全局調控因子CodY在益生菌中的研究進展

馮佳，吳昊，王斌斌，喬建軍

(天津大學 化工學院，制藥工程系，系統生物工程教育部重點實驗室，天津，300072)

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全局調控因子CodY在益生菌中的研究進展

馮佳，吳昊，王斌斌，喬建軍*

(天津大學 化工學院，制藥工程系，系統生物工程教育部重點實驗室，天津，300072)

CodY是一個具有一定的保守性的全局轉錄調控因子，普遍存在于低G-C含量的革蘭氏陽性菌中。對枯草芽孢桿菌、乳酸乳球菌等益生菌的研究表明，CodY對菌株的碳代謝、氮代謝、脅迫響應、營養物質的吸收以及自然感受態等具有重要的調控作用。文中對益生菌中調控因子CodY的結構、調控機制和結合位點進行綜述，并以枯草芽孢桿菌和乳酸乳球菌等為例介紹CodY的調控作用，為進一步改造菌株，探索CodY潛在的調控功能,以及為其在食品發酵中的應用提供參考。

CodY；調控因子； 革蘭氏陽性菌；益生菌

乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌和枯草芽孢桿菌都屬于益生菌，具有不產生毒素和致熱致敏蛋白、非致病性等特點，可用于食品及發酵工業中。乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)屬于乳酸菌的乳球菌屬，可以產生一種多肽物質——乳酸鏈球菌素(Nisin)[1]，是被FDA唯一公認的一種高效的天然食品防腐劑，并廣泛應用于肉制品、魚類制品、果汁飲料等食物的保鮮和防腐中。Nisin進入人體消化道后，會被蛋白酶降解成游離氨基酸并維持正常的菌落環境。但是乳酸乳球菌在發酵過程中不斷產生乳酸，導致pH值降低，不利于Nisin的產生[2]，所以乳酸乳球菌的耐酸調控機制成為研究熱點。枯草芽孢桿菌是重要的工業生產菌株和遺傳改造受體菌株，在工業上廣泛用來生產α-淀粉酶、中性蛋白酶、納豆以及肌苷發酵；在植物病原菌生物防治領域、農業生產、水產養殖、污水處理中也有重要的作用。嗜熱鏈球菌來源于牛乳中，與瑞士乳桿菌等混合發酵生產酸奶和奶酪，可以借助自身合成β-半乳糖苷酶高效利用乳糖為自己的生長提供能量，并且幫助不耐受乳糖的人消化乳糖，但自身合成的蛋白酶的活性很弱[3]，只能利用氨基酸和寡肽來補充氮源，所以氨基酸的合成代謝和寡肽的高效攝取對于嗜熱鏈球菌的生長非常重要。

全局轉錄調控因子CodY普遍存在于低G-C含量的革蘭氏陽性菌中，在面對環境變化時，通過改變轉錄速率調控靶基因的表達水平，對細胞內10%以上的基因進行轉錄調控，從而對細胞代謝做出迅速的調整，構成一個巨大的代謝調控網絡。通過不同的作用機制調控菌體內不同基因的轉錄，幫助細胞適應營養匱乏的環境。目前，CodY的調控作用主要集中在碳代謝、氮代謝以及自然感受態等過程。本文對全局調控因子CodY的結構、作用機制、結合位點以及在乳酸乳球菌、枯草芽孢桿菌和嗜熱鏈球菌的生物功能的研究進展進行了詳細的闡述，為深入了解細菌體內的調控網絡以及解決食品和發酵工業中的問題提供有效的參考。

