重組畢赤酵母產果糖基轉移酶發酵條件的優化

郭文文，陳獻忠，沈微，許菲，楊海泉*

1(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學生物工程學院，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

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重組畢赤酵母產果糖基轉移酶發酵條件的優化

郭文文1，陳獻忠1，沈微1，許菲2，楊海泉2*

1(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學生物工程學院，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

果糖基轉移酶(EC 2.4.1.9)是利用蔗糖為底物制備低聚果糖的關鍵酶。利用前期構建的產果糖基轉移酶的重組畢赤酵母為出發菌株，對其進行發酵優化。最適發酵產酶條件為：裝液量30 mL/250 mL、V(甘油)∶V(甲醇)=1∶20、初始pH為5.5、誘導溫度為30 ℃、初始甲醇濃度為1.0%、后續甲醇濃度為1.5%、硫酸銨濃度10 g/L、誘導時間為120 h。在優化的發酵產酶條件下，重組果糖基轉移酶酶活力達218.3 U/mL，較優化前提高了5倍。

果糖基轉移酶；畢赤酵母；發酵條件；優化

低聚果糖(fructooligosaccharides)是一種新型保健食品[1]，可促進人體腸道中益生菌的增殖、礦物質元素的吸收、抑制有害細菌和病源菌的生長等[2-3]。近年來，因其優越的生理功能而成為國際食品市場中廣泛流行的功能性食品配料[4]。

果糖基轉移酶(fructosyltransferase，EC 2.4.1.9)，作為一種合成低聚果糖的酶類，是一種具有轉移果糖基活力的水解酶[5]。果糖基轉移酶具有廣泛受體活性，能以乳糖、蔗糖為原料，合成果乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖等低聚糖。因此，人們對果糖基轉移酶生產低聚果糖越來越關注。微生物來源的果糖轉移酶，因其不受季節限制，極具工業生產意義[6]。已報道的關于果糖基轉移酶的生產主要集中在野生型微生物發酵、固定化[7]及少量關于重組酶表達方面的研究。LATEEF等[8]對黑曲霉(Aspergillusniger)菌株產果糖基轉移酶分別進行了液態發酵和固態發酵產酶研究。在液態發酵過程中，30 ℃發酵120 h，發酵至48 h時酶活力達到最大酶，為24.49 U/mL。A.niger來源的果糖基轉移酶基因在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中異源表達，在YPD培養基中30 ℃發酵48 h后重組果糖基轉移酶最高酶活力可達19.8 U/mL[3]。

在前期研究工作中，我們構建了1株產果糖基轉移酶的重組畢赤酵母(Pichiapastoris)GS-fru-4菌株，并對重組酶酶學性質進行了測定與分析[9]。本研究對上述已構建生產果糖基轉移酶的菌株進行了系列發酵條件優化以提高酶的產量，這對重組果糖基轉移酶的工業化生產與應用具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

重組菌株P.pastorisGS-fru-4為實驗室前期構建、保藏[9]。

1.2 培養基

YPD培養基：1% 酵母提取物、2% 胰蛋白胨、2% 葡萄糖。BMGY培養基：1% 酵母提取物、2% 胰蛋白胨、0.34% YNB、1%硫酸銨、1%甘油、4×10-5g/L 生物素、0.1 mol/L 磷酸緩沖液(pH 6.0)。BMMY培養基：除了用1%甲醇代替甘油外，其余成分均與BMGY相同。

YPD培養基在115 ℃滅菌15 min。BMGY、BMMY培養基均在110 ℃滅菌10 min, 生物素與甲醇均過濾除菌，待滅菌后加入。

1.3 培養方法

將重組P.pastorisGS-fru-4在YPD固體培養基上劃線，30 ℃靜置培養72 h。挑取重組P.pastoris單菌落，接種于BMGY培養基中，30 ℃、200 r/min 培養24 h。離心收集菌體，轉接至BMMY培養基中，30 ℃、200 r/min發酵培養，每隔24 h補加甲醇使其終體積分數為1%，誘導培養96 h，停止發酵。

1.4 酶活定義及測定方法

將發酵液在4 ℃、8 000 r/min 離心10 min，收集上清，參照文獻報道方法測定酶活力[10-11]。用pH 5.5的0.1 mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制25%的蔗糖溶液為底物750 μL，加入250 μL稀釋合適倍數的酶液，45 ℃反應30 min，沸水浴加熱15 min，終止反應。酶活力單位定義為：在上述反應條件下，酶催化蔗糖每分鐘產生1 μmol蔗果三糖所需的酶量為1個酶活單位(U)[12]。

