吡蟲啉對蜜蜂幼蟲的室內(nèi)毒性研究

譚麗超，卜元卿，程燕，周軍英，單正軍

1. 環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所，南京 210042 2. 南京信息工程大學 江蘇省大氣環(huán)境與裝備技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210044

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吡蟲啉對蜜蜂幼蟲的室內(nèi)毒性研究

譚麗超1,*，卜元卿1,2，程燕1，周軍英1,2，單正軍1,2

1. 環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所，南京 210042 2. 南京信息工程大學 江蘇省大氣環(huán)境與裝備技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210044

吡蟲啉是目前使用最廣泛的新煙堿類農(nóng)藥，其不合理使用破壞蜜蜂的嗅覺記憶能力，影響采集行為，導致多種亞致死效應。利用室內(nèi)人工飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲技術(shù)，選取意大利蜜蜂幼蟲為研究對象，經(jīng)3 d適應性飼養(yǎng)后，連續(xù)3 d喂食含不同濃度的吡蟲啉日糧，測定蜜蜂幼蟲的存活率、化蛹率和羽化率，評估吡蟲啉對蜜蜂幼蟲生長發(fā)育影響。結(jié)果表明，吡蟲啉處理劑量為15 ng·幼蟲-1時，并不影響蜜蜂幼蟲存活率、化蛹率和羽化率；當處理劑量達到150 ng·幼蟲-1時，蜜蜂幼蟲羽化率下降，但不影響蜜蜂幼蟲的存活率和化蛹率；幼蟲7 d半數(shù)致死劑量為2 300 ng·幼蟲-1。高劑量吡蟲啉對蜜蜂幼蟲存活率、化蛹率和羽化率均存在影響，處理劑量越高，存活率、化蛹率和羽化率越低，呈高度負相關(r=-0.99，-0.94，-0.89)，同時蜜蜂幼蟲的羽化時間延長。研究可為吡蟲啉的合理使用提供科學參考。

吡蟲啉；蜜蜂幼蟲；室內(nèi)毒性

蜜蜂是自然界授粉昆蟲中種類最多、數(shù)量最大的類群，全球約87.5%的開花植物依靠蜜蜂等昆蟲授粉[1]，其中87種為主要糧食作物，占世界糧食總產(chǎn)量的35%[2-3]。無論是人工飼養(yǎng)還是野生存在的蜜蜂，都在作物授粉方面發(fā)揮著巨大作用[4-5]。最近，西方蜜蜂數(shù)量全球性驟減，這引起了社會各界的極大關注。Farooqui[6]在調(diào)查蜂群崩潰綜合癥(colony collapse disorder，CCD)時，系統(tǒng)科學地分析了各種假設，再次指出蜜蜂脅迫因子很多，其中化學農(nóng)藥的濫用是重要因素之一，并且強調(diào)了新煙堿類殺蟲劑潛在風險。特別是當歐盟委員會決定自2013年12月1日起，2年之內(nèi)禁止3種新煙堿類殺蟲劑在蜜蜂喜好的開花作物上使用，引發(fā)了新一輪關于新煙堿類殺蟲劑與蜜蜂健康之間的討論。

吡蟲啉是新煙堿類殺蟲劑的代表品種，自1991年上市以來，連續(xù)多年成為全球銷售額最大的殺蟲劑[7-8]。其殺蟲機制為通過阻斷昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常傳導使其出現(xiàn)麻痹甚至死亡現(xiàn)象，被廣泛用作種衣劑，可隨植物生長擴散到植物各個組織，包括花粉和花蜜，引起蜜蜂的慢性中毒，導致學習記憶能力等降低并引起行為改變，比如采集積極性下降、迷失方向等[9-11]。吡蟲啉的不合理利用，不僅對采集蜂的采集行為和健康產(chǎn)生嚴重影響，還將對蜜蜂幼蟲的生長發(fā)育產(chǎn)生影響。吡蟲啉對蜜蜂幼蟲的影響主要來自受污染的蜂蜜、花粉以及巢脾中蓄積的吡蟲啉。幼蟲的成活率對蜂群的發(fā)展壯大至關重要，一個蜂群中幼蜂的數(shù)量越多，發(fā)展壯群的可能性越大，采集能力越強，從這個層面說，幼蜂比老蜂更重要。

