子之一，通過對棉花種質進行合理的抗冷性鑒定，可以為棉花的抗冷機制研究提供重要的先決條件，進而為棉花抗冷品種的選育提供一定的理論參考?！痉椒ā坷?個抗冷性不同的陸地棉品種（系），設置0、4、10和15℃不同溫度處理7 d，然后在正常條件（28℃，光照/黑暗，14 h/10 h）恢復生長7 d，篩選適合棉花萌發期進行抗冷性鑒定的低溫條件；然后對4個品種（系）進行0℃低溫處理1、2、3、4、5、6和7 d，恢復正常生長7 d，篩選萌發期抗冷性鑒定0℃低溫處理的天數。對于芽期的抗冷性鑒定，選用抗冷性差異顯著的2個陸地棉材料進行4℃低溫處理0、1、2、3、4、5、6和7 d，篩選適用于芽期抗冷鑒定的低溫處理的天數。將47個陸地棉材料（子葉期）進行4℃處理24 h，恢復正常生長7 d后調查冷害指數，鑒定棉花子葉期的抗冷性。采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒測定芽期和子葉期低溫脅迫后的生化指標。【結果】通過對棉花不同時期，包括萌發期、芽期和子葉期進行不同低溫脅迫條件的篩選，最終初步建立了適合棉花不同時期的抗冷性鑒定標準。0℃處理4 d，恢復正常生長7 d的相對子葉平展率可以作為萌發期的抗冷鑒定指標；4℃處理5 d，恢復正常生長的7 d的子葉平展率可以作為芽期的抗冷鑒定指標；4℃處理24 h，恢復正常生長的7 d的抗冷指數可以作為子葉期的抗冷鑒定指標?？估洳牧显?067芽的SOD酶活和POD酶活均在低溫處理前期呈上調趨勢，之后下降至趨于平穩，而冷敏感材料衡棉3號芽的兩種酶在低溫處理前期迅速下降，然后上調后趨于平穩；2個材料芽的CAT酶活性在低溫處理早期均先上升后下降，在冷處理后期抗冷材料豫2067的CAT酶活一直高于冷敏感材料衡棉3號；2個材料的可溶性蛋白含量在冷處理早期比較接近，在冷處理后期抗冷材料豫2067的可溶性蛋白含量一直高于冷敏感材料衡棉3號。4℃低溫處理子葉期棉苗24 h后，抗冷材料豫2067子葉的SOD酶活力、POD酶活力、CAT酶活力均下降，而冷敏感材料衡棉3號的3種酶活力均上升，抗冷材料子葉中可溶性蛋白上升，冷敏感材料中的可溶性蛋白下降?！窘Y論】棉花不同的生育時期應有相應的抗冷性鑒定標準，不同材料和不同生育時期的耐冷性鑒定標準具有差異性。推測棉花芽期抗冷性與酶活力有關。子葉期抗冷性與3種抗氧化酶活性差異不顯著，可能與葉片中可溶性蛋白含量有關。

