超高壓對峰甘板栗中主要微生物的影響及其貨架期預測

郭豪寧，趙玉華,2,3，常學東,2,3*，李聰，姚園

1(河北科技師范學院 食品科技學院，河北 昌黎，066600) 2(河北省板栗工程技術研究中心，河北 昌黎，066600) 3(河北省燕山特色農業技術產業研究院，河北 昌黎，066600)

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超高壓對峰甘板栗中主要微生物的影響及其貨架期預測

郭豪寧1，趙玉華1,2,3，常學東1,2,3*，李聰1，姚園1

1(河北科技師范學院 食品科技學院，河北 昌黎，066600) 2(河北省板栗工程技術研究中心，河北 昌黎，066600) 3(河北省燕山特色農業技術產業研究院，河北 昌黎，066600)

為探討超高壓對真空包裝峰甘板栗微生物及感官質量的影響及建立微生物生長模型預測其貨架期，在16～18 ℃對真空包裝峰甘板栗進行200 MPa(5、10、15 min)、300 MPa(5、10、15 min)、400 MPa(5、10、15 min)、500 MPa(5、10、15 min)超高壓處理。樣品處理后于4 ℃保藏60 d，每隔10 d取樣分析，直至樣品微生物數量達到安全衛生限值1 000 CFU/g及感官質量不可接受為止。結果表明，與空白對照組相比，超高壓處理能顯著降低峰甘板栗初始微生物數量，并對影響貨架期的腐敗微生物：大腸菌群、霉菌、酵母有顯著抑制作用，抑制程度與壓力(200～500 MPa)和處理時間(5～15 min)具有正相關性；試驗中所建立的Gompertz模型能有效地擬合不同超高壓處理峰甘板栗在貨架期間菌落總數的動態變化，有效地評估峰甘板栗的貨架壽命和貯藏安全性，500 MPa處理5、10、15 min均能夠將峰甘板栗4 ℃貯藏微生物貨架期從9 d延長至60 d以上；但結合感官質量評定結果，300 MPa處理15 min最佳可延長貨架期至38 d。

超高壓(ultra high pressure, UHP)；真空包裝；峰甘板栗；微生物；貨架期

峰甘板栗是一種高淀粉的堅果類制品，具有淡雅的鮮栗味，口感甜美，營養豐富。由于加工過程和包裝過程易造成微生物污染導致貨架期很短，即使在真空包裝且冷鏈保藏的條件下，貨架期也只有10天左右，影響峰甘板栗產品的主要微生物是菌落總數、大腸菌群、霉菌及酵母菌、沙門氏菌。

超高壓(ultra high pressure, UHP)殺菌是一種新型非熱殺菌加工技術[1]，應用于蔬菜、肉制品、飲料等不同類型的食品中[2-6]，可以抑制微生物的生長，顯著延長貨架期并不破壞食品營養及感官品質。超高壓食品的可接受性也日趨提高[7]，國外開展了大量的超高壓對食品保鮮方面的研究[8-10]。但是超高壓處理的產品中仍然存在未致死的微生物，它們在保藏過程中會復活、生長從而造成腐敗[11]。為有效控制超高壓處理產品的安全性，預測其貨架期，引入微生物預測模型是一種較好的方法。預測食品微生物學(Predictive Microbiology)是以建立各種食品微生物在不同條件下的特征信息庫為基礎，運用微生物學、工程數學以及統計學進行數學建模，應用計算機配套軟件判斷食品內微生物生長或殘存的動態變化的預測方法，能快速、真實地評估食品的質量和安全性[12-13]。Gompertz函數模型能有效地描述和預報食品微生物的生長狀況。目前，預測微生物學在食品工業中主要應用于食品貨架期的設定和食品的安全評估。針對微生物的預測模型有多種，綜合一級模型、二級模型、三級模型就可以把大部分模型表示出來[14-15]。

本實驗中將200 MPa(5、10、15 min)、300 MPa(5、10、15 min)、400 MPa(5、10、15 min)、500 MPa(5、10、15 min)超高壓處理的真空包裝峰甘板栗4 ℃的貨架期，采用DPS軟件建立微生物生長模型，并用改良的Gompertz模型分析不同超高壓處理條件下峰甘板栗主要腐敗微生物的生長動力學參數，探討超高壓殺菌工藝對峰甘板栗的可行性，同時為該產品貨架期的預測提供參考。

