西瓜抗枯萎病相關基因ClMYB轉錄因子的克隆及表達分析

韓金桓，王麗霞，高洪波, 呂桂云

（河北農業大學園藝學院，河北保定071001）

西瓜抗枯萎病相關基因ClMYB轉錄因子的克隆及表達分析

韓金桓，王麗霞，高洪波, 呂桂云

（河北農業大學園藝學院，河北保定071001）

【目的】克隆西瓜抗枯萎病相關基因ClMYB轉錄因子，進行生物信息學及表達模式分析，為進一步解析ClMYB在西瓜抗枯萎病機制中的作用提供理論依據?！痉椒ā扛鶕鞴吓c枯萎病菌不親和互作的抑制差減文庫和Microarray數據分析，獲得與西瓜抗枯萎病相關的基因ClMYB，采用RT-PCR技術分離克隆ClMYB cDNA全長序列；應用生物信息學方法分析該基因的保守結構域及序列特征；使用MEGA5.0對ClMYB蛋白序列及其同源序列進行多序列比對，并構建同源物種間系統進化樹；采用GFP標記的方法進行亞細胞定位，分析編碼蛋白表達位置；將該基因片段通過Nde I和Xba I雙酶切連接至原核表達載體pCzn1，重組質粒轉化至大腸桿菌Arctic Express，經終濃度為0.5 mmol·L-1IPTG誘導4 h，用SDS-PAGE分析融合蛋白的表達；利用實時熒光定量PCR方法檢測目的基因在西瓜與枯萎病菌互作中及在茉莉酸（jasmonate，JA）誘導下的表達情況?！窘Y果】利用RT-PCR方法從西瓜野生材料PI296341-FR根系組織中克隆該基因片段（GenBank：KT751229），序列比對及生物信息學分析表明，其基因編碼的氨基酸序列具有MYB轉錄因子R2R3型的典型特征，其N端具有R2、R3兩個MYB結構域，C端高度變異。多序列比對及進化樹分析表明，該基因編碼的蛋白與甜瓜MYB（GenBank：XM_008440304）和黃瓜MYB（GenBank：XM_011652633）同源性最高，其編碼的氨基酸一致性達到86%，這與它們同屬葫蘆科植物有關；亞細胞定位顯示ClMYB定位于細胞核，為典型的轉錄因子；成功構建了該基因的原核表達載體pCzn1-ClMYB，轉化至大腸桿菌得到36 kD左右蛋白；ClMYB受枯萎病菌誘導，在高抗枯萎病菌材料PI296341-FR中，相對感病品種表達量高峰出現的早，且表達量高。50 μmol·L-1的MeJA處理可以顯著提高感病材料Black diamond對枯萎病的抗病水平，同時誘導ClMYB表達，與抗病材料PI296341-FR相比表達趨勢一致，但表達量更高?！窘Y論】ClMYB為典型的R2R3-MYB轉錄因子，亞細胞定位于細胞核中；基因的原核表達得到36 kD的融合蛋白，在西瓜中的表達受枯萎病菌和茉莉酸誘導，推測ClMYB可能參與JA介導的西瓜抗枯萎病防衛反應的信號通路，在西瓜抗病中起一定的作用。