1 全局調控因子CodY的結構

目前研究較為透徹的是枯草芽孢桿菌CodY 的結構，它是1個具有259個氨基酸殘基的二聚體蛋白，序列高度保守[4]，其結構由C端和N端2部分組成。N端為GAF結構域，是鳥嘌呤三磷酸(Guanosine-5′- Triphosphate，GTP)和分支氨基酸(Branched Chain Amino Acids，BCAAs)2個效應分子的結合位點，這個結構廣泛存在于環核苷酸磷酸二酯酶和腺苷酸環化酶中。當BCAAs作用于CodY時，CodY的構型轉變并再次折疊，從而形成一個疏水口袋，這一疏水口袋既是BCAAs的結合位點，同時構型的轉變會傳遞給C端，激活CodY和DNA的相互作用。在這一過程中，CodY的核心部分及二聚作用界面不發生變化[5]。C端含1個螺旋-轉角-螺旋(“HTH”)結構域，與DNA啟動子區域結合，抑制靶基因的轉錄。每個螺旋含有20個氨基酸且成120角，這種結構有利于螺旋和DNA的相互作用。

通過對CodY的晶體結構的研究，STENZ等[6]歸納出較為簡單易懂的平面結構圖，如圖1，G1、G3和G4是GTP結合位點。通過晶體結構和序列比對發現精氨酸(Arg8)，谷氨酸(Glu144)，谷氨酰胺(Gln15)和蘇氨酸(Thr148)對于CodY二聚體的形成具有關鍵作用[4]。利用定點誘變和DNA結合實驗發現丙氨酸(Ala207)，天冬氨酸(Asp208)，精氨酸(Arg214)和絲氨酸(Ser215)對C端特異性與DNA結合具有重要作用[7]。

在長期的自然進化中，CodY蛋白序列在不同菌中會發生變異，導致CodY結合不同DNA，改變了CodY調控的基因[8]。

圖1 枯草芽孢桿菌CodY二級平面結構圖Fig.1 Structure of Bacillus subtilis CodY

2 CodY的調控機制和結合位點

2.1 CodY的效應分子

全局轉錄調控因子CodY有2個效應分子[9]，分別是 GTP[10-11]和BCAAs[5,12-13]，其中BCAAs包括異亮氨酸，亮氨酸和纈氨酸，它們的存在能提高CodY與DNA結合的活性。GTP和BCAAs既可協調作用于CodY，也可單獨作用于CodY。在不同的菌株中，效應分子對CodY的作用是不同的。例如，在枯草芽孢桿菌中，CodY同時受到GTP和BCAAs的作用，而在肺炎鏈球菌和乳酸乳球菌中，CodY的活性只受到BCAAs的作用，與GTP沒有關系[12]，當細胞處于營養豐富的狀態下，受CodY調控抑制的基因都處于靜止狀態，此時高濃度的GTP可以激活CodY的抑制作用[10]；在培養基里營養物質發生變化時，細菌會改變CodY調控的靶基因的表達模式，在沒有BCAAs結合的情況下CodY會喪失調控大部分依賴于CodY表達的基因的能力。在枯草芽孢桿菌中，由于碳源、氮源或者磷源的缺乏而限制菌體生長時，GTP的濃度下降，CodY就會失去抑制活性，被抑制的基因就會被轉錄激活，同時，由于胞內BCAAs的濃度也下降，進一步增強了下游基因的表達[9]。

2.2 效應分子的來源和CodY的相互作用

在細菌體內，GTP的來源有兩條途徑：(1)從細菌生存的環境中獲取(2)通過合成途徑從5-磷酸核糖經過purCLFMNH和purDEK進行合成。當GTP的水平降低時，會促進一個特殊的反應發生——細胞的嚴謹反應[14]。嚴謹反應是廣泛應用于細菌的壓力響應系統，在營養受到限制時，大量的空載tRNA激活核糖體上的RelA蛋白，由GTP和ATP合成ppGpp或pppGpp調節代謝活動，從而引發細菌的嚴謹反應，如圖2。有研究表明ppGpp或pppGpp對GTP水平的平衡有著關鍵作用，從而影響CodY調控氨基酸代謝途徑。這個過程中，GTP將全局調控因子CodY和細菌嚴謹反應聯系在一起進行氨基酸的代謝調控。