棉花；生育時期；抗冷性；鑒定方法；生化特性

0 引言

【研究意義】低溫冷害是限制農業生產的主要農業氣象災害之一。低溫冷害可使作物生育延遲，造成產量減少、品質降低[1]。重要作物如水稻、玉米、大豆、棉花和番茄等，對冷脅迫均比較敏感，而且冷適應能力差[2]。低溫冷害是威脅棉花的重要災害之一，尤其對在早春季節播種期和苗期的棉花危害更為嚴重[3]。棉花是喜溫熱作物，低溫使棉花生育期延遲、落花落蕾，品質和產量嚴重下降。隨著人口的日益增加和氣候條件的不斷惡化，糧棉爭地的矛盾越來越激烈，在保障國家糧食安全的前提下，培育棉花抗冷性品種，將棉花種植向新疆內蒙等寒涼地帶轉移是緩解糧棉爭地矛盾的有效途徑。對不同生育時期的耐低溫能力進行鑒定，制定出一套關于棉花抗冷性的綜合評價體系，篩選優異的棉花抗冷種質資源，有利于推進棉花抗冷育種進程。【前人研究進展】除了處于休眠期的干種子外，起源于熱帶、亞熱帶的冷敏感植物生長發育的所有階段均易受到冷脅迫的傷害[4]。目前，在水稻、玉米、大豆以及蔬菜等植物中進行了大量的耐低溫研究，并且制定出相應的抗冷性鑒定方法。不同作物間、同一作物的不同生育時期抗冷性評價指標具有多樣性。BERTIN等[5]利用6個材料篩選水稻萌發期和苗期的抗冷鑒定指標，指出10℃低溫是最有效的抗冷鑒定溫度。在玉米的耐寒性鑒定中，將低溫與常溫下各性狀測定值的比值作為耐寒性強弱的評價指標[6]。李育軍等[7]指出，在6℃人工氣候箱內，大豆低溫萌發指數和田間出苗指數呈正相關，室內萌發耐低溫的大豆品種，在田間出苗也表現較強的耐低溫性能。苗永美等[8]研究表明，黃瓜17℃相對發芽勢、相對發芽率、相對胚根長和相對活力指數與萌芽期耐冷性關系顯著，冷害指數與恢復后成活率與苗期抗冷性相關，并將黃瓜材料耐冷性分為3個等級。小豆芽期、苗期耐冷性鑒定方法研究結果表明，三葉期低溫5—8℃脅迫7 d后能夠生長正常的幼苗所占百分比可以作為小豆苗期耐冷性鑒定指標，而且小豆發芽期與三葉期耐冷性存在差異[9]。辣椒在4℃處理條件下的幼苗（4葉1心期）冷害指數和15℃條件下的發芽指數可以作為評價辣椒品種的耐低溫能力[10]。在棉花的耐低溫鑒定中，武輝等[11]通過測定低溫脅迫（5℃、12 h）及恢復處理（25℃、24 h）下棉花幼苗葉片初始熒光（Fo1）、最大光化學效率（Fv/Fm1）、氣孔導度（Gs）、可溶性糖含量（SS）、丙二醛含量（MDA）和相對電導率（REC）等6個鑒定指標，進行棉花品種耐寒性強弱的快速鑒定和預測。【本研究切入點】陸地棉是世界上重要的經濟作物和油料作物，起源于適應亞熱帶極端溫度變化的野生多年生植物[12]，然而，現代栽培種是在適宜的溫度條件下針對產量和纖維品質目標經過人工選擇下培育出來的，其抗逆性的遺傳多樣性無意中變得越來越窄[13]，研究表明，最適合棉花生長的溫度是28℃左右[14]，低溫對棉花生長的影響遠大于其他作物[15]。因此，篩選出具有抗冷性的棉花種質資源材料是目前棉花育種中的主要任務之一。棉花耐低溫研究起步比較晚，目前仍停留在低溫對棉花的影響和危害方面[16-18]以及如何進行抗寒鍛煉來提高棉花的抗冷性[19-20]；對棉花抗冷性鑒定的研究主要關注某一個時期的抗冷性[21]，棉花苗期的抗冷性鑒定指標主要限制在生理生化、光合特性等方面[11,22]。對棉花不同生育時期進行抗冷性鑒定缺少系統性、綜合性研究，生產上更是缺少抗冷性的棉花品種?！緮M解決的關鍵問題】針對棉花生育期長、抗逆性狀復雜，以及資源鑒定數量多和規模大、且材料來源于不同生態區、變異類型豐富的特點，本研究通過對棉花不同生育時期進行低溫脅迫，尋求適合萌發期、芽期、子葉期的抗冷鑒定指標，建立相應的抗冷評價體系，目的是篩選優良的抗冷種質資源，為棉花抗冷育種和抗冷機制的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

陸地棉萌發期是指棉籽吸脹后開始萌發至芽長達種子長度的1/2處這段時間。其抗冷鑒定所用材料選取4個陸地棉花品種：豫2067、sGK958、GK50、衡棉3號，驗證萌發期抗冷鑒定方法選用13份陸地棉材料：豫2067、GZ1、中棉所44、冀616、冀228、sGK958、GK50、邯242、衡棉3號、中棉所50、新研96-48、魯棉研16和中404A。

陸地棉芽期是指棉花種子萌發后至出苗這段時間，其抗冷性鑒定指標篩選所用材料：抗冷性較強的魯棉研16和冷敏感材料中404A抗。驗證芽期抗冷鑒定方法選用11份陸地棉材料：冀616、魯棉研16、中404A、中棉所44、衡棉3號、sGK958、豫2067、邯242、GZ1、冀228和GK50。

陸地棉子葉期是指種子萌發出土后從子葉平展到第一片真葉長出這段時間，其抗冷性鑒定指標的篩選所用材料為47份陸地棉花品種（系）（表1），分別來源于美國和中國的華北、華中、山東等地，來源廣泛，遺傳變異豐富。

試驗所用材料種子均來源于中國農業科學院棉花研究所，所選材料的田間農藝性狀等綜合性狀優異，抗病、抗蟲，產量能保證后續室內試驗的順利進行。試驗于2015年在中國農業科學棉花研究所完成。

