氧化去木質素玉米芯同步糖化發酵產2,3-丁二醇

崔有志，杜麗平,2，馬立娟,2*，宋盼，姜風超，馬清，肖冬光,2

1(天津科技大學 生物工程學院，工業發酵微生物教育部重點實驗室, 天津，300457)2(天津食品安全低碳制造協同創新中心，天津， 300457)

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氧化去木質素玉米芯同步糖化發酵產2,3-丁二醇

崔有志1，杜麗平1,2，馬立娟1,2*，宋盼1，姜風超1，馬清1，肖冬光1,2

1(天津科技大學 生物工程學院，工業發酵微生物教育部重點實驗室, 天津，300457)2(天津食品安全低碳制造協同創新中心，天津， 300457)

2,3-丁二醇是一種重要的平臺化合物。選取經過堿性高錳酸鉀(APP)預處理后的玉米芯為底物，采用陰溝腸桿菌EnterobactercloacaeCICC10011通過同步糖化發酵工藝(SSF)發酵產2,3-丁二醇。通過對SSF主要工藝參數進行優化，確定最適宜工藝條件為：底物濃度120 g/L，纖維素酶添加量40 FPU/g，木聚糖酶添加量12 000 U/g，發酵溫度35 ℃，初始發酵pH 5.5，轉速180 r/min。在最優發酵條件下，以APP預處理后的玉米芯為底物連續發酵36 h，2,3-丁二醇的濃度為21.5 g/L，轉化率為0.27 g/g(以纖維素和半纖維素為參照)；分別是未處理的玉米芯為底物時的8.41倍和8.71倍。

玉米芯；去木質素；同步糖化發酵；2,3-丁二醇；工藝優化

2,3-丁二醇(2,3-butanediol，2,3-BD)是一種無色無味的透明液體，廣泛應用于化工、食品、燃料和航空航天領域[1]。作為一種重要的平臺化合物，2,3-丁二醇的研究越來越受到重視。目前，利用微生物發酵法生產2,3-丁二醇的報道較多，但原料大多以成本較高的葡萄糖、蔗糖、乳糖、木糖等為主[2]，因此，采用自然界中資源豐富的可再生資源木質纖維素為原料，是實現生物法低成本工業化生產2,3-丁二醇的可行策略。

目前，木質纖維素生物質轉化利用的經典技術路線為原料預處理、酶解糖化、發酵轉化為生物燃料和其他高附加值化學品[3]。由于木質纖維素生物質中纖維素組分通常被木質素層層包裹，并與半纖維素交聯纏繞，這種復雜的網絡結構是生物質轉化過程中的天然抗降解屏障[4]。因此，去木質素是解除木質纖維素天然抗降解屏障、提高糖苷水解酶作用效率的首要任務。在目前常用的木質纖維素預處理方法(離子液法、酸堿預處理法、蒸汽爆破法、臭氧預處理法等)中[5]，堿性試劑和強氧化劑組合的預處理方法可有效去除生物質中的木質素，同時破壞半纖維素、纖維素之間的氫鍵和纖維素的晶體結構，從而破壞生物質中的頑抗結構[6-7]。據報道，堿性過氧化氫作為一種堿性氧化劑應用于玉米芯的處理中，木質素去除效果明顯[8]。

在我們的前期研究中，首次采用堿性高錳酸鉀(APP)預處理木質纖維素，結果表明，該方法能夠有效破壞木質纖維素3個組分之間的化合鍵連接，去除玉米芯中大部分木質素，利于后期的酶解[9]。由于強氧化劑高錳酸鉀普遍應用于給水處理，既可以將水中的有機物氧化，也可以對水中有機物進行吸附等，起到除臭、除錳以及除鐵等作用[10-11]，與臭氧、二氧化氯以及氯等氧化劑相比，高錳酸鉀的安全性更高[12]，較堿性過氧化氫穩定性更高、成本更低，因此，具有可行的工業化應用前景。

本研究利用APP預處理后的玉米芯為發酵原料，采用同步糖化發酵工藝(SSF)生產平臺化合物2,3-丁二醇，探究堿性氧化劑處理后的木質纖維素發酵生產2,3-丁二醇的能力，分析不同因素對APP預處理玉米芯發酵的影響，以期為木質纖維素生物質的高效生物轉化提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