西瓜；枯萎病；ClMYB轉錄因子；基因克隆；表達分析

0 引言

【研究意義】西瓜（Citrullus lanatus）是世界第五大水果，中國西瓜的栽培面積、總產量與人均消費量均居世界首位，在高效農業中占有重要地位。西瓜枯萎病是由半知菌亞門鐮孢屬尖鐮孢（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）寄生引起的一種真菌土傳病害，是世界范圍內導致西瓜產量和品質降低的最嚴重障礙，病田一般減產20%—30%、嚴重田塊可達50%—60%，甚至絕產[1]。野生西瓜材料PI296341-FR（Citrulls lanatus var. citrodes）是國際上公認的抗枯萎病菌3個生理小種的抗源[2]。在前期研究中，通過抑制差減文庫和Microarray技術從PI296341-FR篩選出參與西瓜抗枯萎病響應的轉錄因子ClMYB和茉莉酸代謝途徑[3-4]。明確ClMYB、茉莉酸（JA）與西瓜抗枯萎病的關系及其調控抗性反應途徑，對解析該基因調控西瓜抗病性的機理和西瓜枯萎病的可持續控制具有重要的理論和實際意義?！厩叭搜芯窟M展】MYB在植株中的過表達能夠顯著提高植物的抗病能力，并具有一定的廣譜效應。YANG等[5]從煙草中分離到一個TMV誘導基因NtMYB1，外源水楊酸（SA）可迅速誘導該基因表達，并且先于PR21的誘導，該基因編碼蛋白可與PR21基因啟動子中的MYB結合位點特異性結合，從而調節PR21的表達。在擬南芥和煙草中過量表達AtMYB30，可以看到轉基因植株對不同的病原細菌表現過敏反應（HR）或類似過敏反應，并能增強對多種細菌和煙草蛙眼病菌（Cercospora nicotianae）的抗性。在反義表達AtMYB30的擬南芥株系中，能強烈抑制對不同病原細菌的抗性和HR細胞死亡反應，HR和防衛反應相關基因的表達也發生改變[6]。這些結果表明，AtMYB30是過敏性細胞死亡的正向調節子。AtMYB15與煙草（Nicotiana tabacum）的NtMYB2高度相似，它們能被創傷和調控PR基因表達的激發子誘導[7]。反義表達MYB72的株系在受到不同病原物侵染時無法形成ISR，表明MYB72作為一個新的ISR信號傳導成員是建立廣譜ISR所必需的[8]。偃麥草中的R2R3-MYB基因TiMYB2R-1過量表達可增強小麥和其他谷類作物對全蝕病的抗性[9]，另一種R2R3-MYB基因TaPIMP1則表現出對小麥青枯病菌（Ralstonia solanacearum）病原體的抗性[10]。擬南芥MYB蛋白AtMYB30與黃單胞桿菌Ⅲ型效應子XopD互作，通過翻譯后修飾來調控植物抗病性[11]。從華東葡萄中克隆的VpMYBR1能夠提高轉基因植株白粉病的抗性[12]?！颈狙芯壳腥朦c】MYB轉錄因子是植物中最大的轉錄因子之一，在植物生長發育及抗逆境脅迫過程中發揮著極其重要的作用，已在擬南芥[6-8]、煙草[5]、偃麥草[8,11]、玉米[13]等多個植物抗病性方面得到證實。筆者課題組在西瓜中也檢測到和枯萎病相關MYB有cluster133Contig1、08081903T1O_95_G12、cluster377Contig1，利用Microarray進一步分析發現，其中08081903T1O_95_ G12 在西瓜與枯萎病菌的非親和互作前期中顯著上調表達[3-4]。李猷等[14]在西瓜與枯萎病非親和互作篩選出相關的MYB基因CH235。但這些相關的MYB都是初步篩選出的EST序列，在西瓜抗枯萎病研究中尚未見MYB轉錄因子克隆的報道。【擬解決的關鍵問題】在08081903T1O_95_G12序列的基礎上，通過克隆西瓜ClMYB轉錄因子基因，對其序列進行生物信息學分析、通過亞細胞定位和原核表達，同時利用qRT-PCR檢測該基因在不同抗性品種及JA處理下的表達模式，為深入解析該基因調控西瓜抗枯萎病性應答反應的分子機理提供理論基礎。

1 材料與方法

試驗于2014—2015年在河北農業大學園藝學院進行。

1.1 材料

以高抗枯萎病菌生理小種1 的野生西瓜種質PI296341-FR，高感枯萎病菌西瓜品種Black diamond為材料；病源材料枯萎病菌生理小種1（race1）采自北京市通州區西瓜枯萎病病株，由北京市農林科學院蔬菜研究中心許勇研究員惠贈。

限制性內切酶、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）、10×PCR Buffer、dNTPs、Taq酶、蛋白質Marker、T4DNA連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；pCzn1載體、TOP10菌株、Arctic Express菌株、IPTG、SDS購自鐘鼎生物公司；RNAprep Pure Plant Kit（Polysaccharides &Polyphenolics-rich）試劑盒、FastQuant RT Kit with gDNase試劑盒、質粒小提中量試劑盒購自北京天根公司；DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試材培養 枯萎病菌人工接種采用浸根接種法，待西瓜幼苗2—3片真葉時，用枯萎病菌孢子懸浮液濃度為5×106個孢子/mL浸根15 min，中間搖動2—3次，防止孢子沉降。浸根完成后，定植到營養缽中，同時設立對照，接種清水。用50 μmol·L-1濃度茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）分別均勻噴灑于PI296341-FR和Black diamond葉片表面，以清水噴灑的為對照。接種后在溫室26—30℃條件下培養，根據發病進程統計病情指數=Σ（病級株數×代表數值）× 100/調查總數×發病最重級的代表數值。處理后 0、6、12、24、48、72 h分別采集各組西瓜根系組織液氮凍存。用RNA提取試劑盒提取西瓜總RNA，按FastQuant RT Kit with gDNase試劑盒說明進行反轉錄。

