優良飼用乳酸菌的篩選及在模擬消化環境中的耐受性

王彥萍，熊濤，黃濤，廖良坤

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌，330047)

?

優良飼用乳酸菌的篩選及在模擬消化環境中的耐受性

王彥萍，熊濤*，黃濤，廖良坤

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌，330047)

通過MRS培養基進行初篩，耐酸耐膽鹽復篩，從乳豬糞便中篩選出能夠應用于飼料中的優良乳酸菌。MRS初篩得到26株乳酸菌疑似菌株，在pH2.0和3 g/L膽鹽的MRS培養復篩得到7株菌，對性能較好的菌株G1和G9進行生理生化及分子生物學鑒定：G1為植物乳桿菌(NCU156)、G9為戊糖片球菌(NCU301)。進一步研究NCU156的耐酸耐膽鹽性能以及模擬動物消化道耐受性能。結果表明：NCU156在pH2.5的MRS培養基中，作用4 h存活率為87.31%；在膽鹽質量濃度為3 g/L的培養基中，作用6 h活菌數下降不到一個數量級；在pH3.0的人工胃液中作用4 h，NCU156的活菌數稍有增加，在3 g/L膽鹽的人工腸液中作用6 h，活菌數下降約一個數量級(1.81×109～1.27×108CFU/mL)，活菌數仍保持在108CFU/mL以上。可見NCU156對動物胃腸道有良好的耐受性，在飼料產品中有很好的應用前景。

篩選；鑒定；植物乳桿菌NCU156；耐酸；耐膽鹽；消化環境

20世紀90年代為了防治仔豬腹瀉，我國開始引入飼用抗生素。隨著抗生素的長期使用，因藥物殘留、抗藥性、環境污染等問題給人和動物的健康帶來諸多危害[1-3]。尋找綠色、安全的抗生素替代品成為國內外研究的熱點。益生菌制劑、中草藥、酶制劑、抗菌肽為常見的抗生素替代品[4-5]。益生菌制劑無毒副作用、綠色安全、效果好、成本低，具有其他添加劑無法相比的優點[6-7]。我國《飼料添加劑品種目錄》中批準使的微生物主要有芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、霉菌等，乳酸菌是動物腸道正常菌群之一，乳酸菌在腸道內可以通過產生抗菌物質、競爭性粘附腸道生態位、調節腸道環境等作用來維持動物腸道健康[8-9]。本實驗從健康野生乳豬糞便中篩選出對低pH環境和高濃度膽鹽有較好耐受性的菌株，通過生理生化實驗、分子生物學手段進行鑒定，研究了其耐酸耐膽鹽能力，并對該菌株在模擬動物胃腸道環境中的生存能力進行考察，為該菌株運用于飼料添加提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品

野生乳豬糞便。

1.2 培養基

MRS培養基：采用GB 4789.35—2010《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》[10]方法配置。

初篩培養基：于固體MRS培養基中加入0.04%的溴甲酚紫。

復篩培養基：(1)用鹽酸將MRS液體培養基的pH值調至3.0；(2)在MRS液體培養基中加入3 g/L的豬膽鹽。

1.3 試劑

HCl(分析純),西隴化工股份有限公司；NaOH(分析純),天津市大茂化學試劑廠；豬膽鹽，廣州市齊云生物技術有限公司；胃蛋白酶(酶活力 1∶10 000)，美國Sigma公司；胰蛋白酶(酶活力1∶250)，美國Amresco公司；過氧化氫酶(酶活力2 000～5 000 u/mg)，美國 Sigma公司。

人工胃液[11]：NaCl(125 mmol/L)、KCl(7 mmol/L)、NaHCO3(45 mmol/L)和胃蛋白酶(3 g/L)，用HCl將溶液pH調至3.0，用0.20 μm的微孔濾膜過濾除菌。

人工腸液[12]：胰蛋白酶(1g/L)、豬膽鹽(3 g/L)，用NaOH調pH至7.5，過濾除菌。

1.4 儀器與設備

YXQ-LS-50SⅡ/75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；Airtech 生物安全柜，蘇凈集團安泰公司；DNP-9272型生化培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；FE-28型pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；XSZ-4G生物光學顯微鏡，重慶光電儀器有限公司；Mastercycler Ep PCR儀，Eppendorf AG；TG16-W微量高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠。