圖2 細胞的嚴謹反應示意圖Fig.2 Rigorous reaction of cells

BCAAs既可以通過ilvBHC和leuABCD合成途徑進行自身合成，也可以通過吸收并利用環境中的氮源加工得到。研究發現CodY對BCAAs的合成途徑也具有調控作用，而BCAAs作為CodY的效應分子，2者相互作用完成CodY對細菌生長的調控作用。

2.3 CodY的作用機制和結合位點

研究發現，CodY至少通過4種不同的機制調控轉錄過程[15]：(1)通過結合到啟動子區域附近發揮正調控，(2)通過結合到啟動子區域附近發揮負調控，(3)通過充當RNA聚合酶的路障發揮負調控作用[16]，(4)通過干擾正調控因子的作用發揮負調控作用。

研究發現在乳酸乳球菌中，CodY蛋白的結合位點必須是一個15 bp的標準的共同回文序列(AATTTTCNGAAAATT)[17]，稱為CodY-box，位于目標啟動子區域-35區附近。HENGST等[18]發現CodY-box普遍存在于葡萄球菌、李斯特菌、芽孢桿菌和鏈球菌中，并通過體外足跡法實驗證實了這個回文序列在其他革蘭氏陽性菌中的保守性。在枯草芽孢桿菌中，CodY調節操縱子區包含重疊的CodY結合位點[19]，這2個獨立作用的CodY高親和位點可以抑制基因ybgE的表達，其中位于轉錄起始位點下游80bp處的位點在調控中發揮主要作用[20]。CodY還可以通過控制sigma因子sigD的表達和活性來直接調控細胞運動和成鏈[21]。研究表明，CodY可以結合于sigD的第1個基因上游位置的PD3和Pfla/che啟動子區，CodY的敲除導致sigD累積量和活性急劇增加，并使得非鏈狀的細胞數量從15%增加到75%，這表明codY是sigD的1個重要的翻譯后調控因子。通過對枯草芽孢桿菌突變體的全基因組分析表明，表達受到影響的基因都沒有CodY結合位點，而有CodY結合位點的基因的表達在codY缺失菌株中不受影響[15]。這些發現也潛在的解釋了CodY通過控制其他調控因子來間接調控基因以及和其他蛋白共同調控相同基因的復雜調控模式。

3 CodY的生物學功能

全局調控因子CodY是作為枯草芽孢桿菌中寡肽通透酶(dppABCDE)操縱子的抑制物被發現的[22]，隨后發現CodY對芽孢的形成和穩定期早期基因的表達有重要的調控作用[23]。DNA微陣列、染色質免疫沉淀與微陣列(ChIP-chip)、體外DNA結合實驗、大規模并行測序(IDAP-Seq)和轉錄組測序分析(RNA測序)等表明， CodY直接或者間接調控枯草芽孢桿菌中200多個基因的表達[15]，調控作用主要表現為基因表達抑制。通過對CodY調控細菌的碳代謝、氮代謝和自然感受態等研究，可以通過基因編輯技術改造CodY，得到基因工程改造菌株，用于食品和發酵工業中。下面以CodY在枯草芽孢桿菌、乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌中的調控作用對CodY的生物學功能進行詳細介紹。

3.1 CodY對碳和能量代謝的調控作用

碳代謝是細菌體內能量來源的主要途徑，當細胞處于脅迫環境中，細菌會改變代謝方式來增加ATP應對脅迫環境，而CodY作為全局調控因子，對菌體碳代謝的過程具有重要的調控作用。在枯草芽孢桿菌中，調控因子CcpA主要對碳代謝途徑具有調控作用，并控制了菌體內10%的基因的表達[24]。當枯草芽孢桿菌處于營養豐富的情況下，ROBERT等[25]發現乳酸激酶基因ackA受CcpA和CodY的共同正調控，且作用是累積的，CodY通過和CcpA共同作用于乳酸激酶和乳酸脫氫酶使丙酮酸轉化為乳酸或乙酸，體外實驗中CodY結合到ackA啟動子區域的兩個位點，并激活ackA轉錄，不同于負調控，影響CodY活性的只有BCAAs一個效應分子，具體調控機制見圖3。