1.2.2 ClMYB克隆 以野生西瓜材料PI296341-FR接種西瓜枯萎病菌后0、6、12、24、48、72 h根系組織各時間點總RNA等量混合物的反轉錄產物為模板，根據筆者課題組前期對抑制差減文庫和Microarray數據分析得到的與枯萎病相關08081903T1O-95-G12 EST序列，設計分別帶Xba I和Sma I酶切位點的上下游引物T-F：5′-GCTCTAGA GCATGGTGAGAGCTCC TTGTTGTGAGA-3′（下劃線表示引入的Xba I酶切位點），T-R：5′-TCCCCCGGGTCCAAATACAGGGTCAT TTGGCGACCCA-3（′下劃線表示引入的Sma I酶切位點），克隆該基因。PCR體系為：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5）4 μL，Taq酶0.25 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，cDNA 1.25 μL，ddH2O補齊至25 μL。PCR程序為：94℃變性3 min，然后94℃30 s，60℃30 s，72℃2 min共35個循環，最后72℃延伸10 min，4℃保溫。經2%瓊脂糖凝膠電泳，回收目標片段，克隆至pMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH5α，篩選出陽性克隆進行測序，測序正確的克隆命名為T-ClMYB，獲得目的基因序列命名為ClMYB（GenBank：KT751229）。

1.2.3 ClMYB序列的生物信息學分析 利用NCBI Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行同源性分析；利用ExPASy ProtParam（http://expasy.org/ tools/pi_tool.html）進行蛋白理化性質進行預測；利用SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat. pl）在線軟件進行蛋白質二級結構預測；采用DNAMAN軟件進行氨基酸多序列比對分析；系統進化樹采用MEGA5.0軟件構建。

1.2.4 ClMYB蛋白的亞細胞定位 對1.2.2獲得克隆T-ClMYB提取質粒，與PYBA1332-GFP（北京市農林科學院張春秋博士惠贈）分別經Xba I和Sma I雙酶切，回收目的片段并用T4 DNA連接酶過夜連接，構建ClMYB融合表達載體，轉化大腸桿菌DH5α，篩選出陽性克隆并進行測序驗證。

分別用70%乙醇和滅菌蒸餾水清洗金粉，再加入無水乙醇制成金粉懸浮液，再順序加入質粒、氯化鈣、亞精胺振蕩。取10 μL懸浮液加到基因槍中，基因槍PDS-1000He型轟擊時真空度26 mmHg，可裂膜壓力1 100 psi。將轟擊好后的洋蔥表皮放于25℃中暗培養24 h。然后于激光共聚焦顯微鏡在488 nm波長下觀察GFP在洋蔥表皮細胞內的表達情況。

1.2.5 pCzn1-ClMYB原核表達載體質粒構建及表達根據ClMYB cDNA序列設計分別帶Nde I和Xba I酶切位點的上下游引物pCzn1-F：5′-CATATG GTGAGA GCTCCTTGTTGTGAGAA-3′（下劃線表示引入的Nde I酶切位點），pCzn1-R：5′-TCTAGA AAATACAGGGT CATTTGGCGACCCA-3′（下劃線表示引入的Xba I酶切位點），克隆該基因，將獲得的目的片段PCR產物純化后用Nde I和Xba I雙酶切，在T4 DNA連接酶的作用下將目的片段連接至以相同酶切后回收的pCzn1載體上，16℃過夜連接。將連接產物轉入大腸桿菌DH5α，篩選出陽性克隆進行測序。構建成功的表達載體質粒命名為pCzn1-ClMYB。將構建成功的表達載體質粒pCzn1-ClMYB，轉化至表達菌株大腸桿菌Arctic Express，經50 μg·mL-1氨芐抗性篩選，挑取轉化平板上的單克隆接種至含50 μg·mL-1氨芐的LB液體培養基中，37℃振蕩培養至OD600為0.6—0.8，以終濃度為0.5 mmol·L-1的IPTG在37℃條件下誘導表達4 h，以不加IPTG誘導的pCzn1-ClMYB作為對照。誘導完成后，MYB-His包涵體經過變復性的方式，重溶目標蛋白，通過Ni柱親和純化獲得目標蛋白，進行12% SDS-PAGE分析。

1.2.6 基因表達分析 采用real-time PCR分析不同處理后基因的表達情況，以18S rRNA為內參，反應引物如表1（18S rRNA，qClMYB），按照SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ使用說明進行。每個樣品設有3次重復。反應條件為：95℃預變性30 s，95℃變性5 s， 52℃復性30 s，72℃延伸30 s，變性到延伸循環40次；END（熔解曲線）：95℃ 15 s，60℃15 s，熒光檢測20 min，95℃15 s。采用2-△△CT法分析結果。