1.5 實驗方法

1.5.1 乳酸菌的初篩

將采集到的新鮮樣品置于MRS液體培養基中，37 ℃下富集培養24 h，采用十倍梯度稀釋法，涂布于初篩平板上，37 ℃培養24 h，挑取黃色包圍圈較大的菌落進行劃線分離。

1.5.2 耐酸耐膽鹽復篩

將初篩得到的菌株于MRS液體培養基中活化24 h，按3%的接種量接種于pH 2.0或含有3 g/L膽鹽的MRS培養基中培養4 h，進行乳酸菌平板計數。

1.5.3 菌株形態學及生理生化鑒定

對復篩得到菌株的菌落形態、顏色、菌落邊緣等特征進行觀察并記錄，將菌株進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體形狀、大小。選取革蘭氏染色陽性菌株進行糖發酵實驗、硫化氫實驗、接觸酶實驗。

1.5.4 分子生物學鑒定

對待鑒定菌株進行DNA提取，以其基因組DNA為模板，使用細菌16S rRNA通用引物進行PCR，PCR條件參照熊濤等的方法[13]。對PCR得到的產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，成功擴增的產物送樣測序，將測序結果與NCBI數據庫中的序列進行同源性比對，同時利用MEGA6.0軟件構建系統發育樹，確定待測菌株的分類。

1.5.5 酸耐受性實驗

用HCl將液體MRS培養基的pH調至2.5、3.5、4.5，121 ℃滅菌20 min待用。將菌株于37 ℃條件下活化24 h，取3 mL菌液進行離心(4 500 r/min，10 min)，離心所得菌體用無菌生理鹽水洗滌3遍[14]，使用上述100 mL MRS液體培養基對菌體進行重懸，pH6.8的MRS液體培養基作為對照，37 ℃培養，使用菌落平板計數法分別于0、1、2、3、4 h進行活菌計數，按(1)式計算存活率。

(1)

1.5.6 膽鹽耐受性實驗

使用NaOH將MRS液體培養基的pH調至8.0[15]，在其中加入豬膽鹽，使膽鹽終質量濃度分別為1、2、3 g/L，121 ℃滅菌20 min待用。按照1.5.5中的方法接入上述準備好的培養基中，以不添加膽鹽的培養基作為對照，37 ℃培養，使用菌落平板計數法分別于0、1、2、3、4 h進行活菌計數，按公式(1)式計算存活率。

1.5.7 人工動物胃腸液耐受性實驗

按照1.5.5中的方法獲得菌體，將菌體用等體積配制好的人工動物胃液重懸，在搖床上培養模擬胃液的消化作用[16](37 ℃ 80 r/min)，4 h后，將人工胃液離心(4 500 r/min，10 min)，收集菌體，菌體用等體積的人工動物腸液重懸，按照上述條件培養，每小時取樣計算活菌數。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的初篩

在MRS平板上共劃線純化出26株疑似乳酸菌，它們均能不同程度地產生酸性物質，使得加有溴甲酚紫的紫色培養基變為黃色[17]。圖1為1株具有很強產酸性能的菌株，圖2為此菌株經美藍染色后在顯微鏡下的形態。

圖1 菌落形態Fig.1 Colonial morphology

圖2 美藍染色(×1000)Fig.2 Basic methylene blue stain

2.2 耐酸耐膽鹽復篩

經過復篩后得到7株耐酸耐膽鹽性能較好的菌株，如圖3所示，其中菌株G1和G9在pH 2.0的培養基中作用4 h后活菌數仍達105以上，在含有3 g/L膽鹽的培養基中作用4 h活菌數仍有107以上，選取G1、G9進行生理生化鑒定。

圖3 不同菌株在pH2.0和3 g/L膽鹽的液體MRS培養基中作用4 h后的活菌數Fig.3 Viable count of different strains in pH2.0 MRS medium or MRS medium with 3 g/L bile salt for 4 h

2.3 菌株形態學及生理生化鑒定

根據形態學及生理生化鑒定結果(見表1和表2)結合《伯杰氏細菌鑒定手冊》[18]，推斷G1可能為乳桿菌屬，G2可能為鏈球菌科中的片球菌屬，對這2株菌進行分子生物學鑒定。

