駱駝凝乳酶的分子結構與制備干酪的研究現狀

普燕，馬曉林，張富春，李軼杰

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆 烏魯木齊，830046)

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駱駝凝乳酶的分子結構與制備干酪的研究現狀

普燕，馬曉林，張富春*，李軼杰

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆 烏魯木齊，830046)

駱駝凝乳酶與牛凝乳酶有著相似的一級結構和三級結構，但二者對牛乳的親和力、催化速率卻有著較大的差異，研究其分子水平上的不同，對今后凝乳酶的蛋白質工程改造有著重要意義。同時駱駝凝乳酶制備干酪苦味少，聯合駱駝凝乳酶與改良發酵劑制備新型低質、低鹽干酪也成為干酪研發的方向之一。該文綜述了駱駝凝乳酶的結構、酶學特性、與底物結合的分子研究以及制備干酪等方面的內容。

凝乳酶；駱駝；底物親和力；晶體結構；干酪

凝乳酶(EC3.4.23.4)是一種酸性蛋白酶[1]，廣泛存在于新生哺乳動物的胃中。凝乳酶能凝固乳液，延長母乳在新生動物消化道中的存留時間，從而使母乳的營養能充分被小動物吸收[2]。利用凝乳酶凝固乳液這一特性，人們從未斷奶小動物(小牛、羔羊等)胃中提取凝乳酶并廣泛用于干酪制作。不同動物來源的凝乳酶特性不同，即使干酪制備工藝完全相同，制備的干酪質地與風味也不盡相同。其中小牛凝乳酶凝乳活力高，對乳中κ-酪蛋白水解快速而專一，同時對乳中其它蛋白的水解活性低，即c/p值高，這一特性能使凝乳過程中使更多乳蛋白存留在凝塊中，在干酪成熟過程中，其對凝乳中蛋白水解少，從而干酪的出品率高，產生的苦味肽少，口味好，故小牛凝乳酶一直被認為是最佳的制備干酪的凝乳酶。

2006年，KAPPELER等人[3]首次從單峰駝(Camelus dromedarius)體內克隆了凝乳酶基因，在黑曲霉(Aspergillusniger)中成功表達，并檢測了其酶學特性。與小牛凝乳酶比較，發現駱駝凝乳酶對牛乳的凝乳活力比小牛凝乳酶高70%，但非特異蛋白水解活力才相當小牛凝乳酶的20%，這使得駱駝凝乳酶的c/p值是小牛凝乳酶的7倍。在理論上，c/p值是評判凝乳酶制備干酪性能優劣的一個重要標志。高c/p凝乳酶制備干酪可能會得到更高的出品率和更好的風味。

2009年，BANSAL等人[4]用駱駝凝乳酶制備cheddar干酪，并以小牛凝乳酶制備的干酪作為對照。2種干酪均在相同的條件下制備，但是由于駱駝凝乳酶的凝乳活力比小牛凝乳酶高，故為保證添加的凝乳酶量使乳液在相同的時間和條件下，達到相同的切割硬度，則駱駝凝乳酶的用量比小牛凝乳酶用量少。制備出的兩種干酪在組分和pH沒有任何差異；但是初級水解程度(以pH4.6可溶性氮表示)，駱駝凝乳酶要比小牛凝乳酶低。SDS-PAGE分析乳蛋白被水解的情況，兩種干酪中的β-酪蛋白都被乳液中固有存在的血纖維蛋白溶酶(plasmin)水解成β-CN(f29-209)，β-CN(f106-209)和β-CN(f108-209)，但小牛凝乳酶在干酪成熟過程中產生了β-CN(f1-189/192)肽，此肽在駱駝凝乳酶制備的干酪中沒有檢測到，這或許是駱駝凝乳酶的用量少，或許是駱駝凝乳酶的非特異水解活性更低，也或許是二者的綜合作用結果。而β酪蛋白水解產生的β-CN(f1-189/192)，β-CN(f193-209)和β-CN(f190-209)小肽會造成干酪的苦味。以上結果也暗示駱駝凝乳酶制備的干酪苦味更低。2種酶對αs1-酪蛋白的水解產物基本相同，但駱駝凝乳酶制備的干酪在成熟180 d時對其水解量才相當于牛凝乳酶制備干酪30 d水解量，這與駱駝凝乳酶的用量低和非特異水解活力較低均有關。2種干酪中游離氨基酸的含量沒有顯著差異，這也許是因為游離氨基酸主要是乳酸菌(發酵劑和非發酵劑)的肽酶產生之故。比較干酪成熟的質地，成熟30 d時2種干酪的硬度和咀嚼性沒有顯著差別，成熟150 d時駱駝制備干酪硬度和咀嚼性測定值均高于小牛凝乳酶制備干酪，180 d時2種干酪的總體感官相似，但是駱駝凝乳酶制備干酪硫強度、肉湯味和苦味均較低。