1 材料與方法

1.1 峰甘板栗制備

將鮮板栗冷藏至糖度達到最大，約3個月左右，取出在溫度：18 ℃，相對濕度：46%，光照條件：300 lx的條件下峰甘處理至口感風味最佳，使得水分含量達到33%～40%，可溶性總糖含量到達13%～17%[16]，剝殼，真空包裝。

1.2 超高壓處理

采用中國農業大學的“華泰森淼”HPP.L2-600/2型食品超高壓設備，有效體積為3 L，最高壓力為600 MPa，傳壓介質為水，水溫為16～18 ℃，升壓速率為100 MPa/min，解壓時間為10 s，將包裝好的峰甘板栗進行壓力為200、300、400、500 MPa處理；保壓時間分別為5、10、15 min。

1.3 樣品貯藏

處理后的樣品于(4±1)℃保藏30 d，以超高壓處理后為保藏的第0 d，每隔10 d取樣測定1次，當樣品中的菌落總數超過產品標準規定值1 000 CFU/g[17]則停止取樣，每個處理設置2次重復，3個平行，結果取平均值。

1.4 菌落種類的測定

(1)菌落總數：參照GB4789.2—2010《食品安全國家標準 微生物學檢驗菌落總數測定》。

(2)大腸菌群：參照GB4789.3—2010《食品安全國家標準 微生物學檢驗 大腸菌群計數》第一法，大腸菌群MPN計數法。

(3)霉菌和酵母菌：參考GB4789.15—2010《食品安全國家標準 微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》。

(4)沙門氏菌：參考GB4789.4—2010《食品安全國家標準 微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》。

1.5 感官質量評定

感官質量評定指標包括4個方面:

外觀色澤(產品是否呈現亮淡黃色，有無褐變現象，褐變有零星斑點還是大部分褐變)；氣味滋味(產品有無淡雅的鮮栗香味，有無異味)；口感(是否香甜、軟脆、咀嚼多汁、下咽有甘潤感，有無渣滓感、部分栗肉較苦)；組織狀態(產品的組織是否軟脆，栗仁是否整齊)；由10人組成的感官小組按WILLIAMS[18]9點評分法進行打分。

標準：9=極好，8=很好，7=好，6=次好，5=—般，4=一般下，3=差，2=很差，1=極差；總分≥20且每項評分≥5為可接受。

1.6 數學模型

1.6.1 菌落總數擬合生長模型的建立

采用DPS軟件分析數據，建立響應變量y=LgNt/N0(Nt為貯藏期間的菌落總數，N0為貯藏前的菌落總數)對貯藏時間t的數學模型。

1.6.2 微生物生長動力學初級模型

微生物生長動力學表征的是微生物數量與時間的關系，即微生物生長曲線，也是微生物預報模型中的初級模型，研究表明[19-20]，修正的Gompertz模型可以準確描述微生物(菌落總數、霉菌及酵母、沙門氏菌等)生長的動態趨勢。

Gompertz模型是四參數雙指數方程：

y=a×exp[-exp(b-ct)]

式中：y為t時刻的微生物數目;a、b、c為常數;t為時間。

ZWIETERING等將Gompertz模型中的3個參數a、b、c用具有生物學意義參數進行轉換：

a=A，b=μmeλ/A+1，c=μmλ/A

得到修正的Gompertz方程如下[21]：

lgNt=lgN0+lg(Nmax/N0)×exp{-exp[μmax2.7182/lg(Nmax/N0) ×(λ-t)+1]}及lg(Nt)=lg(Nmax)-A×exp{-exp{[μmax×2.718 2×(-SL)/A]+1}}+A×exp{-exp{[μmax×2.7182×(λ-t)/A]+1}}

式中：t為樣品貯藏時間，d；Nt為t時的菌數，1 g(CFU/g)；Nmax、N0分別為整個貯藏過程中最大和初始菌數，1 g(CFU/g)；λ為微生物生長的延滯期，d；μmax為微生物生長最大生長速率，d-1；e為數學常數，約等于2.718 2。A為從保藏時間t=0開始到微生物數量達到最大值Nmax的時間，d；SL為達到最高活菌數時的貨架期，d。