表1 形態學鑒定

表2 生理生化鑒定

注：+ 表示陽性實驗結果；-表示陰性實驗結果。

2.4 分子生物學鑒定

將菌株G1和G9的16S rRNA測序結果與NCBI數據庫中的微生物序列進行比對，G1與LactobacillusplantarumWCFS1的同源性為97%，G9與PediococcuspentosaceusATCC 25745的同源性也為97%。利用MEGA6.06軟件構建系統發育樹進行同源性分析，見圖4。由圖4可知，G1為植物乳桿菌的可信度為99%，G9為戊糖片球菌的可信度為99%，結合,2株菌的形態學、生理生化鑒定，鑒定菌株G1為植物乳桿菌，菌株G9為戊糖片球菌。鑒于菌株G1的產酸能力比G9強，選取G1進行后續實驗，G1、G9分別命名為NCU156和NCU301。

圖4 菌株G1和G9的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strains G1 and G2

2.5 酸耐受性

在到達腸道末端發揮益生功能之前，乳酸菌必須通過胃液的酸性環境[19]，斷奶仔豬的胃液pH值在3.1～4.0范圍內變化[20]，胃完全排空時間為3～5 h[21]。植物乳桿菌NCU156酸耐受性實驗結果如圖5。

圖5 植物乳桿菌NCU156在不同pH下生長情況Fig.5 Growth of L.plantarum NCU156 with different pH values

在pH 4.5的MRS培養基中，植物乳桿菌NCU156的生長情況與對照組中的相似，4 h后活菌數與對照組相比沒有顯著性差異(P>0.05)；在pH 3.5的MRS培養基中作用4 h后，其活菌數呈先下降后上升的趨勢，較0 h處顯著增加(P<0.05)，這說明其能夠通過自身的應激反應來抵抗脅迫所造成的危害[22]；在pH 2.5的MRS培養基中作用4 h后，活菌數較0 h處顯著下降(P<0.05)，存活率為87.31%，但活菌數仍在107CFU/mL以上，說明該菌株具有良好的酸耐受性，能夠在低pH環境中保持較好的活性。

2.6 膽鹽耐受性

乳酸菌在通過胃液到達十二指腸后，必須能夠耐受十二指腸中高濃度的膽鹽，以活菌的狀態到達下消化道[23]，仔豬腸道中的膽鹽濃度在0.03%～0.3%變化[24]。由圖6可知，膽鹽對植物乳桿菌NCU156的生長有一定的抑制作用，并且隨著膽鹽質量濃度的升高抑制作用增強。在膽鹽質量濃度分別為1、2 g/L的培養基中，植物乳桿菌NCU156作用6 h后，活菌數出現顯著下降(P<0.05)，存活率分別為47.78%和21.15%，在作用過程中活菌數的緩慢下降可能是由于膽鹽導致細菌細胞膜溶解使菌體內溶物外泄，從而導致細胞死亡[25]；在膽鹽質量濃度為3 g/L的培養基中，作用4 h的存活率為41.88%，作用6 h活菌數由1.17×107CFU/mL降到1.63×106CFU/mL，下降不到1個數量級，說明此菌對膽鹽有一定的耐受性。

圖6 植物乳桿菌NCU156在不同質量濃度膽鹽下生長情況Fig.6 Growth of L.plantarum NCU156 with different bile salts concentrations

2.7 人工動物胃腸液耐受性

植物乳桿菌NCU156在人工胃腸液作用下活菌數變化如圖7。在人工胃液中作用4 h后，植物乳桿菌NCU156的活菌數稍有增加(P>0.05)；在接入人工腸液后，活菌數呈平穩的下降趨勢，在前4 h稍有下降(P>0.05)，5 h處開始出現明顯下降(P<0.05)，說明人工腸液中高質量濃度的膽鹽和胰蛋白酶對植物乳桿菌NCU156有損傷作用。在人工胃腸液中作用10 h后，植物乳桿菌NCU156的活菌數為108CFU/mL以上，滿足乳酸菌在生物體腸道內發揮益生作用的要求[26]。De ANGELIS[11,27]等研究發現，L.plantarum4.1在pH3.0人工胃液作用3 h活菌數稍有下降[10～9.6 lg(CFU/mL)]，在人工腸液中3 h下降約2個數量級，并對其進行了動物飼養實驗，發現L.plantarum4.1順利通過了胃腸道并發揮了益生作用。與L.plantarum4.1相比植物乳桿菌NCU156具有更強的耐酸耐膽鹽性能，可見植物乳桿菌NCU156具有很好的抗胃腸道逆環境能力。