表1 ClMYB表達分析所用引物Table 1 Primers for expression analyses of ClMYB

2 結果

2.1 ClMYB DNA、cDNA序列的克隆與分析

ClMYB DNA序列全長955 bp，cDNA序列全長792 bp，開放閱讀框編碼263個氨基酸殘基。對其DNA和cDNA序列分析表明，該基因在其起始密碼子后第134、388位核苷酸處分別插入一段長74、89 bp的內含子，蛋白保守結構域預測發現，其N端第13—63、66—114位分別具有R2、R3兩個MYB結構域（圖1），該結構域是R2R3型MYB家族基因所特有的，推測該基因是R2R3型MYB轉錄因子。根據ProtParam預測顯示，ClMYB蛋白的理論分子量為30.5 kD，理論等電點為6.22，分子式為C1371H2O53N373O400S10，酸性氨基酸殘基總數為37，堿性氨基酸殘基總數為33，脂肪系數為61.52，平均親水性為-0.763，預測為親水性蛋白，不穩定指數為50.96，預測該蛋白為不穩定蛋白。

根據SOPMA在線軟件預測ClMYB蛋白的氨基酸序列的二級結構包括α-螺旋、β-轉角、無規則卷曲、延伸鏈。其中構成無規則卷曲的氨基酸數最多為108個，百分比為41.06%。α-螺旋和延伸鏈次之，分別為34.22%和15.97%。β-轉角所占比例最少，僅為8.75%（圖2）。

圖1 ClMYB蛋白保守結構域Fig. 1 The predicted conservative domains of ClMYB protein

圖2 ClMYB蛋白的二級結構預測Fig. 2 Predicted secondary structure of ClMYB protein

2.2 ClMYB編碼氨基酸序列比對及系統進化樹

將ClMYB的氨基酸序列與黃瓜（Cucumis sativus，XM_011652633）、甜瓜（Cucumis melo，XM_008440304）、煙草（Nicotiana tabacum，XM_009633531）、百脈根（Lotus japonicus，BT145262）、山崳（Eutrema，XM_006405998）、醉蝶花（Tarenaya hassieriana，XM_010534986）、葡萄（Vitis vinifera，NM_001281203）、花生（Arachis hypogaea，KF208656）、甜菜（Beta vulgaris，XM_010676764）、大豆（Glycine max，XM_006573119）、油棕（Elaeis guineensis，XM_010918867）、海棗（Phoenix dactylifera，XM_008788388）12個物種中含有MYB結構域蛋白基因的氨基酸序列比對。分析顯示，ClMYB與甜瓜、黃瓜等氨基酸序列相似性分別達到80%以上（圖3）。利用MEGA5.0軟件將ClMYB氨基酸序列與上述12個物種的MYB氨基酸序列進行聚類分析（圖4），油棕和海棗被聚為一類，可能與它們同屬于單子葉植物有關。ClMYB與甜瓜和黃瓜MYB基因被聚在一類，說明這可能與它們同屬于葫蘆科植物有關。

2.3 ClMYB的亞細胞定位

利用基因槍將構建好的重組質粒PYBA1332-GFP/ClMYB轉入洋蔥表皮細胞內，25℃暗培養24 h后制片，激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察。結果顯示，在轉化空載體PYBA1332-GFP的洋蔥表皮綠色熒光分布整個細胞包括細胞膜、細胞質以及細胞核中（圖5-A），說明沒有目的基因空載是可以在細胞的細胞膜、細胞質以及細胞核中表達。而轉化PYBA1332-GFP/ClMYB載體的洋蔥表皮細胞內只有細胞核上有綠色熒光信號（圖5-B），表明ClMYB蛋白定位于細胞核，為典型的轉錄因子蛋白。

2.4 pCzn1-ClMYB原核表達載體構建及表達

將ClMYB與原核表達載體pCzn1連接，得到融合表達載體pCzn1-ClMYB，經Nde I+ Xba I雙酶切鑒定，得到798 bp 的目的片段（圖6），測序結果表明無堿基突變，重組質粒構建成功。將重組質粒pCzn1-MYB轉化大腸桿菌Arctic Express，經終濃度為0.5 mmol·L-1的IPTG在37℃條件下誘導表達4 h后進行SDS-PAGE電泳分析。結果表明，重組質粒pCzn1-ClMYB誘導產物出現一條特異蛋白帶，未誘導表達及誘導上清液沒有融合蛋白的表達（圖7），則目標蛋白主要存在于包涵體中。融合蛋白純化后蛋白理論分子量為36 kD左右（含His-tag）（圖8），與預測的ClMYB蛋白分子量30.5 kD相近。