1.7 數據分析

數據統計使用origin 8.5軟件對數據進行擬合并繪圖及DPS 9.5軟件統計分析及Matlab7.0軟件計算。

2 結果與分析

2.1 超高壓處理對峰甘板栗初始及保藏過程微生物的影響

由圖1和圖2可知，超高壓處理對峰甘板栗微生物具有抑制作用，峰甘板栗對照組樣品初始菌落總數為360 CFU/g，霉菌酵母數量為69 CFU/g，大腸桿菌<3 MPN/g，未檢出沙門氏菌。綜合GB19300—2014《食品安全國家標準 堅果與籽類食品》，DB11/622—2009《果仁、堅果制品衛生要求》，NY/T 1042—2014《綠色食品堅果》規定，產品的衛生要求微生物菌落總數應低于1 000 CFU/g，霉菌低于50 CFU/g，大腸菌群低于3 MPN/g，致病菌(沙門氏菌)不得檢出。與對照組相比，超高壓處理對菌落總數、霉菌酵母有顯著抑制作用，微生物的抑制及殺滅與超高壓水平和處理時間有關。此外，除了500 MPa處理10 min與15 min對霉菌酵母菌的抑制效果顯著高于500 MP對a處理5 min，在處理壓力相同的條件下，處理時間對初始微生物的降低作用沒有顯著性差異。CARPI等[22]對法蘭克福香腸及肖志華等[23]對生鮮豬肉利用600 MPa的高壓分別處理5、10、15、20 min，樣品中菌落總數的降低程度與處理時間(5～20 min)成正相關，這與本試驗結果一致。推斷在一定范圍內超高壓處理強度是壓力水平和處理時間的函數，而壓力水平是抑制效果的最主要影響因素。

圖1 峰甘板栗4 ℃保藏期間菌落總數的變化Fig.1 Growth curves of total bacteria count in Feng Gan chestnut stored at 4 ℃

圖2 峰甘板栗4 ℃保藏期間霉菌及酵母菌的變化Fig.2 Growth curves of yeast and mold in Feng Gan chestnut stored at 4 ℃注：虛線表示峰甘板栗的微生物貨架期標準。

菌落總數的迅速增長并高于微生物標準限量是影響貨架期的主要原因之一，霉菌、酵母菌是真空包裝峰甘板栗4℃貯藏的主要腐敗菌。對照樣在4 ℃保藏中，菌落總數、霉菌酵母菌和大腸菌群數量迅速上升(圖1、圖2)，大腸菌群的數量第10天達3.0 MPN/g，第20天達到3.6 MPN/g，超高壓處理后產品的菌落總數、霉菌及酵母菌經過一段延滯期后迅速上升，最終數量達到與對照組相近的極值，可推斷超高壓處理對微生物有致傷作用，受傷的微生物在后續保藏過程中表現出復活的現象，仍會生長導致腐敗，200 MPa處理5 min與10 min可能對主要腐敗菌的致傷作用有限，使其在良好的環境中很快修復；同時在相同壓力處理條件下，處理15 min對微生物延滯期的延長及生長速率的降低作用更強，推斷處理15 min較處理5 min與10 min對微生物有更強的致傷作用；相同處理時間，壓力的升高(200～500 MPa)，使微生物生長延滯期延長，生長速率降低，可能是壓力的增加增強了對微生物的致傷作用；大腸菌群除了200 MPa、5 min處理第30 d達到3.0 MPN/g其余處理樣始終低于檢測限，超高壓處理影響了真空包裝峰甘板栗貯藏期的菌相構成，但沒有改變其主要的腐敗菌與longo等[24]研究結果一。

菌落總數、霉菌、酵母、大腸菌群和沙門氏菌表現出對壓力處理耐受性的差異，較低壓力處理條件即可將大腸菌群全部抑制，霉菌、酵母對壓力有一定耐受能力，比菌落總數更敏感。可見超高壓處理效果受微生物種類的影響。ANNA等[25]發現600 MPa處理對切片火腿、發酵香腸中大腸桿菌有顯著致死效果。YALDAGARD等[26]研究表明200 MPa處理鮭魚，細菌總數下降30 %，而酵母菌未發生變化，與本試驗結果一致。