1.2 陸地棉萌發期的抗冷鑒定

1.2.1 不同處理溫度的設置 棉花種子于28℃吸脹12 h后在0℃、4℃、10℃和15℃不同溫度條件下處理7 d，0℃和4℃低溫條件的獲得是冰箱處理，10℃和15℃的溫度條件由培養箱獲得，每個處理設3個重復，每個重復100粒種子，對照（CK）處理為種子吸脹12 h后直接種于恒溫滅菌沙土中（28℃、光照14 h/黑暗10 h），每個重復100粒種子。低溫脅迫的種子在28℃、光照14 h/黑暗10 h恒溫恢復生長7 d后調查其出苗情況，并直接調查對照生長7 d的出苗情況，計算子葉平展率（%）=子葉平展數/總種子數×100。

1.2.2 0℃低溫處理天數的確定 將棉花種子置于含雙層濾紙的培養皿中，28℃吸脹12 h后，將種子直接放入冰箱中分別進行0℃處理0、1、2、3、4、5、6和7 d，每個處理設3個重復，每個重復100粒種子，然后種植在恒溫滅菌沙土（28℃、光照14 h/黑暗10 h）恢復發芽7 d，調查其出苗情況，計算其子葉平展率（%）。

1.2.3 棉花種質資源萌發期抗冷性評價 將13份陸地棉材料種子于28℃吸脹12 h后直接放入冰箱進行低溫處理（0℃）4 d，未經低溫處理的設為對照（CK），每個處理設3個重復，每個重復100粒種子，然后種植在恒溫滅菌沙土（28℃、光照14 h/黑暗10 h）恢復培養發芽7 d，調查其出苗情況，計算其相對子葉平展率（%）=低溫處理后子葉平展率/CK的子葉平展率×100。

1.3 陸地棉芽期的抗冷性鑒定

1.3.1 棉花芽期抗冷性鑒定方法的確定 挑選魯棉研16和中404A飽滿一致的種子，用雙層濕濾紙于28℃左右恒溫保濕催芽，待芽長到1 cm左右時，挑選一致、發育良好的芽置入雙層濾紙的培養皿中，保濕進行4℃低溫處理，處理時間分別為0（CK）、1、2、3、4、5、6和7 d。每個處理設3個重復，每個重復50粒。將低溫處理過的芽分別種植在高溫滅菌含水量為23%的沙子里，并置于培養箱（28℃、光照14 h/黑暗10 h）中恢復生長，7 d后計算其子葉平展率（%）=子葉平展數/總芽數×100。

1.3.2 棉花種質資源芽期抗冷性評價 選用11份棉花材料在28℃恒溫下進行催芽，待芽長到1 cm左右時每個材料選取生長一致的種子150粒，分3個重復置入雙層濾紙的培養皿中進行4℃低溫處理，低溫處理0 d（CK）和5 d后，將對照和低溫處理過的種子種植在沙土中（高溫滅菌且含水量為23%左右）進行恢復生長（28℃、光照14 h/黑暗10 h），7 d后調查其子葉平展率，并計算相對子葉平展率。

1.4 陸地棉子葉期的抗冷性鑒定

1.4.1 子葉期棉花苗的培育 將高溫滅菌的沙子（含水量為23%）均勻平鋪于長19.5 cm×寬14 cm ×深5 cm的有機發芽盒中，沙子的厚度約為2 cm，將50粒棉花種子均勻平鋪于上面，并加蓋同樣濕度和厚度的沙子，加蓋保濕，置于28℃、光照14 h /黑暗10 h培養箱中進行萌發。7 d后將子葉未平展、弱苗及畸形苗拔除，留下均勻的、健壯的苗25—30棵繼續生長2 d后用于后續試驗研究。每個品種設3個重復。

1.4.2 子葉期低溫處理方法及調查方法 將1.4.1中的苗澆水后加蓋保濕。置于4℃、光照14 h/黑暗10 h培養箱中處理24 h，然后轉入28℃、光照14 h/黑暗10 h的培養箱中恢復生長7 d，并調查子葉受傷害面積，根據莖的受傷害程度，分為爛莖、斷莖和莖完好，再針對莖完好的單株調查子葉脫落情況，調查未脫落子葉的受傷害面積，記錄爛斑面積占該片葉面積比例為X，記錄總爛斑面積占總葉面積比例為Y（當只有一片子葉未脫落時，Y= X；當子葉完好時視為X=0），劃分直觀、詳細、可操作性強。根據冷害級別調查出每一個品種（系）的冷害指數，冷害指數和抗冷指數計算方法如下：

冷害指數/%=∑（級別×該級個數）/（8×總個數）×100；

抗冷指數/%=100-冷害指數。

1.4.3 陸地棉芽期和子葉期的生化指標測定方法

選取抗冷性差異顯著的2個陸地棉材料，按1.3.1的方法進行催芽和4℃低溫處理，分別選取處理不同時間的芽全長，取鮮重0.1 g左右，液氮速凍后-80℃冰箱保存備用，3個重復。按1.4.1和1.4.2的方法進行子葉期棉苗的培育及低溫處理，分別對低溫處理前（CK）和4℃低溫處理24 h后的子葉進行取樣，取鮮重0.10 g左右，液氮速凍后-80℃保存備用，3個生物學重復。