1.5 裝液量對產酶的影響

將重組P.pastorisGS-fru-4轉接至不同裝液量的發酵培養基(250 mL三角瓶裝液量分別為15、20、25、30、35、40、45、50 mL)誘導培養，取樣測定果糖基轉移酶酶活力。

1.6 誘導階段甘油添加對產酶的影響

將重組P.pastorisGS-fru-4轉接至分別添加不同濃度(0、0.2%、0.5%、0.7%、1%)的甘油和1%甲醇的發酵培養基誘導培養，取樣測定果糖基轉移酶酶活力。

1.7 初始pH對產酶的影響

將重組P.pastorisGS-fru-4轉接至不同初始pH值的發酵培養基誘導培養，取樣測定果糖基轉移酶酶活力。初始pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5。

1.8 誘導溫度對產酶的影響

將重組P.pastorisGS-fru-4轉接至發酵培養基，在不同溫度下(28、30、37 ℃)進行誘導培養，取樣測定果糖基轉移酶酶活力。

1.9 甲醇初始添加量對產酶的影響

將重組P.pastorisGS-fru-4轉接至發酵培養基，選用不同的甲醇濃度(0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%、1.75%、2%)進行第一次甲醇誘導，每隔24 h添加1%濃度的甲醇誘導培養，取樣測定果糖基轉移酶酶活力。

1.10 甲醇添加量對產酶的影響

將重組P.pastorisGS-fru-4轉接至不同甲醇濃度(0.5%、1%、1.5%、2%)的發酵培養基進行誘導培養，取樣測定果糖基轉移酶酶活力。

1.11 誘導階段培養基中硫酸銨的濃度對產酶的影響

將重組P.pastorisGS-fru-4轉接至不同硫酸銨濃度(3、5、7、10、12 g/L)的發酵培養基中誘導培養，取樣測定果糖基轉移酶酶活力。

1.12 誘導時間對產酶的影響

采用上述最優化培養條件，將重組P.pastorisGS-fru-4轉接至發酵培養基中進行誘導發酵，每24 h取樣測定果糖基轉移酶酶活力和菌體干重變化情況。

2 結果與討論

2.1 導階段裝液量對產酶的影響

在重組P.pastoris誘導培養過程中，溶氧控制是重要的一個因素。由于P.pastoris是好氧微生物，溶解氧濃度對菌體的生長和產物的生成均有較大影響。因此，較高的溶氧條件是提高發酵效率和產酶的一個重要保證。在搖瓶培養條件下，裝液量對培養基中的溶解氧濃度具有重要影響。實驗中分析了誘導階段不同裝液量對產酶和干重的影響，結果如圖1所示。當裝液量低于30 mL時，果糖基轉移酶酶活力和干重逐漸增高。裝液量為30 mL時，重組P.pastorisGS-fru-4發酵產果糖基轉移酶的酶活力到達最大，為79.4 U/mL。此時，菌體干重也達到最高，為5.5 g/L。當裝液量大于30 mL時，果糖基轉移酶酶活力和干重隨著裝液量的增加而逐漸降低。這是因為裝液量過大，會直接導致溶氧不足，進而影響菌體生長和果糖基轉移酶的分泌表達。

圖1 裝液量對發酵產酶及菌體生長的影響Fig.1 Effect of the medium volume on producing fructosyltransferase and cell growth

2.2 誘導階段甘油添加量對產酶的影響

為考察誘導階段甘油添加對重組果糖基轉移酶表達的影響，在誘導階段改變了單一的甲醇誘導方式，采取了甲醇(M)、甘油(G)混合補料。實驗過程中，每隔24 h分別補加1% (v/v)的甲醇以及0、0.2%、0.5%、0.7%、1.0%的甘油。結果如圖2所示，果糖基轉移酶酶活力在G/M=0.5時達到最大，為82.5 U/mL。但在其他G/M比例條件下，重組P.pastorisGS-fru-4表達果糖基轉移酶酶活力均呈下降趨勢。在G/M比例分別為0、0.2、0.7、1.0時，重組P.pastorisGS-fru-4表達果糖基轉移酶酶活力分別為73.2、76.9、58.3、51.2 U/mL。從圖2可以看出，隨著G/M的增大，重組P.pastorisGS-fru-4菌體干重也逐漸增大。在G/M分別為0、0.2、0.5、0.7、1.0時，重組P.pastorisGS-fru-4的干重分別為5.76、6.89、8.56、9.31、9.78 g/L。這主要是因為甘油的添加能夠提供有利于重組菌株生長所需的碳源和能量，但不宜過量否則會產生底物抑制效應[13]。