2.5 ClMYB在不同抗性材料上接種枯萎病菌后的表達分析

不同抗性材料接種枯萎病菌后ClMYB表達量有顯著差異，根部表達量在高抗枯萎病菌材料PI296341-FR中接菌6 h后達到最大值，達到接種前原始表達量的7.2倍。高感枯萎病菌材料Black diamond中接菌24 h后達到最大值，達到接種前原始表達量的2.2倍，PI296341-FR ClMYB的根部表達量明顯高于Black diamond（圖9）。在接種處理后13 d后，PI296341-FR病情指數為2.67，Black diamond病情指數為87.75。

2.6 MeJA處理對ClMYB表達影響

MeJA處理Black diamond和PI296341-FR后，ClMYB對MeJA處理產生響應表達趨勢一致，但表達量差異顯著。Black diamond分別在接種后6和48 h出現ClMYB表達高峰，表達量分別是對照的15和11倍，而PI296341-FR在接種后6 和48 h出現表達高峰，表達量分別是對照的4和6.2倍（圖10）。接種處理13 d后，PI296341-FR無MeJA處理的病情指數為2.67，MeJA處理后病情指數為1.28；而Black diamond無MeJA處理的病情指數為87.75，MeJA處理后病情指數為19.44。

圖3 ClMYB氨基酸序列與其他物種序列多重比對Fig. 3 Aligments of the deduced amino acid sequence of ClMYB from other MYB proteins

圖4 ClMYB與其他MYB 蛋白的系統進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of ClMYB and some other MYB proteins

圖5 ClMYB亞細胞定位分析Fig. 5 Subcellular localization of ClMYB protein in onion epidermal cells

3 討論

R2R3亞類MYB轉錄因子主要參與次生代謝調節[15]、控制細胞的分化[16]、應答激素的刺激[17]及抵御外界脅迫和病原菌的侵染[18]。本研究對克隆的ClMYB序列分析發現，該基因含有兩個MYB結構域，編碼263個氨基酸殘基的蛋白，屬于典型的R2R3類型的MYB轉錄因子家族的成員。在擬南芥中，根據內含子在MYB 蛋白的BRH（the region between the conserved DNA-recognitionhelix）的插入位點的不同，將MYB 蛋白被分為A、B、C 3大類，其中A類MYB蛋白在BRH處沒有插入內含子；B類MYB蛋白在BRH 的R3 處插入一個內含子；C類MYB蛋白占擬南芥蛋白的85%，主要參與苯丙烷類代謝途徑，在BRH的R2中插入內含子[19]。許玲等[19]在大豆中分離一個C類MYB基因GmMYB111，與大豆的非生物脅迫和ABA信號轉導途徑有關。ClMYB在其起始密碼子后第134、388位核苷酸處各插入一個內含子，屬于C類MYB轉錄因子，結合筆者課題組前期篩選出參與西瓜與枯萎病菌非親和互作的莽草酸-苯丙烷-木質素生物合成途徑[4]，ClMYB可能參與了此代謝途徑，具體調控功能還有待后續研究證明。

圖6 重組質粒pCzn 1-ClMYB雙酶切鑒定Fig. 6 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid pCzn 1-ClMYB

圖7 ClMYB重組蛋白在大腸桿菌中表達Fig. 7 Expression of recombinant pCzn 1-ClMYB protein in E. coli Arctic Express

圖8 ClMYB蛋白純化SDS-PAGE分析Fig. 8 SDS-PAGE of ClMYB purification protein

SA、JA和乙烯是植物體內重要的抗病信號分子，它們在抵御生物類脅迫中具有重要作用[20]。AtMYB30是R2R3亞類MYB轉錄因子家族的成員，在擬南芥與病原細菌的非親和互作中AtMYB30能被快速激活表達，而在起始細胞死亡受到影響的突變體中，該蛋白的表達被下調[21]。在細菌病原物誘導的HR中，AtMYB30表達依賴于SA積累，但與依賴于SA的防衛反應信號傳導途徑中的關鍵組分NPR1無關[22]。從中間偃麥草中克隆鑒定出R2R3MYB基因TiMYB2R-1，在小麥中異源表達，發現與全蝕病相關防御基因在轉錄水平上的表達均顯著提高，表明超量表達TiMYB2R-1能用于提高小麥抵抗全蝕病的抗性[9]。ATR1 可引發HR細胞死亡反應從而增強植株對細菌病原物的抗性[23]，ATR13 則可增強植株對卵菌、細菌和病毒的抗病能力[24]。大豆中的PsMYB1能夠增強對大豆霉疫菌的抗性[25]。對擬南芥突變體中的BOS1的研究發現，BOS1誘導表達在coll突變體中被破壞，說明參與了茉莉酸抗病反應途徑[26]。MYB還參與了依賴于JA的防御反應途徑，在水稻幼苗中JA是抵御稻瘟病菌侵染的系統獲得的重要抗病性誘導因子，從水稻中分離JAmyb，受稻瘟病和JA誘導，在敏感株系中受稻瘟病菌誘導水平更高[27]。本研究表明，ClMYB表達受與西瓜抗枯萎病和JA誘導，MeJA處理可以顯著提高感病材料Black diamond對枯萎病的抗病水平，且誘導水平比在抗病材料PI296341-FR更高，推測ClMYB可能通過JA信號途徑參與西瓜抗枯萎病的應答中。