采用考馬斯亮藍G-250染色法[23]測定可溶性蛋白。采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、過氧化物酶（peroxidase，POD）活性、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性，具體操作步驟按使用說明書進行。

1.5 數據處理

用Stata 11.0軟件進行數據分析。

2 結果

2.1 陸地棉萌發期抗冷性鑒定

2.1.1 萌發期抗冷性鑒定溫度的確定 由圖1可知，15℃及以下低溫處理7 d， 28℃恢復生長7 d后的子葉平展率平均值均低于對照（28℃）處理，且隨著溫度的降低子葉平展率呈下降趨勢，表明15℃及以下低溫處理對棉花種子萌發出苗均造成傷害，溫度越低，傷害越嚴重。0℃低溫處理7 d后，4個材料間的子葉平展率差異達到極顯著，且0℃條件容易獲得，所以0℃低溫處理可以作為棉花萌發期抗冷性鑒定的合理溫度條件。

2.1.2 0℃低溫處理天數的確定 由圖1可以看出，0℃低溫處理7 d后，4個棉花品種雖然差異極顯著，但最高的出苗率也只有約28.00%，最低的還不到10.00%，平均子葉平展率為15.62%，說明0℃低溫處理7 d的時間太長，在該處理條件下，一些耐低溫能力中等的材料不容易被鑒定出來，所以應找到0℃低溫處理合適的天數。

圖1 萌發期不同溫度處理后子葉平展率Fig. 1 The percentage of cotyledon unfolding after different temperature treatments at germination stage

由圖2可以看出，隨著0℃低溫處理天數的增加，4個棉花品種在恢復正常生長7 d后的子葉平展率呈下降趨勢，說明低溫處理的時間越長，對棉花萌發的影響越大。處理4 d時，4個材料的子葉平展率差異達到極顯著，所以0℃處理4 d可以作為陸地棉萌發期抗冷性鑒定的指標。

2.1.3 棉花種質資源萌發期抗冷性評價 為進一步驗證篩選出的適合萌發期抗冷性鑒定的溫度條件，同時也為了篩選萌發期抗冷性強的種質資源，挑選綜合性狀良好的13個陸地棉品種進行萌發期抗冷性鑒定（圖3）。

13個棉花新材料在萌發期抗冷性差異達到極顯著。說明棉花萌發期經0℃低溫處理4 d后恢復生長7 d后的子葉平展率作為棉花萌發期抗冷性鑒定指標是可行的。根據研究結果可以把萌發期期抗冷性標準定為：子葉相對平展率為0—29.90%為冷敏感；30.00%—49.90%時為不抗冷；50.00%—74.90%為耐冷；75.00%—89.90%為抗冷；90.00%—100.00%為高抗冷。由圖3可以看出，13個陸地棉材中，萌發期期達到抗冷水平的棉花品種（系）有1個（冀616），占7.69%；萌發期耐冷的棉花品種（系）有7個，分別為魯棉研16、中404A、中棉所44、中棉所50、衡棉3號、sGK958、新研96-48，占53.85%，說明超過50%的棉花材料在萌發期的抗冷水平均達到中等水平。

圖2 萌發期0℃溫度處理不同天數后子葉平展率Fig. 2 The percentage of cotyledon unfolding after 0℃temperature treatment at germination period

圖3 棉花種質資源萌發期抗冷性評價Fig. 3 The evaluation of chilling resistance on cotton germplasm resources at germination stage

2.2 陸地棉芽期抗冷性鑒定

2.2.1 陸地棉芽期抗冷性鑒定方法的確定 人工模擬早春低溫天氣對陸地棉芽期進行4℃低溫冷處理，低溫脅迫1—4 d時，抗冷品種魯棉研16和冷敏感品種中404A的子葉平展率與對照相比沒有明顯變化，2個材料間差異不顯著。低溫處理5 d后，子葉平展率開始下降，隨著處理時間的延長，下降幅度變大，但抗冷品種下降速率比冷敏感品種下降慢。低溫處理5 d時，2個品種子葉平展率差別最大，達到差異極顯著水平；冷處理7 d時，抗冷品種魯棉研16的子葉平展率比對照下降了90.60%，而冷敏感品種中404A則下降了98.70%，2個品種（系）受到的傷害程度相近，均已經遭到嚴重傷害。因此，棉花芽期4℃低溫冷處理5 d后恢復正常生長7 d的子葉平展率可以作為鑒定條件來鑒定抗冷品種和冷敏感品種。