圖3 CodY和CcpA共同調控作用機制示意圖Fig.3 Common regulation mechanism of CodY and CcpA(AlsS and IlvBH: α-acetolactate synthetase; AlsD: α-acetolactate dehydrogenase; PDH: pyruvate dehydrogenase; PTA, phosphotransacetylase; ACK, acetate kinase; LDH: lactate dehydrogenase. Bold lines with arrow heads indicate positive regulation by CcpA or CodY; bold blunted lines indicate repression of gene expression by CcpA or CodY.)

嗜熱鏈球菌的碳代謝過程主要是乳糖代謝過程，通過β-半乳糖苷酶以及半乳糖代謝途徑(Leloir途徑)利用乳制品中的乳糖，生成UDP-半乳糖和1-磷酸葡萄糖，后者在磷酸變位酶的催化下生成6-磷酸葡萄糖。研究發現，缺失codY的枯草芽孢桿菌中磷酸變位酶STND_1003、STND_1004和STND_1007的轉錄顯著上調，從而更加充分地利用半乳糖產生乳酸，因此調控因子CodY對半乳糖的調控作用是通過對磷酸變位酶的轉錄調控實現的。

3.2 CodY對氮代謝的調控作用

全局調控因子CodY在氮代謝方面有重要的調控作用，包括寡肽轉運、氨基酸降解途徑、胞外蛋白酶以及支鏈氨基酸的生物合成。

在乳酸乳球菌里，全局調控因子CodY作為蛋白水解的中央調控因子被發現，作為一個全局調控因子[18]，對一系列的細胞功能的表達都具有調控作用，包括營養物質運輸、大分子降解、氨基酸代謝和肽代謝等[26]。與枯草芽孢桿菌不同的是，乳酸乳球菌的CodY只受BCAAs這一個效應分子的影響，而BCAAs的濃度決定了CodY的調控作用，所以BCAAs對菌體的生長非常重要。研究發現CodY對細胞內氨基酸的合成也具有負調控作用，包括纈氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸、絲氨酸[26]和谷氨酸[27]的合成。

乳酸乳球菌CodY可以抑制包括寡肽轉運蛋白(oppopt)、肽酶(pepC，pepN)[28]和轉氨酶(araT,bcaT)[29]相關基因的表達。其中轉氨酶(bcaT)在BCAAs的合成代謝中發揮關鍵作用，支鏈酮酸在轉氨酶的作用下可以合成BCAAs，促進CodY的調控作用。作為枯草芽孢桿菌中的通透酶BcaP的遠親，乳酸乳球菌中的通透酶BcaP 除了對BCAAs有作用外還對蛋氨酸有運輸作用[30]。

BELITSKY等[31]發現在基本培養基里枯草芽孢桿菌內在的CodY效應分子池足夠去調控一些基因，但是在存在BCAAs和其他氨基酸的培養基里，CodY顯示出最高的活性。因此，BCAAs通透酶的活性和BCAAs攝取的效率對CodY的激活起著關鍵的作用。研究表明，有3個通透酶(BcaP、BraB和BrnQ)作用于異亮氨酸和纈氨酸的高效攝取過程，同時失活這3個通透酶時對CodY活性的影響。更多的研究表明，至少有一個通透酶作用于亮氨酸攝取過程和異亮氨酸及纈氨酸的運輸過程。編碼寡肽通透酶的基因dtpT，被ScoC直接負調控，而CodY通過抑制ScoC間接激活dtpT基因的表達[32]。同時opp操縱子也負責編碼一個寡肽通透酶，與孢子的形成和基因感受態相關。研究證明opp直接被CodY和ScoC共同抑制，而不會被CodY或者ScoC單獨影響，這種聯合作用保證了當其中一個調控因子失去活性的時候保持對opp的抑制作用，但是作用會減弱[32]。