2.2 峰甘板栗貨架期間菌落總數生長模型的建立

根據圖1測定的菌落總數計算響應值Y( LgNt/N0)，利用DPS軟件對響應值Y及貨架時間t進行微生物生長模型擬合，擬合方程及其方差分析如表1所示。

由表1可知，通過F檢驗，對照組，F=3 387.831 9F0.05(2，1)=199.5，F=756.404 3>F0.05(2，1)=199.5，證明模型可以較好地擬合不同超高壓條件處理的峰甘板栗在貨架期間菌落總數的動態變化。200 MPa、10 min處理組，F=301.6467>F0.01(2，2)=99.01；200 MPa、15 min處理組，F=318.278 0>F0.01(2，3)=30.81；300 MPa、5 min處理組，F=217.764 8>F0.01(2，3)=30.81；300 MPa、10 min處理組，F=660.704 8>F0.01(2，3)=30.81；300 MPa、15 min處理組，F=593.936 3>F0.01(2，3)=30.81；400 MPa、5 min處理組，F=96.483 9>F0.01(2，3)=30.81；400 MPa、10 min處理組，F=70.952 8>F0.01(2，3)=30.81；400 MPa、15 min處理組，F=77.405 6>F0.01(2，4)=18.00；500 MPa、5 min處理組，F=168.080 9>F0.01(2，4)=18.00；500 MPa、10 min處理組，F=556.840 6>F0.01(2，4)=18.00；500 MPa、15 min處理組，F=305.608 1>F0.01(2，4)=18.00；由此可知，建立的模型在顯著水平(a=0.01)內是極顯著的；其中R2均大于0.97，說明模型可以解釋97%以上試驗所得數據，證明模型可以很好的擬合不同超高壓條件處理的峰甘板栗在貨架期間菌落總數的動態變化。

表1 不同超高壓條件處理的峰甘板栗貨架期間的菌落總數生長模型及其回歸方程方差分析表

續表1

組別方差來源平方和自由度均方F值顯著水平500MPa、5min回歸1.534520.7673168.0809**剩余0.018340.0046Y=1.3905×exp[-exp(0.9889-0.0827t)]R2=0.9882500MPa、10min回歸1.608220.8041556.8406**剩余0.005840.0014Y=1.3899×exp[-exp(1.1650-0.0788t)]R2=0.9964剩余0.010240.0025Y=1.4409×exp[-exp(1.1081-0.0656t)]R2=0.9935

2.3 不同處理組峰甘板栗貨架期的計算

以菌落總數1000 CFU/g作為峰甘板栗的腐敗貨架期標準，根據以上數據及動力學方程(改良Gompertz模型)可得貨架期參數如表2。

表2 峰甘板栗4 ℃保藏過程菌落總數生長動力學參數(μ和λ)及貨架期

結合圖1、圖2及表2可知，與對照組相比，超高壓力越高，處理時間越長，對生長延滯期(λ)及最大生長速率(μmax)影響越大，進而達到延長貨架期目的。相同壓力處理條件下，不同微生物對壓力的耐受程度不同，大腸菌群對壓力處理極為敏感。200 MPa處理10 min及更高壓力處理能夠將其全部抑制。200 MPa處理5 min使大腸菌群的生長速率降低，但未能完全抑制其生長，其結果與高揚[3]研究結果一致。

2.4 峰甘板栗最低貨架期預期

在進行感官質量評定前，根據該試驗品特性、消費者調查報告數據及市場商業化要求，其轉化為產品的貨架期不得低于30 d。

2.5 峰甘板栗的感官質量變化

對達到最低貨架期30 d以上及菌落總數不超過標準的真空包裝峰甘板栗產品進行感官評價(表3)。

表3 峰甘板栗在不同超高壓處理條件下的感官質量評分

由表3可知，高壓對峰甘板栗的外形色澤及組織狀態影響較大，與對照組相比，經過超高壓處理的峰甘板栗外形色澤偏紅黃，評分相對低，但在貯藏過程中色澤保持較好；而組織狀態隨著貯藏時間增長逐漸變軟；300 MPa對峰甘板栗的色澤影響較大，而400 MPa對其氣味滋味影響較大，500 MPa對其組織狀態與外形色澤影響都較大；感官數據結合動力學貨架期，可知300 MPa處理最佳。