棉花芽期經過4℃低溫處理5 d后，對棉花的生長發育具有明顯的影響。與對照相比，棉芽在低溫處理以后恢復7 d正常生長后葉色變淺，失綠，有些子葉出現有黃斑，且子葉平展緩慢或不平展，也有子葉出苗即腐爛現象；莖變粗，變脆，易斷，芽尖即胚根部分受傷，重新生出側根，所以根系發育緩慢，容易產生倒根，不能成苗，側根發生能力強的材料，相對應的子葉平展比較高，所以耐低溫能力比較強。

2.2.2 陸地棉種質資源芽期抗冷性評價 利用Stata11.0對11個棉花材料（4℃冷處理5 d后恢復7 d正常生長）的相對子葉平展率進行分析和觀察（圖4），結果表明，11個棉花材料芽期的抗冷性差異達到了顯著。因此，棉花芽經4℃低溫處理5 d后恢復生長7 d的子葉平展率作為棉花芽期抗冷性的鑒定指標是可行的。將棉花芽期抗冷性的鑒定標準設定為：相對子葉平展率0—29.90%為冷敏感；30.00%—49.90%為不抗冷；50.00%—74.90%為耐冷；75.00%—89.90%為抗冷；90.00%—100.00%為高抗冷。11份陸地棉材中，芽期耐冷的棉花材料有4份，分別為豫2067、GK50、魯棉研16和中棉所44，占總材料的36.36%；不抗冷的材料有5份，占45.45%；冷敏感材料有2份，占18.18%。芽期沒有篩選到高抗冷和抗冷的材料。

2.3 陸地棉子葉期抗冷性鑒定

2.3.1 陸地棉子葉期低溫處理后葉片冷害級別劃分由圖5可以看出，4℃低溫處理24 h后，不同材料間的冷害差異顯著。由子葉受傷害的面積可將子葉期冷害劃分為8個級別（表2）。根據抗冷指數，將陸地棉子葉期的抗冷性劃分為5個等級：抗冷指數為0—29.90%時為冷敏感；30.00%—49.90%為不抗冷；50.00%—74.90%為耐冷；75.00%—89.90%為抗冷；90.00%—100.00%為高抗冷。

圖4 棉花種質資源芽期抗冷性評價Fig. 4 The evaluation of chilling resistance on cotton germplasm resources at budding stage

圖5 陸地棉子葉期低溫處理后葉片冷害級別圖示Fig. 5 The diagram of chilling injury level after low temperature treatment at cotyledon stage

表1 棉花種質資源子葉期抗冷性評價Table 1 The evaluation of chilling resistance on cotton germplasm resources at cotyledon stage

表2 陸地棉子葉期葉片冷害級別Table 2 The level of chilling injury at cotyledon stage

2.3.2 棉花種質資源子葉期抗冷性評價 由表1可以看出，47份陸地棉材料的子葉期抗冷性差異顯著，抗冷指數由14.29%—86.35%不等，平均抗冷指數為51.60%。47份陸地棉種質資源材料中，子葉期抗冷的材料有7份，分別為邯鄲109、豫2067、創棉22、冀雜3268F6、中棉所44、中404A抗-13和光籽2，占總鑒定材料的12.77%；耐冷的有15份，占31.91%，不抗冷或冷敏感的有25份，占53.19%，沒有高抗冷的材料。因此，用4℃低溫處理24 h鑒定陸地棉子葉期抗冷性是可行的。在北方高緯度長期種植篩選馴化過程中，陸地棉中有部分材料已經擁有了一定的抗冷性（12.77%），但是對于子葉期的棉花來說，有高于50%的材料還是不抗冷或冷敏感（53.19%），培育出高抗冷材料還需要長期的努力。

2.4 不同生育時期陸地棉抗冷差異

不同棉花材料在不同生育時期的抗冷性表現存在差異性（表3）。魯棉研16、中棉所44在3個時期抗冷相對一致，均表現出耐冷或抗冷，其萌發期相對子葉平展率74.81%和64.22%，芽期子葉平展率60.24%和51.52%，而子葉期的抗冷指數為67.86%和85.27%；邯242、GZ1、冀228在萌發期、芽期和子葉期均表現出不抗冷，說明魯棉研16、中棉所44、邯242、GZ1、冀228在不同生育時期的抗冷性是一致的；中404A和衡棉3號在萌發期均表現耐冷，在芽期和子葉期卻不抗冷或冷敏感；豫2067在萌發期不抗冷，而在芽期和子葉期分別為耐冷和抗冷。sGK958是在萌發期和子葉期均耐冷，芽期不抗冷；GK50則相反，在萌發期和子葉期分別表現為冷敏感和不抗冷，在芽期卻表現為耐冷，說明同一材料在不同時期的抗冷性存在差異。