駱駝凝乳酶比小牛凝乳酶有更高的c/p以及更優越的制備干酪的性能。丹麥科漢森公司就通過黑曲霉大量發酵駱駝凝乳酶并上市，與此同時，駱駝凝乳酶的基因和蛋白序列[5]、用駱駝凝乳酶制備干酪[6]已被申請國際專利。如今駱駝凝乳酶已經成功地成為了小牛凝乳酶的替代品，人們不但沒有因此止步，反而對駱駝凝乳酶的研究變得更為積極和深入，為了更好地了解駱駝凝乳酶對牛乳的高凝乳活力、高催化效率的機制，從酶的晶體結構、酶對牛乳中α-、β-、κ-酪蛋白的水解肽譜、酶與κ-酪蛋白結合的分子水平等方面進行深入研究。由于牛凝乳酶的相關研究非常多，故在研究駱駝凝乳酶的過程中，也總是伴隨著與牛凝乳酶研究結果的比較。同時，為了便于描述，我們將駱駝凝乳酶camel chymosin縮寫為CC，牛凝乳酶bovine chymosin縮寫為BC，酪蛋白casein縮寫為CN。

圖1 預測駱駝凝乳酶的二級結構Fig.1 The secondary structure prediction of the camel chymosin預測網址(the structure prediction URL)http://linux1.softberry.com/berry.phtml？ topic=pps & group=programs & subgroup=propt

1 駱駝凝乳酶的基因與結構

1.1 駱駝凝乳酶的基因

駱駝凝乳酶原前體(pre-prochymosin)基因含有9個外顯子[3]，開放閱讀框含有1146個核苷酸，編碼381個AA，N-端前16個AA為信號肽(pre-peptide)，中間42個AA為激活片段(activation segment或propeptide)，C-端323個AA為成熟凝乳酶(chymosin)。酶信號肽剪切位點、酶原激活位點以及成熟酶的氨基酸數等信息完全與牛凝乳酶相同，同時駱駝凝乳酶氨基酸序列與牛凝乳酶氨基酸序列相似度(sequence identity)和序列相似性(sequence similarity)分別為85%和94%，但48個不同AA散布于整個酶，而不是集中在某個區域[2]。

1.2 駱駝凝乳酶的結構

1.2.1 預測駱駝凝乳酶原的二級結構與三級結構

通過預測網站對CC酶原與BC酶原的二級結構和三級結構進行預測，發現CC與BC在一級結構上的高相似度，使得其也具有相似的二級結構和三級結構(見圖1和圖2)，包括α-螺旋、β-折疊形成的位置、個數等。二級結構預測中，N端都有一個α-螺旋，這是兩個酶原前體的信號肽，隨后propeptide的N端是β-折疊，后面接著3個α-螺旋，這個預測結構與已經報道的豬胃蛋白酶原和網站預測的駱駝凝乳酶原和牛凝乳酶原的三維結構中propeptide結構吻合。同時在豬胃蛋白酶原中，N端的β-片層位于酶的活性中心，防止底物進入，在pH中性環境中，酶原不具催化活性[7-8]，而預測的駱駝和牛凝乳酶原的propeptide結構環繞在凝乳酶2個結構域中間裂隙的周圍，2個催化Asp位于裂隙中間，故酶活性中心同樣被propeptide結構封閉而不表現出活性。

A豬胃蛋白酶原A晶體結構 [7]；B和C分別表示預測的駱駝凝乳酶原和牛凝乳酶原三級結構圖2 豬胃蛋白酶原A晶體結構[7]和預測駱駝與牛凝乳酶原三級結構Fig.2 The crystal structure of swine pepsin A and the tertiary structure prediction of the bovine and camel chymosin(預測結構網址：http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)