玉米芯(纖維素 35.34%，半纖維素 34.32%，木質素 15.81%)購自天津周邊郊區，粉碎至粒度大小為0.18 mm，備用。取玉米芯按照固液比例1∶20加入質量分數為2%堿性高錳酸鉀溶液(pH11～12)，50 ℃下預處理6 h，所得玉米芯殘渣用自來水洗至中性并烘干至恒重[9]，備用。

1.1.2 菌種

陰溝腸桿菌(EnterobactercloacaeCICC10011)，購自中國工業微生物菌種保藏中心。

1.1.3 酶制劑

纖維素酶液: 190 FPU/mL；木聚糖酶液: 32 000 U/mL，湖南尤特爾生化有限公司贈予。

1.1.4 培養基

斜面培養基(g/L)：蛋白胨20，酵母浸粉10，葡萄糖20，pH自然。

種子培養基(g/L)：葡萄糖20，酵母浸粉5.0，KH2PO46.0，K2HPO414.0，(NH4)2SO42.0，檸檬酸鈉 1.0，MgSO4·7H2O 0.4，EDTA-Na 0.05，pH 6.0。

同步糖化發酵培養基(g/L)：玉米芯殘渣 80，酵母粉 10，(NH4)2SO42，KH2PO414.0，K2HPO46.0，MgSO4·7H2O 0.4，檸檬酸鈉 1.0，pH 5.5。

以上培養基均在115 ℃下，濕熱滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 底物混合酶解

準確稱取2.0 g玉米芯(或玉米芯殘渣)絕干樣品于250 mL三角瓶中，按照一定固液比加入0.05 mol/L、pH 4.8的檸檬酸緩沖液。混合液中纖維素酶添加量為30 FPU/g，木聚糖酶添加量為 8 000 U/g，水解體系總體積為40 mL。在50 ℃、搖床轉速150 r/min的條件下振蕩酶解72 h。離心，獲得酶解上清液進行單糖和還原糖的測定。

1.2.2 同步糖化發酵

在250 mL三角瓶中，分別裝入 45 mL同步糖化發酵培養基和5 mL種子液，初始同步糖化發酵條件為：玉米芯底物濃度80 g/L，初始pH 5.5，溫度35 ℃，揺瓶轉速為150 r/min，木聚糖酶添加量為8 000 U/g，纖維素酶添加量30 FPU/g。對同步糖化發酵各條件分別進行優化。

1.3 分析方法

1.3.1 玉米芯中各組分含量的測定

玉米芯中纖維素、半纖維素和木質素含量的測定參照美國可再生能源實驗室(NREL)標準分析規程LAP-002[13]。

1.3.2 還原糖的測定

酶解液中的總還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定[14]，取l.0 mL稀釋液至25 mL具塞試管中，加入3 mL DNS試劑，放入沸水浴中反應5 min，迅速冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25 mL，混勻。測定540 nm波長下酶解液的吸光值(OD)，同時用葡萄糖標準溶液制作標準曲線。

1.3.3 2,3-丁二醇質量濃度和糖組分的測定

葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、纖維二糖、2,3-丁二醇的定量分析采用高效液相色譜法(HPLC)測定，使用Bio-Rad HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm)，柱溫65 ℃，流動相為0.005 mol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，上樣量20 μL，使用RI示差折光檢測器，外標法定量。

1.4 底物混合酶水解糖得率

葡萄糖得率計算公式為：

(1)

其中，YG為葡萄糖得率，%；V酶為酶解液的體積，mL；CG為酶解液中葡萄糖濃度，g/L；W樣為所取玉米芯樣品的質量，g；PG為玉米芯樣品中纖維素百分含量，%。

木糖得率計算公式為：

(2)

其中，YX為木糖得率，%；V酶為酶解液的體積，mL；CX為酶解液中木糖質量濃度，g/L；W樣為所取玉米芯樣品的質量，g；PH為玉米芯樣品中半纖維素百分含量，%。

還原糖得率計算公式為：

(3)

其中，YR為還原糖得率，%；V酶為酶解液的體積，mL；CR為酶解液中還原糖濃度，g/L；W樣為所取玉米芯樣品的質量，g；PZ為玉米芯樣品中綜纖維素(纖維素及半纖維素)百分含量，%。

1.5 2,3-丁二醇轉化率

轉化率(Y)的計算公式為：

(4)

其中，C1為2,3-丁二醇質量濃度，g/L；C2為發酵液中綜纖維素(纖維素及半纖維素)的質量濃度，g/L。

2 結果與分析

2.1 預處理前后玉米芯的酶解比較

堿性高錳酸鉀預處理(APP)后玉米芯各組分的含量分別為：纖維素 36.33%，半纖維素 30.40%，木質素 9.14%。由此可見，木質素脫除率為53.21%，纖維素和半纖維素保留率分別為94.56%和81.47%。將APP預處理前后的玉米芯分別按照不同的固液比進行酶解實驗，酶解后糖的得率結果見表1。