2.5 低溫脅迫對陸地棉芽期抗氧化酶活性的影響

由圖6-A可知，隨著4℃低溫處理時間的延長，與對照相比，抗冷材料豫2067芽的SOD酶活性呈略微上升趨勢，至4 d時達到最高，然后下降，至處理5 d時下降到最低后趨于平穩狀態；而冷敏感材料衡棉3號的芽在低溫處理1 d時開始下降，2 d時下降到最低，隨后3 d時又迅速上升后趨于平穩。

隨著4℃低溫處理時間的延長，與對照相比，抗冷材料豫2067芽的POD酶活性迅速上升，在冷處理1和3 d時達到最大值，在冷處理4 d時又迅速下降到最低，然后平穩緩慢上升；而冷敏感材料衡棉3號的芽在低溫處理1 d時開始下降，3 d時下降到最低，隨后4 d時上升，6 d時達到最高值，低溫冷處理7 d時又開始下降。總之，抗冷材料先于冷敏感材料達到最高值，后于冷敏感材料達到最低值（圖6-B）。

隨著4℃低溫處理時間的延長，與對照相比，抗冷材料豫2067和冷敏感材料芽的CAT酶活性均先上升后下降，其中，豫2067在冷處理2 d時上升到最大，3 d時又迅速下降到最低，衡棉3號在冷處理1 d時上升到最大，然后迅速下降，冷處理4 d時下降到最小，然后2個材料的CAT酶活又開始上升，抗冷材料豫2067在冷處理后期芽的CAT酶活一直高于冷敏感材料衡棉3號，至7 d時兩者酶活又趨于接近狀態（圖6-C）。

圖6 低溫脅迫對陸地棉芽期抗氧化酶活性的影響Fig. 6 Effects of low temperature stress on the activity of antioxidant enzymes at the budding stage of upland cotton

2.6 低溫脅迫對陸地棉芽可溶性蛋白含量的影響

在低溫處理的早期，陸地棉芽的可溶性蛋白比對照略微下降（圖7），冷處理3 d時下降到最小，其中，冷敏感材料衡棉3號比抗冷材料豫2067下降速度快，2個材料芽的可溶性蛋白在冷處理后期又呈上升趨勢，其中，抗冷材料豫2067比冷敏感材料衡棉3號上升速度快，且于冷處理5 d時達到最大，而衡棉3號在冷處理4 d時可溶性蛋白達到最大，冷處理7 d時2個材料又趨于一致。在冷處理后期，抗冷材料的可溶性蛋白含量均高于冷敏感材料。

首先要合理配置審計模擬實訓課程的課時，要對現有開設的幾門審計理論課程重復的內容進行歸并和調整，從而相應的增加審計模擬實訓的課時，理想的審計實訓課時應該占據審計總教學課時的半壁江山，這是因為審計是一門理論性和實踐性都很強的學科，重視理論聯系實踐，實行理實一體化的教學模式，不但能激發學生學習熱情，并且能夠使學生在實踐中加深對理論的理解，同時有利于培養學生的職業能力和職業素養；另一方面審計模擬實訓教學面廣量大，系統性和綜合性強，只有充足的課時才能保質保量地完成審計實訓的任務，實現審計模擬實訓目標。

表3 棉花萌發期與子葉期抗冷性比較Table 3 The comparison of cotton chilling resistance among germination stage, budding stage and cotyledon stage

圖7 低溫脅迫對陸地棉芽可溶性蛋白含量的影響Fig. 7 Effects of low temperature stress on the soluble protein content at the budding stage of upland cotton

2.7 低溫脅迫對陸地棉子葉抗氧化酶活性和可溶性蛋白的影響

由表4可以看出，陸地棉子葉期的子葉經過4℃低溫處理24 h后，與對照相比，抗冷材料豫2067的 SOD酶活、POD酶活、CAT酶活均下降，而冷敏感材料衡棉3號的3種酶活均上升；而抗冷材料豫2067子葉的可溶性蛋白含量升高，冷敏感材料衡棉3號子葉的可溶性蛋白含量下降11.56%。

表4 低溫脅迫對陸地棉子葉抗氧化酶活性和可溶性蛋白的影響Table 4 Effects of low temperature stress on the activity of antioxidant enzymes and the soluble protein content of the cotyledon of upland cotton

3 討論

低溫冷害是棉花不同生育時期經常發生的自然災害，每一次低溫冷害都會造成不同程度的棉花減產及品質降低。選用抗冷品種是減輕低溫冷害最經濟有效的措施。對棉花種質資源進行有效的抗冷鑒定、篩選與利用是抗冷育種的基礎。本試驗針對棉花不同生育時期對低溫反應的差異，提出了不同的抗冷鑒定方法和評價指標，有利于對棉花進行系統的抗冷鑒定。