成熟凝乳酶的序列從第59位開始，在預測的二級結構圖中，連接propeptide和成熟凝乳酶之間是無規則卷曲，這也方便酶活化時的構象改變。目前認為天冬氨酸蛋白酶原的活化過程為：propeptide與酶的活性位點以靜電作用結合，propeptide的存在阻止了底物進入酶活性中心，故酶原在中性環境里不具有催化作用；當pH降低，propeptide與酶活性中心的靜電作用被破壞，此時propeptide的構象發生改變，酶原的自剪切位點暴露并與酶活性中心結合，酶對該位點進行切割，propeptide從酶活性中心解離，酶的N端發生構象改變，形成一個反式β折疊位于底物與酶結合的裂隙處[8](見圖3箭頭所指)。

圖3 牛凝乳酶和駱駝凝乳酶的晶體結構[11]Fig.3 The crystal structure of the bovine and camel chymosin [11]

1.2.2 駱駝凝乳酶的晶體結構

牛凝乳酶的晶體結構模型已見多次報道[9-10]，但是駱駝凝乳酶的晶體結構直到2013年才由JENSEN等人[11]首次報道(見圖3)。為了便于將BC和CC結構進行比較，其也同時獲得了BC晶體結構，該結構與以前研究報道的牛凝乳酶晶體結構完全相同。CC與BC晶體結構上最大的不同之處在于其N端，BC晶體顯示其N端形成了一個反平行式β-折疊(見圖3箭頭所指)。而CC的晶體結構其N端少了10個AA。將CC晶體復水溶解，對其進行N-末端分析、質譜分析和檢測凝乳活力，發現其活力下降，且其活力與N端缺失了3個AA的凝乳酶變體[11]相似(見表1)。

2 駱駝凝乳酶的理化特性與酶學特性

2.1 駱駝凝乳酶的理化特性

在黑曲霉中表達獲得的駱駝凝乳酶分子質量為35.6 k～40.3 kDa(糖基化不同)[3,11]；等電點理論值為4.85，但實測值為5.5。

JENSEN等[11]人對黑曲霉表達的駱駝凝乳酶進行層析分離，根據洗脫的先后順序分離出6個凝乳酶變體(variant)，其疏水性和等電點均不同，研究者又通過N-末端分析、質譜和差示掃描量熱法對每個凝乳酶變體進行分析，得出表1數據。

表1 黑曲霉表達的重組駱駝凝乳酶分離出的不同變體[11]

黑曲霉中的蛋白，若存在Asn-X-Thr/Ser(X為谷氨酸或脯氨酸)序列時，黑曲霉將會對該序列中Asn的Nδ2原子進行糖基化，駱駝凝乳酶存在2個糖基化位點：Asn100和Asn290，其中Asn100更易被糖基化[11]。由表1看出， 1和2中雙位點被雙糖基化，3和4是單位點被糖基化，同時其差異性可能是糖基化差異產生的，而5和6沒有被糖基化，其差異產生原因還需研究。值得注意的是， N端缺失3個AA的變體1，凝乳活力很低。JENSEN等人[11]選取凝乳酶變體2進行了晶體結構研究(見圖3)。

2.2 駱駝凝乳酶的酶學特性

早在1993年，WANGO[12]就用駱駝rennet 和牛rennet對駝乳和牛乳進行凝乳研究，發現牛rennet對駝乳凝固主要是牛胃蛋白酶組分的作用，而牛凝乳酶幾乎不凝駝乳。2006年，KAPPELER等也發現重組駱駝凝乳酶不能凝固牛乳[3]。

SALIHA等[13]用來自不同年齡(1、3、9年)的駱駝胃粘膜粗提物GEC1、3、9對駝乳和牛乳進行凝乳實驗，同時用商品化的牛rennet(80%凝乳酶、20%胃蛋白酶)和商品化牛胃蛋白酶作對照，結果發現GEC9駱駝胃蛋白酶的粗提物對駝乳和牛乳的凝乳效果最好，GEC9凝乳活力為牛rennet的2倍，但對牛乳的蛋白水解活力才是其58.3%。對重組駱駝凝乳酶的蛋白水解活力檢測也證實了其蛋白水解活力低于牛凝乳酶[2,14]。