圖9 枯萎病菌誘導ClMYB的表達分析Fig. 9 Expression analysis of ClMYB induced by F. oxysporum f. sp. niveum

圖10 ClMYB在MeJA處理后Black diamond和PI296341-FR的表達Fig. 10 Expression of ClMYB in response to MeJA treatment in Black diamond and PI296341-FR

4 結論

ClMYB編碼的氨基酸序列具有MYB轉錄因子R2R3型的典型特征，其N端具有R2、R3 兩個MYB結構域，C端高度變異。進化樹分析表明，該基因編碼的蛋白與甜瓜、黃瓜的MYB同源性最高，這與它們同屬于葫蘆科植物有關。亞細胞定位于細胞核中，基因的原核表達得到36 kD左右的融合蛋白，其表達可能與西瓜抗枯萎病和JA信號轉導途徑有關，推測其可能通過JA信號途徑參與西瓜抗枯萎病的應答中。

[1] ZHANG Z G, ZHANG J Y, WANG Y C, ZHENG X B. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerellamelonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters, 2005, 249: 39-47.

[2] MARTYN R D, NETZER D. Resistance to race 0, 1, 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI296341-FR. HortScience, 1991, 26(4): 429-432.

[3] 呂桂云, 郭紹貴, 張海英, 耿麗華, 許勇. 西瓜與枯萎病菌非親和互作的表達序列標簽分析. 中國農業科學, 2010, 43(9): 1883-1894. Lü G Y, GUO S G, ZHANG H Y, GENG L H, XU Y. Analysis of expressed sequence tags in the incompatible interaction between watermelon and Fusarium oxysporum. Scientia Agricultura Sinica, 2010, 43(9): 1883-1894. (in Chinese)

[4] Lü G Y, GUO S G, ZHANG H Y, GENG L H, SONG F G, FEI Z J, XU Y. Transcriptional profiling of watermelon during its incompatible interaction with Fusarium oxysporum f. sp. niveum. European Journal of Plant Pathology, 2011, 131: 585-601.

[5] YANG Y, KLESSING D F. Isolation and characterization of a tobacco mosaic virus-inducible myb oncogene homolog from tobacco. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996, 93: 14972-14977.

[6] VAILLEAU F, DANIEL X, TRONCHET M, MONTILLET J L, TRIANTAPHYLIDES C, ROBY D. A R2R3-MYB gene, AtMYB30, acts as a positive regulator of the hypersensitive cell death program in plants in response to pathogen attack. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002, 99(15): 10179-10184.

[7] SUGIMOTO K, TAKEDA S, HIROCHIKA H. MYB-related transcription factor NtMYB2 induced by wounding and elicitors is regulator of the tobacco retrotransposon Tto1 and defense-related genes. The Plant Cell, 2000, 12: 2511-2527.

[8] VAN DER ENT S, VERHAGEN B W, VAN DOORN R, BAKKER D, VERLAAN M G, PEL J C, PROVENIERS C G, VAN LONG L C, TON J, PIETERSE C M J. MYB72 is required in early signaling steps of rhizobacteria-induced systemic resistance in Arabidopsis. Plant Physiology, 2008, 146: 1293-1304.

[9] LIU X, YANG L H, ZHOU X Y, ZHOU M P, LU Y. Transgenic wheat expressing Thinopyrum intermedium MYB transcription factor TiMYB2R-1 shows enhanced resistance to the take-all disease. Journal of Experimental Botany, 2013, 64(8): 2243-2253.

[10] LIU H X, ZHOU X Y, DONG N, LIU X, ZHANG H Y, ZHANG Z Y. Expression of a wheat MYB gene in transgenic tobacco enhances resistance to Ralstonia solanacearum, and to drought and salt stresses. Functional & Integrative Genomics, 2011, 11: 431-443.