圖2 甘油添加對產酶及菌體生長的影響Fig.2 Effect of glycerin addition on producing fructosyltransferase and cell growth

2.3 初始pH對產酶的影響

實驗中分析了初始pH對重組P.pastorisGS-fru-4產酶及菌體生長的影響。如圖3所示，發酵培養基初始pH為5.5時，重組P.pastorisGS-fru-4產果糖基轉移酶的酶活力最高，達到92.1 U/mL。發酵培養基的pH過高或過低時，均導致重組P.pastorisGS-fru-4產果糖基轉移酶的酶活力有所下降。智曉燕等[14]對P.pastoris重組菌表達白地霉脂肪酶(Geotrichumcandidumlipase，GCL)的初始pH等條件進行優化，確定最適初始pH為7.0。在該pH條件下，GCL酶活力最高(600 U/mL)，比初始pH 6.0時提高了40%。如圖3所示，當發酵培養基初始pH為6.0時，重組P.pastorisGS-fru-4細胞干重(DCW)最高，達到13.1 g/L。但是pH為6.0時，果糖基轉移酶酶活力為87.1 U/mL，低于pH 5.5時的酶活力。說明pH 6.0更有利于重組P.pastoris菌體生長，卻不利于產酶。

圖3 初始pH對產酶和菌體生長的影響Fig.3 Effect of the initial pH on producing fructosyltransferase and cell growth

2.4 誘導溫度對產酶的影響

溫度主要通過影響發酵動力學特性、微生物代謝調節機制、菌體代謝產物合成的方向和發酵液的理化性質等方面，從而影響產物的合成和菌體的生長[15-17]。實驗結果如圖4所示，重組P.pastorisGS-fru-4菌株發酵生產果糖基轉移酶的最適誘導溫度是30 ℃，此溫度下果糖基轉移酶最高酶活力為93.2 U/mL。此時重組P.pastorisGS-fru-4細胞干重達到最大，為12.0 g/L。這說明重組P.pastorisGS-fru-4在30 ℃時，最適合該重組菌株的生長和生產重組果糖基轉移酶。誘導溫度為37 ℃時，重組P.pastorisGS-fru-4細胞干重和菌株產酶量都有所下降。

圖4 溫度對發酵產酶和菌體生長的影響Fig.4 Effect of the temperature on producing fructosyltransferase and cell growth

2.5 誘導階段甲醇添加量對產酶的影響

甲醇濃度過高會使細胞中毒，且產生的過量過氧化氫也會使細胞中毒。因此，在誘導初期要控制培養基甲醇的初始濃度，使酵母逐漸適應甲醇環境，進一步促進細胞生長與產酶。實驗中考察了不同初始甲醇添加量對重組P.pastorisGS-fru-4表達果糖基轉移酶的影響，如圖5所示。

圖5 初始甲醇添加量對產酶和菌體生長的影響Fig.5 Effect of the initial methanol concentration on producing fructosyltransferase and cell growth

在250 mL搖瓶發酵過程中，當初始甲醇添加量為1.0% (v/v)時，重組P.pastorisGS-fru-4表達果糖基轉移酶的酶活力最高，達到94.2 U/mL。但其他初始甲醇添加濃度條件下，重組果糖基轉移酶酶活力均會下降。同時，當初始甲醇添加量為1.0% (v/v)時，重組P.pastorisGS-fru-4細胞干重最大，為10.4 g/L。隨著初始甲醇添加量的增加，重組P.pastorisGS-fru-4細胞干重下降。當初始甲醇添加量為2.0% (v/v)時，重組P.pastorisGS-fru-4細胞干重降為5.0 g/L。

在誘導中后期，這時菌體已經適應了甲醇環境，可以適當增加甲醇的添加量，實現重組酶過量表達。研究過程中，考察了誘導階段不同甲醇添加量對重組P.pastorisGS-fru-4表達果糖基轉移酶的影響。如圖6所示，當甲醇添加量控制在1.0%～1.5% (v/v)時，果糖基轉移酶酶活力較高。但當甲醇添加量較高(>1.5%)或較低(< 1.0%)時，果糖基轉移酶酶活力下降則比較顯著，最多下降30%以上。當甲醇添加量為1.5% (v/v)時，重組P.pastorisGS-fru-4誘導產果糖基轉移酶酶活力最高，達到101.2 U/mL。同時，甲醇添加量對細胞生長會造成一定的影響。如圖6所示，甲醇添加量為1.0% (v/v)最有利于重組P.pastorisGS-fru-4細胞生長，誘導96 h后其干重達到最大，為8.0 g/L。因此，1.5% (v/v)甲醇添加量更適合重組P.pastorisGS-fru-4表達果糖基轉移酶，而1.0% (v/v)甲醇添加量更適合重組P.pastorisGS-fru-4菌體生長。