關于黑曲霉表達的重組駱駝凝乳酶的最適作用溫度和pH、熱穩定性、pH穩定性、c/p值等情況見表2。

表2 幾種重組凝乳酶的酶學特性

注：重組駱駝凝乳酶和牛凝乳酶由黑曲霉表達，重組水牛凝乳酶和山羊凝乳酶由畢赤酵母表達。

從表2看出，駱駝凝乳酶的熱穩定性和c/p值高于牛凝乳酶。但關于駱駝凝乳酶的催化效率，有不同的報道。VALLEJO等人[14]比較了4種重組凝乳酶催化效率，底物為牛κ酪蛋白，結果山羊凝乳酶最高，而駱駝凝乳酶最低。KAPPELER等人[3]以合成的牛和駱駝κ酪蛋白P8-P3′的11個氨基酸多肽為底物，檢測駱駝凝乳酶和牛凝乳酶的催化效率為152 mM-1s-1和268 mM-1s-1。M?LLER等人[15]以牛κ酪蛋白為底物，通過計算凝乳酶切割牛乳κ-酪蛋白產生的副-κ-酪蛋白和糖巨肽的產生量，得出駱駝凝乳酶催化效率比牛凝乳酶高15%。

3 駱駝凝乳酶對牛乳中主要乳蛋白水解的肽譜分析

3.1 κ-CN水解肽譜

M?LLER等人[15]用毛細管電泳和反相液相色譜-質譜技術分析了CC和BC作用于牛乳κ-CN的最初水解位點(pH6.5，32 ℃)。結果顯示2種酶均對κ-CN進行特異性剪切，即切割κ-CN的Phe105-Met106之間的肽鍵，產生副-κ-CN和糖巨肽。

3.2 αs1-CN水解肽譜

M?LLER等人[16]采用CC和BC水解αs1-CN 24 h(pH6.5，30 ℃)，將pH4.6-可溶性氮進行毛細管電泳和反相高效液相色譜分析，結果見表3。

表3 CC和BC水解αs1-CN 24 h的水解肽數[16]

分析水解肽段序列得出，CC和BC都優先水解αs1-CN的Phe23-Phe24肽鍵，繼而水解Leu101-Lys102肽鍵，產生的f102-199，經BC繼續水解最終檢測到14條肽，而CC只檢測到4條，二者共有肽3條。即 CC和BC對αs1-CN的水解位點開始保持一致，只在水解后期出現各自水解特異性。

3.3β-CN水解肽譜

CC和BC優先水解β-CN中的Leu192-Tyr193，從而導致疏水性f193-209肽的大量積累。BC在水解進行的12 h內即可完全水解β-CN，但CC對該肽的水解速率只有BC的7%。接下來，CC水解的肽鍵是Leu165-Ser166和Phe190-Leu191，對BC來說，其后續水解的肽鍵是Leu165-Ser166、Gln167-Ser168和Ala189-Phe190。最后，f1-192會被CC和BC在Ser57-Leu58、Leu163-Ser164和Trp143-Met144處切割，而BC還會在Ser142-Typ143位點切割，得到最終的水解肽譜。

3.4 駱駝凝乳酶制備干酪苦味較低的原因分析

干酪制備時，極少量存留于凝塊中的凝乳酶會在干酪成熟過程中水解凝乳里αs1-CN和β-CN。已知這些蛋白水解肽中有些肽會造成干酪的苦味，影響干酪的口感。已報道用CC制備的干酪比BC制備的干酪，苦味少、硬度高，結合上述CC和BC對乳蛋白的水解肽譜分析，解釋如下：

(1)在相同的酶濃度下(IMCU)，比較CC和BC水解αs1-CN和β-CN最初位點的水解速率，CC水解速率只相當于BC的36%和7%，這樣，經歷相同的干酪成熟時間，CC可能水解產生的苦味肽數量少；

(2)BC水解β-CN的肽譜中存在f168-189和f190-192，而CC的水解肽譜中沒有這兩個肽，M?LLER等人認為這2種疏水肽增加了干酪的苦味；

(3)在pH5.2的條件下，BC對β-CN深度廣泛水解，切割β-CN中的93-94和127-128之間的肽鍵，這可能是干酪苦味增加的重要因素，若使用CC則可能不會切割這2個位點[16]。