[11] ZHANG Z Y, LIU X, WANG X D, ZHOU M P, ZHOU X Y, YE X G, WEI X. An R2R3 MYB transcription factor in wheat, TaPIMP1, mediates host resistance to Bipolaris sorokiniana and drought stresses through regulation of defense and stress-related genes. New Phytologist, 2012, 196: 1155-1170.

[12] 侯紅敏, 王浩, 殷向靜, 閆琴, 王躍進, 王西平. 華東葡萄抗白粉病VpMYBR1基因表達與功能分析. 中國農業科學, 2013, 46(7): 1408-1418. HOU H M, WANG H, YIN X J, YAN Q, WANG Y J, WANG X P. Expression and functional analysis of VpMYBR1 gene resistant to Uncinula necator from Vitis pseudoreticulata. Scientia Agricultura Sinica, 2013, 46(7): 1408-1418. (in Chinese)

[13] TIMMERMANS M C, HUDSON A, BECRAFT P W, NELSON T. ROUGH SHEATH2: a Myb protein that represses knox homeobox genes in maize lateral organ primordia. Science, 1999, 284: 151-153.

[14] 李猷, 王日升, 董登峰, 張曼, 劉文君, 陳振東, 董文斌. 西瓜與枯萎病菌非親和互作相關基因的分離及表達分析. 植物病理學報, 2015, 45(1): 22-32. LI Y, WANG R S, DONG D F, ZHANG M, LIU W J, CHEN Z D, DONG W B. Isolation and expression analysis of resistance related genes in incompatible interaction between watermelon and Fusarium oxysporum f. sp. niveum. Acta Phytopathologica Sinica, 2015, 45(1): 22-32. (in Chinese)

[15] 邢文, 金曉玲. 調控植物類黃酮生物合成的MYB轉錄因子研究進展. 分子植物育種, 2015, 13(3): 689-696. XING W, JIN X L. Recent advances of MYB transcription factors involved in the regulation of flavonoid biosynthesis. Molecular Plant Breeding, 2015, 13(3): 689-696. (in Chinese)

[16] LAU S E, SCHWARZACHER T, OTHMAN R Y, HARIKRISHNA J A. dsRNA silencing of an R2R3-MYB transcription factor affects flower cell shape in a Dendrobium hybrid. BMC Plant Biology, 2015, 15: 194.

[17] DUBOS C, STRACKE R, GROTEWOLD E, WEISSHAAR B, MARTIN C, LEPINIEC L. MYB transcription factors in Arabidopsis. Trends in Plant Science, 2010, 15: 573-581.

[18] GAO F, ZHAO H X, YAO H P, LI C L, CHEN H, WANG A H, PARK S U, WU Q. Identification, isolation and expression analysis of eight stress-related R2R3-MYB genes in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum). Plant Cell Reports, 2016, 35: 1385-1396.

[19] 許玲, 衛培培, 張大勇, 徐照龍, 何曉蘭, 黃益洪, 馬鴻翔, 邵宏波.大豆轉錄因子基因GmMYB111的克隆及功能分析. 中國農業科學, 2015, 48(15): 3079-3089. XU L, WEI P P, ZHANG D Y, XU Z L, HE X L, HUANG Y H, MA H X, SHAO H B. Expression and function analysis of the transcriptionfactor Gm MYB111 in soybean. Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48(15): 3079-3089. (in Chinese)

[20] LU J, ROBERT C A, RIEMANN M, COSME M, MèNESAFFRANé L, MASSANA J, STOUT M J, LOU Y, GERSHENZON J, ERB M. Induced jasmonate signaling leads to contrasting effects on root damage and herbivore performance. Plant Physiology, 2015, 167(3): 1100-1116.

[21] DANIEL X, LACOMME C, MOREL J B, ROBY D. A novel myb oncogene homologue in Arabidopsis thaliana related to hypersensitive cell death. The Plant Journal, 1999, 20(1): 57-66.

[22] RAFFAELE S, RIVAS S, ROBY D. An essential role for salicylic acid in AtMYB30-mediated control of the hypersensitive cell death program in Arabidopsis. FEBS Letters, 2006, 580: 3498-3504.

[23] SOHN K H, LEI R, NEMRI A, JONES J D. The downy mildew effector proteins ATR1 and ATR13 promote disease susceptibility in Arabidopsis thaliana. The Plant Cell, 2007, 19: 4077-4090.

[24] RENTEL M C, LEONELLI L, DAHLBECK D, ZHAO B Y, STASKAWICZ B J. Recognition of the Hyaloperonospora parasitica effector ATR13 triggers resistance against oomycete, bacterial, and viral pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105(3): 1091-1096.