圖7 植物乳桿菌NCU156在人工動物胃腸液中生長情況Fig.7 Growth of L.plantarum NCU156 in artifical animal gastric and intestinal fluids

3 結論

乳酸菌是飼料微生物制劑中常用的菌種之一，利用MRS作為初篩培養基，經過耐酸耐膽鹽復篩、生理生化鑒定及分子生物學鑒定后，確定NCU156為植物乳桿菌。菌株NCU156具有良好的酸耐受性，在pH 2.5的MRS培養基中作用4 h后，存活率為87.31%。植物乳桿菌NCU156有一定的耐膽鹽性能，在膽鹽質量濃度為3 g/L的培養基中作用6 h，活菌數下降不到1個數量級。在人工胃腸液中作用10 h后，植物乳桿菌的活菌數為108CFU/mL以上，可見植物乳桿菌NCU156對人工動物胃腸液有較好的耐受性，可抗胃腸道逆環境。因此，本實驗中植物乳桿菌NCU156在應用于飼料添加劑中有一定的潛力。

[1] 胡遠亮.利用分子生物學技術研究益生菌對斷奶仔豬生長及糞便菌群的影響[D].武漢:華中農業大學,2014:6-8.

[2] 王長彥.微生物發酵飼料替代飼用抗生素技術在商品豬生產中的應用研究[D].咸陽:西北農林科技大學,2008:4-5.

[3] BARTON M D.Antibiotic use in animal feed and its impact on human healt[J].Nutrition Research Reviews,2000,13(2): 279-299.

[4] 杜銀峰.幾種飼用抗生素替代品對肉雞生長消化和免疫性能的影響[D].揚州:揚州大學,2013:6-16.

[5] 劉煒.綠色飼料添加劑在肉雞健康養殖中的應用[D].南京:南京農業大學,2006:7-21.

[6] 王冬梅,耿曉娜,趙寶華.飼用微生態制劑的應用研究進展[J].畜牧與飼料科學,2010,31(2):54-56.

[7] KANMANI P, SATISH KUMAR R, YUVARAJ N, et al. Probiotics and its functionally valuable products—A review[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2013, 53(6): 641-658.

[8] SLEATOR R D. Designer probiotics: Development and applications in gastrointestinal health[J]. World Journal of Gastrointestinal Pathophysiology, 2015, 6(3): 73.

[9] 王芳芳,刁華杰,夏九龍,等.乳酸菌及其發酵飼料在動物生產中的應用[J].飼料研究,2016(1):15-19.

[10] GB 4789.35—2010 食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗[S].

[11] DE ANGELIS M, SIRAGUSA S, BERLOCO M, et al. Selection of potential probiotic lactobacilli from pig feces to be used as additives in pelleted feeding[J]. Research in Microbiology, 2006, 157(8): 792-801.

[12] GUO Xiao-Hua,LI De-Fa,LU Wen-Qing,et al.Screening ofBacillusstrains as potential probiotics and subsequent confirmation of theinvivoeffectiveness ofBacillussubtilisMA139 in pigs[J]. Antonie Van Leeuwenhoek,2006,90(2):139-146.

[13] 熊濤,唐曉星,黃濤,等.產蛋白酶兼性厭氧菌株的篩選, 酶學性質及發酵豆粕應用探究[J].食品科學,2014,35(9):162-167.

[14] CEBECA A,GURAKAN C.Properties of potential probioticLactobacillusplantarumstrains[J].Food Microbiology,2003,20(5): 511-518.

[15] 熊濤,劉妍妍,黃濤,等.副干酪乳桿菌NCU622耐酸耐膽鹽及其黏附性能[J].食品科學,2015,36(5):20.