4 駱駝凝乳酶與κ-CN底物特異結合的分子研究

4.1 結合位點的命名

為方便而清楚描述酶的活性位點與κ-CN結合情況，SCHECHTER和BERGER對酶與底物結合的AA進行了命名。從κ-CN剪切位點算起，往κ-CN N-端方向，依次AA命名為P1、P2、P3……Pn，往κ-CN C-端方向，依次AA命名為P1′、P2′、P3′……Pn′。舉例：駱駝κ-CN的剪切位點為Phe97-Ile98，那么Ser96、Phe97、Ile98和Ala99 就命名為SerP2、PheP1、IleP1′和Ala P2′。同理與κ-CN P1、P2、P3……Pn相互作用的酶活性裂隙中的亞位點結構(subsite)依次命名為S1、S2、S3……Sn和S1′、S2′、S3′……Sn′。由于酶對底物的特異性結合與酶的亞位點結構有關，故這些亞位點結構又被稱為“特異性口袋”(specificity pocket)[2,11]。

4.2 駱駝凝乳酶與κ-CN的親和力

M?LLER等人[15]根據凝乳酶切割牛乳κ-CN產生的副-κ-CN和糖巨肽的產生量，計算出CC和BC的Km和Kcat。結果顯示CC與牛κ-CN結合的親和力比BC與牛κ-CN結合的親和力(Km)低約30%，但結合的轉換數(Kcat)卻高出60%，這樣，計算酶的催化效率(Kcat/Km)，CC高出約15%。在局部，CC表面負電荷叢(cluster)的電子密度低，可能減弱了與牛κ-酪蛋白C端的His-Pro正電荷叢的靜電作用，這樣降低了CC對底物的親和力，加速了酶與底物的解離。

4.3 駱駝凝乳酶的表面靜電荷

JENSEN等人[11]在pH6.65(牛乳的生理pH)條件下計算CC和BC的表面靜電荷總值和pI值，CC為-9ec和4.8，BC為-15ec和5.4。CC的表面正電荷區域比BC更大，其原因可能是：在凝乳酶的C端，CC的56位為His，而BC是Gln，即此處CC多了1個帶正電荷的AA；在凝乳酶的N端，CC的249和251位分別為不帶電的Asn和Gly，而BC此處為兩個Asp，帶負電荷；同時，BC中242、254、278 的這3個位點都不帶電荷，而CC中為3個帶正電的AA(Arg、Arg和Lys)，由此形成了1個新的正電荷區域；在凝乳酶的底部，BC中的150和316位分別是2個不帶電荷的AA，而CC為2個Arg，又形成了1個正電荷區域[11]。

凝乳酶在κ-CN的Phe105-Met106位點進行切割，研究顯示κ-CN酶切位點附近有幾個帶正電荷的AA，而pH6.65環境下凝乳酶表面總體靜電荷為負，這樣有利于二者相互作用。但κ-CN的C端由于存在幾個Asp和Glu而表現出帶負電荷特性，可能因此會出現與凝乳酶的相互排斥。因CC表面負電荷較少，該排斥會明顯小些。然而，從CC和BC表面帶正電荷區域來看，正電荷區域可能正好位于底物結合裂隙外部，這也許能幫助酶調整方向使得酶表面的正電荷與κ-CN的C端負電荷作用。一般認為凝乳酶C端區域的負電荷叢與κ-酪蛋白His98-His102正電荷叢之間的靜電吸引，對酶與底物的特異結合有重大作用。SAFRO等[17]提出，κ-CN His98-His102正電荷叢接近凝乳酶的Gln240-Cys250，從而定置在酶表面活性位點裂隙的附近，因為Gln240-Cys250酸性殘基電子密度的明顯改變，造成酶伸展，似乎更適合底物在活性位點靠靜電作用定位。JENSEN等人[11]還強調了Glu245、Asp247、Asp249和Asp251對吸引κ-CN His-Pro正電荷叢的作用。綜上，κ-CN帶負電荷的C端，其既被凝乳酶表面的正電荷吸引，又被負電荷排斥，這樣有利于κ-CN結合到酶的活性位點的C端。CC底部的帶正電荷區域對吸引κ-CN負電荷的C端可能也很重要。故CC表面存在更多的正電荷區域，這似乎對CC較BC高的凝乳活力做了一些解釋[11]。還有，CC表面的負電荷叢比較BC不是很適合與κ-CN His98-His102正電荷叢相互作用，這樣可能使酶與底物親和力(Km)弱，同時可能造成水解完成后酶與底物的更快解離(Kcat)，這也給我們改進酶的凝乳活力提供了一條新思路。