3.1 棉花不同生育時期抗冷性鑒定和抗冷指標的篩選

植物的抗冷性是植物對低溫環境的適應能力，包括植物對低溫逆境的耐受能力，和逆境解除后恢復生長的能力。本研究表明，棉花種子的萌發能力隨著溫度的降低而下降，0℃處理4 d，28℃條件下恢復正常生長7 d的相對子葉平展率可以作為萌發期的抗冷鑒定指標。與菠菜[24]、辣椒[10]、玉米[25]萌發期抗冷鑒定采用發芽指數作為評價指標不同，在棉花的萌發期和芽期的抗冷鑒定中，不采用萌發指數或出苗率作為評價指標，是因為在試驗的過程中發現，有的棉苗雖然萌發出土，卻遲遲不能子葉平展，剝開種皮后看到，其子葉大多已枯爛，不能成苗，可能是由于子葉在低溫處理過程中受到了嚴重傷害，雖能出苗，但子葉不能平展，不能繼續進行光合作用，不能長大成苗，所以本研究以恢復正常溫度后的子葉平展率作為萌發期和芽期抗冷性評價指標。

前人在農作物的苗期抗冷鑒定研究中，大多將低溫處理后的死苗率作為作物耐冷性鑒定指標，如水稻[26]。而在棉花苗期抗冷鑒定中發現，棉花在子葉期受到4℃低溫處理24 h后，雖然有的棉花材料能看到明顯的傷害，但是很多材料看不到明顯傷害，且材料間差異不明顯，只有等到恢復生長后才能看到材料間受傷害的差異，所以用低溫處理后恢復正常生長7 d后的抗冷指數作為鑒定指標來區分抗冷性有差異的材料是可行的。不同材料間棉苗受到低溫傷害程度不同，極少一部分會出現死苗會現象，其他大部分只是受傷害程度不同，所以用死苗率來評價棉花苗期的抗冷性不容易區分不同材料的抗冷性。本試驗采用苗期子葉受低溫傷害面積計算出冷害指數，再換算成抗冷指數，分級詳細，直觀明白，容易判斷，易于操作，容易區分不同抗冷級別的材料。

3.2 棉花不同生育期抗冷性存在差異性

不同棉花材料在不同的生育時期抗冷性有的一致，有的不一致，說明棉花種質材料抗冷性具有多樣性，具有豐富的遺傳基礎。

3.3 低溫脅迫后棉花不同生育時期的生化反應

低溫脅迫對植物的傷害與細胞內氧化系統的傷害有關[29-31]，另一方面，高等植物通過形成包括SOD、POD、CAT等抗氧化酶等清除活性氧系統來抵抗低溫的脅迫[32]。在受低溫脅迫的前期，陸地棉芽期抗冷材料的SOD酶活和POD酶活高于冷敏感材料的酶活；在低溫脅迫的后期，陸地棉芽期抗冷材料的CAT酶活和可溶性蛋白含量高于冷敏感材料。說明抗冷性強的棉花芽期在受低溫持續脅迫的過程中，不同的抗氧化酶在清除棉花體內活性氧的過程中相互協調、交替起作用；在受低溫脅迫的后期，抗冷性強的棉花材料通過積累比較多的可溶性蛋白來抵御低溫脅迫。

4℃低溫處理24 h后的抗冷材料豫2067子葉中SOD酶活力、POD酶活力、CAT酶活力低于對照，可溶性蛋白含量卻高于對照，冷敏感材料的3種抗氧化酶活和可溶性蛋白含量卻相反，因此，推測棉花子葉期抗冷能力與葉片的抗氧化酶活性關系不大，可能與葉片的可溶性蛋白含量有關系。這與GUO等[33]在水稻品種的抗冷能力與抗氧化酶活性的研究結果不同，據GUO等報道，水稻的抗冷性與水稻面對低溫脅迫抗氧化能力密切相關。本研究結果與在黃瓜中的研究結果相似，據苗永美等[8]報道，黃瓜耐冷性與超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）過氧化氫酶（CAT）等沒有相關性。據報道，可溶性蛋白含量的高低可用來評價植物的抗冷能力[34]，與本研究中抗冷性棉花材料苗期受低溫脅迫后可溶性蛋白的含量升高且高于冷敏感材料的結果相一致。說明棉花的抗冷性是一個復雜的性狀，將從分子水平進一步探討棉花的抗冷機制。