表1 不同固液比條件下的酶解結果

由表1可知，不同固液比條件下，APP預處理后玉米芯酶解液中葡萄糖得率均高于未經預處理玉米芯的。當酶解固液比為1∶40時，APP預處理后玉米芯酶解12 h，酶解液中葡萄糖得率是未處理玉米芯酶解液中的1.75倍，還原糖得率是未處理的1.6倍；72 h時APP預處理玉米芯的葡萄糖得率為未處理的1.25倍，還原糖得率是未處理的1.38倍。但隨著固液比增加，APP預處理前后葡萄糖和還原糖得率相差不明顯。APP預處理后玉米芯酶解液中木糖得率在低固液比時比未處理玉米芯中高，但在高固液比時低于未處理的玉米芯。當固液比提高至1∶10時，檢測發現APP預處理玉米芯酶解液中纖維二糖濃度遠大于未處理的，表明高固狀態下APP預處理后玉米芯在酶解過程受阻，大量纖維二糖無法進一步水解為葡萄糖單糖。

在高固狀態下酶解效率降低的原因很多，一方面對于堿性高錳酸鉀預處理來說，KMnO4中的Mn7+在反應過程中降至Mn6+和Mn4+，在玉米芯的預處理過程中可能生成例如MnO2之類的氧化物，此類氧化物具有吸附有機物的功能[15]。酶解過程中低價態錳氧化物可能吸附纖維素酶和木聚糖酶，從而影響酶解效果。另一方面，酶解“固體效應”廣泛存在，可能與底物效應、產物抑制、纖維素酶吸附等許多因素有關[16]。另外，在固體濃度較高條件下，APP預處理后玉米芯酶解液中存在pH升高現象，溶液pH值的較大改變可能阻礙玉米芯進一步酶解。而在較小的酶解固液比條件下時，酶解液中pH值變化較小，對酶與玉米芯接觸影響較小，從而相比未處理玉米芯酶解出更多的還原糖。

2.2 同步糖化發酵條件優化

2.2.1 纖維素酶添加量

陰溝腸桿菌主要利用葡萄糖代謝產2,3-丁二醇，在玉米芯殘渣的酶解液中，葡萄糖是主要的單糖成分。纖維素酶的添加量主要影響玉米芯殘渣中纖維素的酶解，在同步糖化發酵過程中改變纖維素酶的用量，實驗結果如圖1所示。2,3-丁二醇的產量和轉化率隨纖維素酶的添加量增加而增大，但當纖維素酶添加量超過40 FPU/g時，2,3-丁二醇的產量和轉化率沒有明顯的變化。當纖維素酶添加量超過60 FPU/g時，2,3-丁二醇的產量和轉化率反而呈下降趨勢。纖維素酶添加量主要影響同步糖化發酵過程中酶解葡萄糖量，這與陰溝腸桿菌利用酶解葡萄糖發酵時間與酶解量協同作用有緊密的關系。考慮到成本問題，選取40 FPU/g作為下一步優化纖維素酶用量，此時，2,3-丁二醇產量為12.05 g/L，轉化率為0.15 g/g。

圖1 纖維素酶添加量對SSF的影響Fig.1 Effects of cellulase dosage on SSF

2.2.2 木聚糖酶添加量

在同步糖化過程中，木聚糖酶不僅可以酶解玉米芯殘渣中半纖維素分解出木糖，還可以促進纖維素酶對纖維素組分的酶解。圖2顯示了不同木聚糖酶添加量條件下的發酵結果。當木聚糖酶添加量從1 600 U/g升高至12 000 U/g時，2,3-丁二醇的產量和轉化率均隨之升高，單位產量從0.16升至0.27 g/g。這與木聚糖酶能破壞木質纖維素的結構，促進混合酶解效率有關。當木聚糖酶添加量為16 000 U/g時，2,3-丁二醇產量略微下降，過量的木聚糖酶會導致產物抑制，從而不利于糖的酶解，間接導致2,3-丁二醇產量的下降。綜合考慮，選取12 000 U/g作為下一步優化工藝的木聚糖酶活用量。