AprE和NprE是枯草芽孢桿菌中兩個重要的胞外蛋白酶，占總胞外蛋白酶活性的95%以上，它們是由幾個多效轉錄因子共同調控表達的，包括AbrB、DegU,、ScoC和 SinR。在營養豐富的培養基中， AprE和NprE僅在指數期后期大量表達。CodY是另一個調控因子ScoC的抑制子，在缺失codY的菌株中，ScoC的過表達很少或不會對AprE和NprE產生去阻遏作用；而在含有CodY的菌株中，缺失scoC對AprE和NprE的表達沒有影響，所以CodY通過限制第二抑制子ScoC的合成間接正調控AprE和NprE[33]。GIULIA等[34]通過構建vpr-lacZ或者mpr-lacZ融合菌株使CodY結合位點失活，發現CodY對枯草芽孢桿菌中的胞外蛋白酶(Vpr和Mpr)的表達具有直接負調控作用，同時vpr的啟動子不僅受CodY調控同時也是sigma H依賴型啟動子。在缺失codY的菌株中，Vpr蛋白表達量顯著提高。同時，枯草芽孢桿菌中的CodY對編碼肽轉運蛋白(Dpp和App)、胞內肽酶(DppA)以及胞內蛋白酶(IspA)的基因都具有負調控作用[35]。

在嗜熱鏈球菌中，調控因子CodY對谷氨酸脫氫酶(gdhA)、氨基酸合成和轉運和ABC轉運蛋白的轉錄具有調控作用[38]。

3.3 CodY對脅迫響應的調控作用

在枯草芽孢桿菌中，Com分泌途徑是蛋白質分泌途徑之一，而Com家族和自然感受態相關，CodY對comK具有負調控作用[36]。研究發現CodY的結合位點也位于乳酸乳球菌中自然感受態相關蛋白基因(coiA、comEA、comEC和comGC)的上游[37]，說明在細菌面對脅迫環境時，不僅通過改變碳、氮代謝來應對脅迫，也通過CodY對自然感受相關基因的調控，提高菌體對外源DNA的攝入，來獲得有利于應對脅迫環境的基因，使菌株更好地生長。

ONUR等[44]利用凝膠阻滯實驗通過堿基替換證實了乳酸乳球菌中CodY-box與CodY的相關性，發現CodY基序位于轉錄調節基因、細胞分裂機制相關基因(ddl、murCDFG、mutM、papL、parC、r/minF、rexB、truA和yacB)和嘌呤代謝過程相關基因(guaC和purHL)的上游。這說明在菌體面對饑餓環境時，為了適應惡劣的環境，CodY對于細胞的嚴謹反應和嘌呤代謝等過程具有重要的調控過程。在嗜熱鏈球菌中，CodY可以抑制雙組分系統(TCS01)的轉錄，并調控與脅迫相關基因的轉錄，如分子伴侶蛋白DnaK以及和氧脅迫、滲透壓脅迫相關的基因[38]。

3.4 CodY在一些毒力菌株中的調控作用

調控因子CodY對一些有毒力的菌株也具有調控作用。LOBEL等[39]發現CodY可以激活李斯特菌的鞭毛生物合成相關基因的轉錄，促進和哺乳動物細胞的細菌性黏附，并首次驗證了CodY對細菌的運動性、抗脅迫、毒力相關功能和適應性等生物代謝途徑的調控作用。TAYLOR等[40]在小鼠實驗中發現relA突變會引起毒力的喪失，缺失codY后減弱了relA突變帶來的影響，使毒力功能恢復，說明至少有一個毒力因子是被CodY調控的，而relA突變喪失了減弱GTP濃度使CodY活性降低的能力[41]。在梭狀芽胞桿菌、炭疽芽孢桿菌和釀膿鏈球菌中，調控因子CodY可以間接地激活毒力因子相關基因的轉錄[42-44]。在蠟樣芽孢桿菌中CodY是調控毒力基因的重要因子，同時也是ces操縱子的阻遏蛋白[45]。在金黃色葡萄球菌中，當菌體處于極度營養缺乏狀態時，才會利用codY去限制對菌株的損害，缺失codY的菌株會發生毒力基因，蛋白酶等的去阻遏作用，激活下游基因的表達[46]。