B?RSTING等人[18]研究不同乳液pH對存留在凝乳中駱駝凝乳酶酶量影響，以BC為對照。乳液設定不同pH，用相同凝乳酶活力的CC和BC凝乳后離心，檢測乳清中的凝乳酶活力(以合成肽Pro-Thr-Glu-Phe-(NO2-Phe)-Arg-Leu為底物，HPLC檢測催化產物的量)，結果發現乳液pH為6.00～6.65時，CC存留在凝乳中的量非常恒定，約20%，而牛凝乳酶的殘留量卻幾乎呈線性上升，從2%增至21%。作者分析，CC對pH的低依賴性可能是由于CC分子帶負電荷的量少于BC之故。

4.4 凝乳酶/κ-CN片段復合物模型

PALMER等人[19]先前建立了牛凝乳酶和牛κ-CN片段復合物的模型，該模型符合已有的牛凝乳酶實驗數據。S?RENSEN等[2]人采用同源模型和分子動力模擬技術，對CC、BC分別與牛、駱駝κ-CN片段形成的復合物進行分析。κ-CN片段選取切割位點附近的16AA肽，序列見圖4。復合物表示形式為：凝乳酶/κ-CN，則4種復合物分別是BOV/BOV、BOV/CAM、CAM/CAM和CAM/BOV(BOV代表牛凝乳酶和牛酪蛋白片段，CAM代表駱駝凝乳酶和駱駝酪蛋白片段)。建立的同源模型將BOV/BOV當作比對模板。

圖4 κ-CN片段的序列Fig.4 The AA sequence of the κ-CN圖中箭頭處為酶的切割位點

分析復合物中酶的波動性，發現波動大的區域為loop和轉角。總體上，酶的動力學非常相似，只有在酶的C端波動存在較明顯差異。同時復合物中的P3-P2′殘基都很穩定，但結合裂隙靠外部的殘基波動大，這也說明底物與酶的結合并不是非常堅固，BOV/CAM和CAM/BOV都是在酶的C端、κ-CN片段N端顯現出較大波動。通過模型分析，4種酶與底物復合物結構相似，BOV/BOV、CAM/CAM和CAM/BOV復合物結合穩定，BOV/CAM在結合亞位點比較其它模型較不穩定，原因可能是由于牛凝乳酶221位的Lys殘基與駱駝κ-CN P4位上的Arg殘基之間存在電荷排斥而導致[2]。

4.5 凝乳酶/κ-CN復合物的結合自由能研究

S?RENSEN等人[20]使用分子力學Poisson-Boltzmann表面積法(molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area ，MM-PBSA)計算BOV/BOV和CAM/BOV復合物中酶與底物結合的自由能(ΔG)。BOV/BOV的ΔG為-42.8 kcal/mol，CAM/BOV的ΔG為-33.4 kcal/mol，表明BOV/BOV結合力更強。其又用丙氨酸掃描計算(alanine scanning calculations)方法來分析BOV/BOV和CAM/BOV復合物中各個殘基對結合自由能的貢獻。丙氨酸掃描計算結果用ΔΔG表示，描述將復合物中的殘基突變為Ala后結合自由能的改變。ΔΔG為負數時，表示突變結果能增強酶與底物的結合，ΔΔG為正數時，表示突變結果減弱酶與底物的結合。復合物中的牛κ-CN片段為97-112肽，序列為R-H-P-H-P-H-L-S-F-M-A-I-P-P-K-K，將其中的7個AA殘基突變為Ala來計算自由能的變化(突變殘基見圖5)，這相當于把CC和BC的一級結構的差異通過能量學進行近似的量化。

圖5 突變κ-CN殘基Fig.5 The mutated residues in the κ-CN(框內的殘基為突變殘基，箭頭處表示酶的切割位點)

在所有替換中，只有BOV/BOV中HisP4Ala突變的ΔΔG為負，其它均為正。將極性和非極性能分開比較，單看極性能(ΔEpolar)發現HisP4、LeuP3、PheP1和MetP1′突變為Ala時能量變化對結合有利。這暗示運用突變去除不利的極性作用，而保留非極性作用，將有望提高結合自由能。比如說，將一個極性AA用一個大小相同的非極性AA替換，對凝乳酶分子進行蛋白質改造。