超高壓對草莓[27]、萵筍[2]、鮮切蘋果[28]、鮮荔枝[29]、石榴果泥[30]的研究表明，不同高壓對風味物質的保留、產品的機械損傷及膜氧化損傷、硬度與色澤都有不同的影響。故不同高壓對峰甘板栗感官指標的影響需進一步研究機理。

3 結論

(1)超高壓壓力水平的提高與處理時間的延長增強了對峰甘板栗主要微生物的殺滅和抑制效果，在一定范圍內超高壓處理強度是壓力水平和處理時間的函數，而壓力水平是抑制效果的最主要影響因素。

(2)峰甘板栗中菌落總數、霉菌酵母、大腸菌群和沙門氏菌表現出對壓力處理耐受性的差異，較低壓力處理條件即可將大腸菌群全部抑制，霉菌酵母對壓力有一定耐受能力，比菌落總數更敏感。可推斷超高壓處理效果受微生物種類的影響。

(3)超高壓處理對微生物有致傷作用，受傷的微生物在后續保藏過程中表現出復活的現象，仍會生長導致腐敗。試驗中壓力的升高(200～500 MPa)，使微生物生長延滯期延長，生長速率降低，推斷可能是壓力的增加增強了對微生物的致傷作用。

(4)超高壓處理200 MPa達不到延長貨架期至30 d的效果；300 MPa處理對峰甘板栗的色澤有影響，但綜合評價，300 MPa處理最佳；400 MPa處理峰甘板栗其氣味滋味發生明顯的變化；500 MPa對峰甘板栗的組織狀態影響較大。

(5)試驗建立的Gompertz模型擬合程度較高，結合感官質量評定結果，確定300 MPa處理15 min最佳可延長貨架期至38 d。

4 展望

實驗中建立的Gompertz模型能有效擬合不同超高壓處理的峰甘板栗的菌落總數的動態變化，結合修正Gompertz動力學方程，可以預測達到微生物限量時4 ℃峰甘板栗的貨架期，保證峰甘板栗的貯藏安全性。但是微生物生長的初級模型只是模擬了微生物生長與時間之間的近似關系，由于微生物在食品中的生長與所處的環境條件有極大的關系，所以有必要在初級模型中引入環境因子對微生物生長的影響，應用預測微生物學的二級動力學模型。

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Effect of ultra-high pressure on microbial population and prediction to shelf-life of vacuum-packaged Feng Gan Chestnut during 4℃ storage

GUO Hao-ning1, ZHAO Yu-hua1,2,3, CHANG Xue-dong1,2,3*, LI Cong1, YAO Yuan1

1(Hebei Normal University of Science and Technology, Changli 066600 China) 2(Chestnut Engineering Research Center of Hebei, Changli 066600 China) 3 (Yanshan Special Agricultural Technology Industry Research Institute of Hebei, Changli 066600 China)

Vacuum-packaged Feng Gan Chestnut were subjected to ultra-high pressure treatments at 16-18 ℃ and different pressure levels:200, 300, 400 and 500 MPa for 5 or 10 or 15 min before storage at 4 ℃ for 60 days with the aim of investigating the effect of ultra-high pressure on the microbial population and sense, then establishing the microorganism growth model to imitate the shelf life of vacuum-packaged Feng Gan Chestnut. Compared with control samples without receiving any sterilization treatment, ultra-high pressure treatment could dramatically reduce initial microbial count in Feng Gan Chestnut, and inhibit the growth of dominant spoilage bacteria including total bacteria, yeast, mold and coliforms, which was positively related to pressure (200-500 MPa) and length of treatment time (5-15 min). The test indicated that the Gompertz model could effectively imitate the dynamic change of number of bacteria during different storage treatment and the growth model could be used as a tool to powerfully evaluate shelf life and tissue damage. Ultra-high pressure treatment at 500 MPa for 5, 10 and 15 min could prolong the shelf-life of vacuum-packaged Feng Gan chestnut from 9 to over 60 days during 4 ℃ storage. Combined with the sensory quality evaluation results, Ultra-high pressure treatment at 300 MPa for 15 min was best that could prolong the shelf-life from 9 to 38 d.

ultra-high pressure(UHP)；vacuum-packaged；spoilage microorganism；shelf-life

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610031

碩士研究生(常學東教授為通訊作者，E-mail：cxdspx@163.com)。

林業公益性行業科研專項經費項目(201304708)

2016-03-31，改回日期：2016-06-04