圖2 木聚糖酶添加量對SSF的影響Fig.2 Effects of xylanase dosage on SSF

2.2.3 底物質量濃度

由于發酵底物為固體，其濃度影響發酵體系中的酶解、物質的傳遞和溶解氧，是2,3-丁二醇發酵過程中的重要影響因素。不同底物濃度對2,3-丁二醇產量及轉化率的影響結果如圖3所示。

圖3 底物濃度對SSF的影響Fig.3 Effects of substrate concentration on SSF

由圖3可見，當底物濃度從40 g/L逐漸升高至140 g/L時，2,3-丁二醇產量也不斷地提高，轉化率在濃度為80 g/L時達到最大值0.27 g/g。但是當底物濃度大于120 g/L時，發酵混合液十分黏稠，不利于控制pH，嚴重影響了氧的溶解，使得發酵體系中傳質受阻，2,3-丁二醇的轉化率下降。綜合2,3-丁二醇產量和轉化率，選取120 g/L作為適宜的同步糖化發酵底物濃度。

2.2.4 初始pH值

發酵液體系中，纖維素酶、木聚糖酶酶解最適pH值范圍為4.8～5.0，而陰溝腸桿菌最適生長pH為5.5～6.0。適宜的pH值能提高陰溝腸桿菌的代謝轉化效率，提高2,3-丁二醇的產量[17]。

從圖4數據可知，在pH為4.5～5.0時，2,3-丁二醇產量較低，主要是由于陰溝腸桿菌在較低pH環境中代謝受到抑制。當pH值大于6時，發酵初始酶解效率變低，2,3-丁二醇產量也隨之下降。經過APP預處理后的玉米芯，部分醚鍵、酯鍵結構被堿性高錳酸鉀氧化，甲氧基和羰基會結合發酵液中的H+使得發酵環境pH的回復在某一數值。在以APP預處理后玉米芯為底物的同步糖化發酵過程中，發酵體系中pH值會慢慢的回復至6.5。pH值緩慢升高至6.0～6.5時有利于協同陰溝腸桿菌的代謝發酵，但當前期發酵條件不適合酶解或者前期發酵環境pH較快回復到6.0～6.5時，發酵菌種則會由于缺少足夠的酶解糖源而導致菌種自溶，整體代謝受到抑制，導致發酵周期延長或者2,3-丁二醇產量降低。當pH值為5.5時，2,3-丁二醇產量為19.28 g/L，2,3-丁二醇轉化率為0.24 g/g。可以得出，在pH 5.5的條件下，玉米芯酶解糖化與2,3-丁二醇發酵協同效率最大。

圖4 初始pH值對SSF的影響Fig.4 Effects of initial pH on SSF

2.2.5 轉速

陰溝腸桿菌是兼性厭氧菌微生物，在微氧條件下代謝生成2,3-丁二醇。搖床轉速決定著發酵液中的溶氧，不同轉速條件下發酵結果如圖5所示。

圖5 轉速對SSF的影響Fig.5 Effects of rotate speed on SSF

當轉速為200 r/min和250 r/min時，2,3-丁二醇產量迅速降低，轉化率接近0。這可能是因為轉速過大，產生的剪切力對陰溝腸桿菌細胞起到了損壞作用。另一方面，菌體在以APP預處理玉米芯為底物的培養基中高溶氧狀態中可能發生自溶，無法利用后期發酵液中酶解糖，從而導致2,3-丁二醇產量降低。轉速為180 r/min時，2,3-丁二醇的產量為21.50 g/L，2,3-丁二醇的轉化率為0.27 g/g。以未處理玉米芯為底物同步糖化發酵36 h時，2.3-丁二醇產量為2.56 g/L轉化率為0.031 g/g。結果表明，在APP預處理條件下玉米芯的結構發生變化利于同步糖化發酵。在最優條件下，預處理后玉米芯發酵產2,3-丁二醇產量是未處理的8.41倍，轉化率是未處理的8.71倍。

2.2.6 同步糖化發酵結果比較

為綜合比較APP預處理后玉米芯殘渣發酵性能，根據已報道的稀酸、稀堿處理方法[18]，對玉米芯進行預處理，預處理后玉米芯殘渣酶解結果如表2所示。經稀酸、稀堿、APP預處理和未處理玉米芯在上述優化SSF條件下進行，實驗結果如圖6所示。

圖6 不同方法預處理后玉米芯發酵2,3-丁二醇產量-時間曲線Fig.6 The time curve ofthe yield of 2,3-butanediol with corncob pretreated by different pretreatment methods