5 駱駝凝乳制備干酪的研究

隨著人們對健康和安全要求的提高，CC運用到低脂、低鹽干酪制備工藝中，并與改進發酵劑共同促進干酪優良質地與風味的形成。

B?RSTING等[21]用CC加工的低脂切達干酪，蛋白酶解程度較低，苦味少，但斷裂應力較高，表現為較硬的干酪質構。然而用BC加工的低脂切達干酪，由凝乳酶催化作用釋放的苦味肽β-CN(f193-209)，或者由發酵劑蛋白酶產生的αS1-CN (f1-23) 肽含量都較高，干酪的質構較軟。

GOVINDASAMY-LUCEY等[22]用CC制備低脂cheddar干酪(牛乳中脂肪含量0.5%，酪蛋白和脂肪比例為5∶1)，用BC作為對照，結果顯示干酪的成分與pH值二者無差異，質構分析數據顯示，兩種干酪的硬度和咀嚼性隨著干酪成熟不斷下降，但CC制備干酪的這兩個參數均高于BC制備干酪。感官分析，CC制備干酪苦味少，并且更耐嚼，BC制備干酪質地軟些。CC制備干酪中苦味雖然降低了，但沒有完全消除。

MOYNIHAN等[23]用CC制作低水分-部分脫脂(LMPS)Mozzarella干酪，成熟期間的總鈣和可溶性鈣、pH、水分均無差別。成熟84 d，二者的熔化特性相似，制作披薩時，CC制備干酪起泡少，堅固并耐嚼。同時CC制備干酪在焙烤披薩表現出的特性，包括起泡性、干酪絲的厚度、硬度和咀嚼性均可以在更長的成熟期得以維持，故延長了干酪的貨架期。

為了抵消低鹽(0.85%w/w，正常為1.8%w/w)契達干酪的負面感官，MB?LLER等[24]使用不含谷氨酸鹽脫羧酶的發酵劑與駱駝凝乳酶，并聯合使用瑞士乳桿菌LactobacillushelveticusCHCC 4481 和戊糖乳桿菌LactobacilluspentosusCHCC 13992制備干酪。結果駱駝凝乳酶能大大降低苦味肽β-CN(f193-209)和αS1-CN(f1-9)的形成，同時瑞士乳桿菌提高了對這些苦味肽的降解，增加了風味氨基酸的釋放量，因為使用的發酵劑不含谷氨酸鹽脫羧酶，從而積累了更多的游離谷氨酸。戊糖乳桿菌在成熟的150 d內成功地將檸檬酸全部轉化為風味增強物質——琥珀酸鹽。作者認為運用上述的發酵劑、輔助發酵劑和凝乳酶，其相互補充、聯合作用具備改進低鹽干酪質地的潛力。

6 展望

重組駱駝凝乳酶的克隆與純化開辟了凝乳酶研究的新方向，它目前成功地成為了小牛凝乳酶的替代品并已用來工業化制備干酪。對其高凝乳活力和高催化效率的探索可以讓人們對現有的凝乳酶進行蛋白質工程改造，創造出具更高凝乳活力、更低非特異蛋白水解活力、加工特性穩定以及能作用不同底物(如駝乳κ-酪蛋白等)的新型酶。

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Research progress on molecular structure and Cheese-making of the camel chymosin

PU Yan，MA Xiao-lin, ZHANG Fu-chun*，LI Yi-jie

(Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology， Xinjiang University，Urumqi 830046，China)

The preliminary structure and three dimensional structure of camel chymosin are similar to that of bovine chymosin, but their affinity and catalytic rate acting on bovine casein are different significantly. Studying the difference between the both chymosins on molecular level has great significance for chymosin protein engineering in future. The cheese made with camel chymosin has less bitter taste. Now combination of camel chymosin and the improved cheese starter to produce new type of low-fat, low salt cheese will be a new way for development of cheese in future. The progress of the structure and enzymatic properties of camel chymosin, the molecular basis of interaction between the substrates and enzyme，as well as the cheese made with the camel chymosin were reviewed in this paper.

chymosin; camel; affinity; crystal structure; cheese

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610038

博士，講師(張富春為通訊作者，E-mail：zfcxju@gmail.com)。

新疆大學博士啟動基金(BS150237)；國家自然科學基金(31560440)

2016-03-19，改回日期：2016-04-27