[25] ZHANG M, LU J, TAO K, YE W W, LI A N, LIU X Y, KONG L, DONG S M, ZHENG X B, WANG Y C. A Myb transcription factor of Phytophthora sojae, regulated by MAP Kinase PsSAK1, is required for zoospore development. PLoS ONE, 2012, 7(6): e40246.

[26] MENGISTE T, CHEN X, SALMERON J, DIETRICH R. The BOTRYTIS SUSCEPTIBLE1 gene encodes an R2R3-myb transcription factor protein that is required for biotic and abiotic stress responses in Arabidopsis. The Plant Cell, 2003, 15(11): 2551-2565.

[27] LEE M W, QI M, YANG Y. A novel jasmonic acid-inducible rice myb gene associates with fungal infection and host cell death. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2001, 14(4): 527-535.

（責任編輯 岳梅）

Cloning and Expression Analysis of Fusarium Wilt Resistance-Related Gene CIMYB Transcription Factor from CitruIIus Ianatus

HAN Jin-huan, WANG Li-xia, GAO Hong-bo, Lü Gui-yun
(College of Horticulture, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, Hebei)

【Objective】The objective of this study is to clone ClMYB, which is a gene encoding MYB transcription factor, analyze its sequence features and expression characteristics, and to provide new insights into the understanding of the molecular mechanism in response of watermelon plants to Fusarium oxysporum f. sp. niveum infection.【Method】In a recent study, a novel EST of MYB transcription factors was obtained from data analysis of microarray and suppression subtractive hybridization (SSH) of incompatible interaction between watermelon and F. oxysporum f. sp. niveum. cDNA sequence of the MYB was isolated and clonedusing cDNA from watermelon roots with F. oxysporum f. sp. niveum infection by RT-PCR method, designated as ClMYB. The conserved domains and sequence features of ClMYB protein were analyzed by bioinformatics methods. Multiple sequence alignments and a phylogenetic tree of homologous species were done between ClMYB protein and its homologous ones from other species using MEGA5.0. The subcellular localization of ClMYB was analyzed using fusion expression vector PYBA1332-GFP. Then ORF of the cloned gene was inserted into the expression vector pCzn1 by Nde I and Xba I digestion. The recombinant plasmid was transformed into E. coli Arctic Express system and induced expression by 0.5 mmol·L-1IPTG for 4 h. The expression of the fusion protein was detected by SDS-PAGE. The expression pattern of target genes in watermelon with F. oxysporum f. sp. niveum were detected by real-time fluorescent quantitative PCR (qRT-PCR).【Result】Using RT-PCR method, cDNA sequence of ClMYB (GenBank: KT751229) was cloned from watermelon (PI296341-FR) root. Sequence alignment and bioinformatics analysis revealed that the deduced amino acids of ClMYB had common characteristics of MYB transcription factors with two MYB domains of R2 and R3 at the N-terminal and highly variation at the C-terminal. Phylogenetic tree analysis suggested that the encoded protein had the closest genetic relationship with Cucumis melo MYB (GenBank: XM_008440304) and Cucumis sativus MYB (GenBank: XM_011652633). Subcellular localization results showed that ClMYB protein was located in the nucleus which belongs to a typical transcription factor. The expression of fusion protein was obtained by inducing with IPTG in E. coli and its relative molecular weight was 36 kD. qRT-PCR showed that the expression of ClMYB was induced by F. oxysporum f. sp. niveum, and appeared peak earlier and higher in PI296341-FR than Black diamond. MeJA at 50 μmol·L-1could significantly improve the resistance of Black diamond to F. oxysporum f. sp. niveum and induce the expression of ClMYB. In PI296341-FR, the expression of ClMYB was also induced by MeJA, while its expression level was lower than Black diamond. 【Conclusion】ClMYB is a typical R2R3-MYB transcription factor and is located in the nucleus. The expression of fusion protein was obtained by prokaryotic expression and its relative molecular weight is 36 kD. The expression of ClMYB was induced by F. oxysporum f. sp. niveum and JA. It is speculated that ClMYB may be involved in JA-mediated resistance signal transduction network of F. oxysporum f. sp. niveum. It might play an important role in disease resistance of Citrullus lanatus.

watermelon; Fusarium wilt; ClMYB transcription factor; gene cloning; expression analysis

2016-05-06；接受日期：2016-06-16

國家自然科學基金（31201632）、河北省自然科學基金（C2016204138）

聯系方式：韓金桓，E-mail：m15200099616@163.com。通信作者呂桂云，E-mail：guiyunlv@163.com