4 結論

棉花不同的生育時期應有相應的抗冷性鑒定標準。0℃處理4 d，28℃條件下恢復正常生長7 d的相對子葉平展率可以作為萌發期的抗冷鑒定指標；4℃處理5 d，28℃條件下恢復正常生長7 d的相對子葉平展率可以作為芽期的抗冷鑒定指標；4℃處理24 h，28℃條件下恢復正常生長7 d的抗冷指數可以作為子葉期的抗冷鑒定指標?？估湫詮姷拿藁ㄑ科谠谑艿蜏爻掷m脅迫的過程中，不同的抗氧化酶在清除棉花體內活性氧的過程中相互協調、交替起作用，可溶性蛋白含量的高低與棉花苗期抗冷能力有一定相關性。

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（責任編輯 李莉）

Identification of the Chilling Resistance from Germination Stage to Seedling Stage in Upland Cotton

WANG Jun-juan, WANG De-long, YIN Zu-jun, WANG Shuai, FAN Wei-li, LU Xu-ke, MU Min, GUO Li-xue, YE Wu-wei, YU Shu-xun
(Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology/Key Laboratory for Cotton Genetic Improvement, Ministry of Agriculture, Anyang 455000, Henan)

【Objective】 Low-temperature is one of the main factors affecting the normal growth and development of cottonplants. Identification of chilling resistance of cotton is the prior condition for the mechanism of cold resistance, which also can provide certain theoretical

for cold resistance breeding. 【Method】 The temperature conditions for cotton cold resistance identification were screened at germination stage following 7 d recovery at normal conditions (28℃, day/night, 14 h/10 h) after 7 d treatment at different low temperatures of 0℃, 4℃, 10℃, 15℃ with 4 upland cotton varieties (lines) with different cold resistance levels. Screening of days of cold resistance identification for 0℃ low-temperature treatment at germination stage was performed by 7 d recovery after the respective treatments of 1, 2, 3, 4, 5, 6, and 7 d under 0℃ low temperature. Two upland cotton varieties (lines) with different cold resistance levels was treated for 1, 2, 3, 4, 5, 6, and 7 d under 4℃ low temperature and recovered 7 d in order to evaluate cold resistance of cotton at budding stage. Evaluation of cold resistance of cotton at cotyledon stage was carried out at 4℃for 24 h and normal growth was recovered for 7 d with 47 cotton varieties. The biochemical indexes of bud and cotyledon under low temperature were measured at budding and cotyledon stages with the reagent kit developed by Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. 【Result】 The study established the standards of identification of cold-resistance by screening the stress conditions at different growth periods, including germination stage, budding stage and cotyledon stage. The relative cotyledons unfolding rate under normal condition growth for 7 d after 0℃ treatment for 4 d can be served as a cold resistance identification index of germination stage. The relative cotyledons unfolding rate under normal condition growth for 7 d after 4℃ treatment for 5 d can be used as chilling resistance identification index of the budding stage. Chilling resistance index under normal condition growth for 7 d after 4℃ treatment for 24 h can be used for evaluating the chilling resistance of cotton at cotyledon stage. The activities of SOD and POD in the bud of cold-resistant variety Yu2067 were increased at the early stage of low-temperature treatment and then decreased to a steady, while the activities of two enzymes in the bud of chilling-sensitive cotton line Hengmian No.3 decreased at first and then increased to steady. The activity of CAT in the bud of two varieties all showed a uptrend at first and then downtrend, but the activity of CAT in Yu2067 was always higher than that in Hengmian No.3 at later stage of low-temperature treatment. Besides, the soluble protein contents in the bud of two varieties were similar at first, but the content in Yu2067 started to be higher than that in Hengmian No.3 at later stage of low-temperature treatment. After the treatment of 4℃ for 24 h at cotyledon stage, the activities of SOD, POD and CAT were all showed a down-trend in Yu2067 while they all went up in Hengmian3. But the soluble protein content in Yu2067 went up while declined in Hengmian No.3. 【Conclusion】 Specific identification ways are needed at different growth stages correspondingly. The standards of identification of cold-resistance levels at different stages are different. Different materials have different cold resistance at different growth stages. Based on the variation trends of enzyme activity of three enzymes, it was speculated that the cold-resistance of cotton at budding stage had relation with antioxidant enzymes activity, while the cold-resistance of cotton at cotyledon stage had little relation with three antioxidant enzyme activities, but may be closely with the soluble protein content.

Gossypium hirsutum L.; growth stages; cold resistance; identification ways; biochemical characteristics

2016-02-18；接受日期：2016-04-11

國家現代農業產業技術體系（CARS-18-02A）

聯系方式：王俊娟，Tel：15093920872；E-mail：wjj2004liyuan@sina.com。通信作者喻樹迅，Tel：0372-2562201；E-mail：ysx195311@163.com