[16] FUCHSR L,REAMJ E, HAMMOND B G,et al.Safety assessment of the neomycin phosphotransferase II (NPTII) protein[J].Bio Technology,1993,11(13):1 543-1 547.

[17] CROFTS A R,JACKSON J B.Bromothymol blue and bromocresol purple as indicators of pH changes in chromatophores ofRhodospirillumrubrum[J]. European Journal of Biochemistry,1969,10(2):226-237.

[18] R.E.布坎南, N.E.吉本斯等編.伯杰細菌鑒定手冊第八版[M].中國科學院微生物研究所,譯.科學出版社,1984：797-934.

[19] BARMPALIA-DAVIS I M,GEORNARAS I, KENDALL P A, et al. Differences in survival among 13Listeriamonocytogenesstrains in a dynamic model of the stomach and small intestine[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(17): 5 563-5 567.

[20] GARDINER G E, CASEY P G, CASEY G, et al. Relative ability of orally administeredLactobacillusmurinusto predominate and persist in the porcine gastrointestinal tract[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(4): 1 895-1 906.

[21] 周其家, 朱翔宇. 仔豬消化環境與營養代謝調節劑的應用[J]. 畜牧獸醫科技信息, 2011 (5): 56-57.

[22] DUARY R K, BATISH V K, GROVER S. Expression of theatpD gene in probioticLactobacillusplantarumstrains underinvitroacidic conditions using RT-qPCR[J]. Research in Microbiology, 2010, 161(5): 399-405.

[23] 胡斌.植物乳桿菌膽鹽耐受性評價及內在影響因素[D].無錫:江南大學，2015:3-5.

[24] 李琳琳,王雅婷，楊欣,等.豬源乳酸菌的分離及其生物學特性研究[J].西北農林科技大學學報,2016,44(2):1-7.

[25] RUIZL, MARGOLLES A, SANCHEZ B. Bile resistance mechanisms inLactobacillusandBifidobacterium[J]. Frontiers in Microbiology.2013, 4(396). doi:10.3389/fmicb，2013.00396.

[26] ISHIBASHIN, SHIMAMURA S. Bifidobacteria: research and development in Japan[J]. Food Technology, 1993, 47(6): 126-135.

[27] DE ANGELIS M, SIRAGUSA S, CAPUTOL, et al. Survival and persistence ofLactobacillusplantarum4.1 andLactobacillusreuteri3S7 in the gastrointestinal tract of pigs[J]. Veterinary Microbiology, 2007, 123(1): 133-144.

Screening of forage lactic acid bacteria with good tolerance to stimulated animal digestive environments

WANG Yan-ping,XIONG Tao*,HUANG Tao,LIAO Liang-kun

(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Twenty six strains were isolated from fresh litter feces using MRS broth. Seven strains with high tolerance to MRS broth (pH2.0) and MRS broth with 3g/L bile salt were further screened out. Strains G1 and G9 with better properties were respectively identified asLactobacillusplantarumandPedicoccuspentosaceusby morphology, biochemical characteristics and molecular biology identification. Furthermore, the tolerance of NCU156 to acid and bile salt was studied. The animal digestive environments were simulated. The result showed that survival rate of NCU156 was 87.31% after 4h incubation in MRS (pH2.5). After incubation in MRS with 3 g/L bile salt for 6h, the viable count of NCU156 reduced less than an order of magnitude. The viable count increased slightly after incubation in the artificial gastric fluid with pH3.0 for 4h. The number of NCU156 reduced about an order of magnitude, but still above 108CFU/mL after 6 h in artificial intestinal fluid.L.plantarumNCU156 had excellent tolerance to simulated animal digestive environments and had potential to be used in pellet feed.

screening; identification; acid tolerance; bile tolerance; gastrointestinal circumstance

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610010

碩士研究生(熊濤教授為通訊作者,E-mail：xiongtao0907@163.com)。

江西省主要學科學術和技術帶頭人培養計劃(20133BCB22001)；江西省重大科技專項計劃(贛財教字[2014]104號)；"贛鄱英才555工程"領軍人才培養計劃(贛才字[2013]2號)

2016-04-18，改回日期：2016-05-05