由圖6可知，在相同發酵條件下，以未處理玉米芯為底物的SSF過程中，2,3-丁二醇的產量一直較低。在72 h時，未處理玉米芯同步糖化發酵2,3-丁二醇的產量為3.33 g/L。在0-60 h內，APP預處理發酵2,3-丁二醇產量高于稀酸預處理，可能在SSF過程中的pH值緩慢回復與細菌發酵協同更利于2,3-丁二醇的發酵，也可能與錳離子可以促進微生物的代謝有關[19]。綜合表1數據可知，相比APP預處理，稀酸預處理后玉米芯更易于酶解糖化，所以SSF后期稀酸預處理玉米芯發酵產量大于APP預處理，發酵108 h時發酵產量達到23.09 g/L。稀堿預處理后玉米芯SSF過程中2,3-丁二醇產量最高，堿預處理可以大量溶解去除玉米芯中木質素，并且酶解液中葡萄糖和木糖含量較高，利于陰溝腸桿菌的同步代謝利用。

對比表1和圖6，APP預處理與未處理玉米芯在相同酶解條件下，APP酶解總還原糖產量低于未處理玉米芯，但2,3-丁二醇發酵產量一直大于未處理玉米芯。APP預處理法能除去木質纖維素原料中抑制發酵的木質素、酚類等物質，未處理玉米芯發酵培養基pH值發酵過程中會回復至4.5-5.0，這個pH范圍會抑制 2,3-丁二醇的發酵。所以，在發酵過程中，發酵抑制物和pH值在2,3-丁二醇的SSF發酵過程十分重要，是限制生物質發酵的主要影響因素。同步糖化發酵108 h，APP預處理后玉米芯發酵2,3-丁二醇產量為18.34 g/L，是未處理玉米芯發酵產量的5.5倍。

3 結論

目前，國內外在木質纖維素的預處理中，對堿性氧化劑預處理方法的研究文獻較少。本研究表明，堿性高錳酸鉀作為一種堿性強氧化劑，對玉米芯進行去木質素預處理后能顯著改變玉米芯的酶解效果。以堿性高錳酸鉀預處理后的玉米芯為發酵底物，采用同步糖化發酵工藝，通過發酵條件優化發現，發酵抑制物和pH值是限制生物質發酵的主要影響因素。在最優條件下，2,3-丁二醇的產量為21.50 g/L，轉化率為0.27 g/g，分別是未處理的8.41和8.71倍。堿性高錳酸鉀預處理能顯著提高以玉米芯為底物的發酵2,3-丁二醇的產量。上述研究結果為提高木質纖維素降解率、降低酶解糖化成本提供了可行的方案和理論指導，對實現木質纖維素生物質的高效降解和生物轉化具有重要的意義。

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Optimization of 2,3-butanediol production using simultaneous saccharification and fermentation from corncob after delignification by oxidant

CUI You-zhi1, DU Li-ping1,2, MA Li-juan1,2*, SONG Pan1, JIANG Feng-chao1, MA Qing1, XIAO Dong-guang1,2

1(Key Laboratory of Industrial Microbiology, Ministry of Education, College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China) 2(Tianjin Food Safety & Low Carbon Manufacturing Collaborative Innovation Center, Tianjin 300457, China)

2,3-butanediol is an important potential platform chemical. In this work, corncob delignified by alkaline potassium permanganate pretreatment (APP) was used as the substrate to produce 2,3-butanediol byEnterobactercloacaeCICC10011 through simultaneous saccharification and fermentation (SSF) process. The optimal conditions for SSF were as follows: substrate concentration 120 g/L, cellulase loading 40 FPU/g, xylanase loading 12 000 U/g, initial pH 5.5, temperature 35 ℃, and the rotate speed 180 r/min. After 36 h fermentation under the optimal SSF conditions, the yield of 2,3-butanediol was 21.5 g/L and the conversion rate was 0.27 g/g (based on cellulose and hemicellulose) with the APP-pretreated corncob as the substrate, which were 8.41 and 8.71 times of those with the un-pretreated corncob as the substrate respectively.

corncob; delignification; simultaneous saccharification and fermentation; 2,3-butanediol; optimization

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610002

碩士研究生(馬立娟博士為通訊作者,E-mail：malj@tust.edu.cn)。

天津科技大學青年教師創新基金資助(2014CXLG10)；工業發酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業微生物重點實驗室(天津科技大學)開放基金資助(2014IM101)；天津市自然科學基金重點項目(16JCZDJC31800)

2016-05-04，改回日期：2016-06-07