圖6 甲醇添加量對產酶及菌體生長的影響Fig.6 Effect of the methanol concentration on producing fructosyltransferase and cell growth

2.6 誘導階段培養基中不同硫酸銨添加量對產酶的影響

硫酸銨作為重組P.pastoris菌株在誘導階段的氮源之一，有助于細胞生長，同時對合成重組蛋白質也具有重要意義。實驗中分析了不同硫酸銨濃度對重組P.pastorisGS-fru-4產果糖基轉移酶的影響。結果如圖7所示，不同濃度的硫酸銨添加對重組P.pastorisGS-fru-4產果糖基轉移酶具有明顯影響。隨著硫酸銨濃度的增加，重組P.pastorisGS-fru-4產果糖基轉移酶的酶活力逐漸增大，細胞干重也逐漸增加。當硫酸銨濃度為10 g/L時，果糖基轉移酶酶活力達到最高，為102.3 U/mL。此時，重組P.pastorisGS-fru-4細胞干重也達到最大，為13.3 g/L。

圖7 不同硫酸銨添加量對產酶和菌體生長的影響Fig.7 Effect of the ammonium sulfate concentration on producing fructosyltransferase and cell growth

2.7 誘導時間對產酶的影響

綜合上述優化結果，對誘導時間對產酶的影響進行了測定分析。如圖8所示，隨著誘導時間的延續，重組P.pastorisGS-fru-4菌株發酵生產果糖基轉移酶酶活力逐漸提高，菌體干重也出現了相應趨勢。甲醇誘導120 h時，重組P.pastorisGS-fru-4菌株發酵生產果糖基轉移酶酶活力達到最高(218.3 U/mL)，此時P.pastoris細胞干重為8.7 g/L。在甲醇誘導144 h時，重組P.pastorisGS-fru-4細胞干重達到最大(9.7 g/L)，此時果糖基轉移酶的酶活力下降為94.4 g/L。繼續誘導發酵，果糖基轉移酶的酶活力和細胞干重都下降，這可能是因為營養物質的消耗、代謝產物的積累、生長空間限制等導致了菌體衰退、老化。

圖8 誘導時間對產酶和菌體生長的影響Fig.8 Effect of inducing time on producing fructosyltransferase and cell growth

3 結論

P.pastoris是甲醇營養型酵母，能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源進行代謝。以甲醇為碳源，P.pastoris會代償性地產生大量的酶。調控生產醇過氧化氫酶的啟動子也是驅動P.pastoris外源基因表達的啟動子。實驗中采用已構建可表達果糖基轉移酶的重組P.pastorisGS-fru-4為出發菌株，對其進行發酵優化研究。研究發現裝液量、甘油:甲醇、pH、溫度、甲醇濃度、硫酸銨濃度等條件對P.pastorisGS-fru-4生產重組果糖基轉移酶具有重要意義。其中，獲得的最優產酶條件為：裝液量30 mL、甘油∶甲醇=1∶20、初始pH 5.5、誘導溫度30℃、初始甲醇濃度為1.0%、后續甲醇濃度為1.5%、硫酸銨濃度10 g/L、誘導時間為120 h。在該最優條件下，果糖基轉移酶酶活力為218.3 U/mL。由實驗結果可以看出，重組果糖基轉移酶的生產與P.pastoris菌體的生長基本成正相關關系。過高或過低的甲醇濃度均不利于重組果糖基轉移酶的生產，這主要是因為甲醇濃度過低時碳源不足，菌體生長欠佳影響了產酶量；甲醇濃度過高時，過高的甲醇濃度對菌體細胞具有毒害作用，影響了細胞的生產和產酶量。研究結果對重組果糖基轉移酶的工業化生產及應用具有重要指導意義。

[1] 胡學智,伍劍鋒.低聚果糖的生理功能及生產、應用[J].中國食品添加劑,2007(6):148-157.