在蘇云金芽孢桿菌中，調控因子CodY也可以調控蘇云金芽孢桿菌孢子的形成、聚-β-羥基丁酸酯的生物合成、菌體生長、基因的自然感受和翻譯過程。QI等[47]通過細菌單雜交和凝膠遷移實驗發現蘇云金芽孢桿菌中自然感受基因comEA基因含有一個保守的10bp大小的CodY結合位點(TTTCAGAAAA)，這說明CodY可以直接調控“com”基因。研究發現CodY通過控制調控因子PlcR的信號肽PapR的輸入對PlcR調控的毒力基因進行調控，同時發現OppA不是PapR識別的唯一底物結合蛋白，還有其他類似于OppA的蛋白對信號肽進行運輸[48]。

4 總結與展望

全局轉錄調控因子CodY具有非常重要的調控作用，可正向和負向對相關基因的轉錄進行直接調控或間接調控，從而控制細菌的生長活動。GTP和BCAAs作為CodY的兩個效應分子，可以幫助細胞感受營養和能量狀態，從而促進CodY對基因表達的調控作用。通過和這兩個效應分子結合，CodY發生二聚作用并被激活，從而結合到基因啟動子區域的一段共同回文序列上發揮調控作用。作為全局調控因子，CodY對細菌的碳代謝、氮代謝、支鏈氨基酸代謝、營養物質的吸收、運動功能、趨藥性、致病性、大分子的降解、芽孢形成、抗生素的合成、毒力，環境適應以及自然感受態等相關基因都具有調控作用。

細菌體內的CodY和其他調控因子共同發揮作用組成了細菌體內的聯合調控網絡，如全局調控因子AbrB，基因citB和citZ的抑制子CcpC，碳代謝的調控因子CcpA[25]，以及自然感受相關基因ComK[49]。然而，CodY和其他調控因子之間形成的調控網絡還需要進一步探究。CodY對CRISPR/Cas系統也具有調節作用[38]，但是相關機制還需要進一步探究。由于CodY對菌株自然感受相關基因也具有調控作用，所以通過研究CodY和自然感受之間的調控機制對構建耐受性菌株也具有一定的價值。同時通過對CodY對毒力因子的調控作用機制研究，為定向改造毒力菌株也提供了一定的參考。CodY的深入研究有助于全面了解細菌在面對營養匱乏環境時的作用機制，為利用基因工程改造技術獲得適用于食品和發酵工業中的菌株奠定基礎。

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Advances in research on global regulatory factor CodY of probiotics

FENG Jia, WU Hao, WANG Bin-bin, QIAO Jian-jun*

(Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, Tianjin University, Tianjin 300072, China)

CodY is a highly conserved global regulator of transcription in most Gram-positive bacteria. Studies onBacillussubtilisandLactococcuslactisand other probiotics show that CodY-regulated genes are involved in carbon or nitrogen metabolism, environmental stress responses, absorption of nutrients, genetic competence and other relevant processes. The structure, regulatory mechanisms and binding sites of CodY are summarized in this article, which may provides effective reference for further exploration of the potential regulatory functions of CodY and manufacture and modification of probiotics.

CodY; regulator; Gram-positive bacteria; probiotics

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610037

碩士研究生(喬建軍教授為通訊作者,E-mail：jianjunq@tju.edu.cn)。

2016-04-05，改回日期：2016-05-11