[2] 杭鋒,伍劍鋒,王蔭榆,等.低聚果糖調節人體腸道菌群功能的研究[J].乳業科學與技術,2010(3):108-111.

[3] 王一恬,張玲,沈微,等.果糖基轉移酶在釀酒酵母中異源表達及酶學性質分析[J].食品與發酵工業,2015,41(6):24-28.

[4] SANGEETHA P T,RAMESH M N,PRAPULLAa S G.Production of fructosyltransferase byAspergillusoryzaeCFR 202 in solid-state fermentation using agricultural by-products [J].Applied Microbiology and Biotechnology,2004,65(5):530-537.

[5] DHAKE A B,PATIL M B.Effect of substrate feeding on production of fructosyltransferase byPenicilliumpurpurogenum[J].Brazilian Journal of Microbiology,2007,38(2):194-199.

[6] 王立梅.Aspergillusjaponicus果糖基轉移酶及其改性大豆低聚糖的研究[D].無錫：江南大學,2006.

[7] 姚盟成,楊麗萍,司建華,等.果糖基轉移酶的固定化及其性質研究[J].食品工業科技,2012,33(20):164-167.

[8] LATEEF A,OLOKE J K,GUEGUIM-KANA E B,etal.Production of fructosyltransferase by a local isolate ofAspergillusnigerin both submerged and solid substrate media [J].ACTA ALIMENTARIA,2012,41(1):100-117.

[9] GUO Wen-wen,YANG Hai-quan,QIANG Shu-min,etal,Overproduction,purification,and property analysis of an extracellular recombinant fructosyltransferase [J].European Food Research and Technology,2015,doi:10.1007/s00217-015-2620-x.

[10] SALINAS M A,PEROTTI N I.Production of fructosyltransferase byAureobasidiumsp. ATCC 20524 in batch and two-step batch cultures [J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2009,36(1):39-43.

[11] ARRIZONJ,MORELl S,GSCHAEDLERA,et al.Fructanase and fructosyltransferase activity of non-Saccharomycesyeasts isolated from fermenting musts of Mezcal[J].Bioresource Technology,2012,110:560-565.

[12] 蔣波.高活力果糖基轉移酶的菌種選育及生產工藝優化研究[D].廣州：華南理工大學,2014.

[13] 宋留君,周長林,竇潔,等.甘油對畢赤酵母高密度發酵表達重組水蛭素Ⅱ的影響[J].中國藥科大學學報,2006,37(4):371-374.

[14] 智曉燕,汪小鋒,孫永川,等.多拷貝畢赤酵母重組菌表達GCL搖瓶優化和高密度發酵[J].中國生物工程雜志,2012,32(2):82-89.

[15] WEI Gong-yuan,LI Yin,DU Guo-cheng,et al.Application of a two-stage temperature control strategy for enhanced glutathione production in the batch fermentation byCandidautilis[J].Biotechnology Letters,2003, 25(11): 887-890.

[16] 史文婷,劉寅,趙越,等.米曲霉產果糖基轉移酶發酵條件優化與分離純化[J].食品工業科技,2014,35(14):211-215.

[17] 楊宇,李娜,李秀娜,等.畢赤酵母表達Q8008發酵條件的優化研究[J].蛇志,2014,26(4):367-373.

Optimization of fermentation conditions for fructosyltransferase production by recombinant Pichia pastoris

GUO Wen-wen1, CHEN Xian-zhong1, SHEN Wei1, XU Fei2, YANG Hai-quan2*

1 (Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2 (Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Fructosyltransferase (EC 3.2.19) is used in the production of fructooligosaccharides using sucrose as the substrate. A recombinantP.pastorisstrain previously constructed as original strain was optimized to over-express fructosyltransferase. In this study, the optimal fermentation conditions were as follows: medium volume 30 mL/250 mL, glycerol∶methanol=1∶20 (v/v), the initial pH 5.5, inducing temperature 30 ℃, the initial methanol concentration 1.0%, the subsequent methanol concentration 1.5%, ammonium sulfate concentration 10 g/L and inducing time 120 h. Under the optimal condition, the yield of recombinant fructosyltransferase reached 218.3 U/mL, which was 5-fold higher than that before optimization.

fructosyltransferase;Pichiapastoris;fermentation conditions; optimization

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610007

碩士研究生(楊海泉副教授為通訊作者，E-mail: haiquanyang@jiangnan.edu.cn)。

工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)開放課題基金(KLIB-KF201404)

2016-02-25，改回日期：2016-04-13