吡蟲啉對蜜蜂幼蟲的影響研究較少，僅個別研究者開展了蜂巢內(nèi)吡蟲啉對蜜蜂幼蟲的影響研究，然而蜜蜂是典型的真社會性昆蟲，具有明確而細致的勞動分工，蜂群中的幼蟲食物由專職哺育蜂來提供，而人工對幼蟲進行操作，幼蟲往往會被工蜂遺棄，自然蜂群中添加殺蟲劑易存儲于巢脾上影響蜂群繁殖，同時外界蜜源沖淡殺蟲劑劑量，存在試驗誤差。開展室內(nèi)吡蟲啉對蜜蜂幼蟲毒性影響研究，可人為控制幼蟲食物成分，排除哺育蜂以及外界蜜源的影響，結(jié)果更為準確。

本文參照國際經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)有關蜜蜂幼蟲毒性試驗準則，利用可行的蜜蜂幼蟲的室內(nèi)飼養(yǎng)模式，以蜜蜂幼蟲存活率、化蛹率和蛹羽化率為評價指標，開展吡蟲啉對蜜蜂幼蟲室內(nèi)毒性試驗，科學的評價吡蟲啉對蜜蜂幼蟲的影響，為養(yǎng)蜂區(qū)域吡蟲啉的合理使用提供科學依據(jù)，為評價新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂的風險性評估做數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗器材

供試昆蟲：健康成年的意大利蜜蜂蜂群，來源于環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所國家環(huán)境保護農(nóng)藥環(huán)境評價與污染控制重點實驗室蜂場。

供試藥劑：98%吡蟲啉原藥。

供試材料：移蟲針、48孔細胞培養(yǎng)板、24孔細胞培養(yǎng)板、無菌水、鮮蜂王漿、D-果糖、葡萄糖、酵母提出物等，購自南京榮華試劑有限公司。

所需儀器：恒溫培養(yǎng)箱(CTHI-250B，中國，上海施都凱)、烘箱(DHG-9146A，中國，上海百典儀器設備有限公司)、電子天平(PB203-N，中國，上海世義精密儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

試驗在蜂王產(chǎn)卵期內(nèi)進行，試驗開始前的4周內(nèi)禁止用藥。分別從3個不同的健康蜂群中選取1 d齡后期幼蟲。

幼蟲基礎日糧為50%的新鮮蜂王漿和50%的含1%的酵母提取物、6%的葡萄糖和6%果糖的水溶液。

試驗第1天，從3個蜂群上選取1 d齡后期幼蟲，置于48孔板上，喂食等量的基礎日糧，經(jīng)3 d適應性飼養(yǎng)(溫度34～35 ℃，濕度95%)，試驗開始后的第4天進行健康檢查，剔除異常、生病、受傷的幼蟲，再分配到各處理組中。試驗設置1個空白對照組(C1，始終喂基礎日糧)，1個溶劑對照組(C2，始終喂基礎日糧)及5，50，500，1 000，2 000和3 000 mg·L-16個濃度處理組(于試驗開始后的第4天、第5天和第6天每天分別添加1 μL藥液于基礎日糧中喂食)，每組12只幼蟲，3個重復。試驗開始后的第7天，將幼蟲轉(zhuǎn)移至鋪有滅菌紙的24孔細胞培養(yǎng)板中準備化蛹，每孔1只。培養(yǎng)板置于34 ℃避光恒溫培養(yǎng)箱。此后不再移動蟲體，觀察幼蟲在孔中完成排便、吐絲、化蛹和羽化的過程。試驗流程圖見圖1。

1.3 試驗指標

分別于試驗的第5天，第6天和第7天記錄死亡數(shù)，用轉(zhuǎn)移工具碰觸幼蟲，幼蟲不動或沒反應則認為死亡，將死亡的個體及時移出，直至未死亡的蛹全部羽化出房為止，統(tǒng)計幼蟲存活率、化蛹率和蛹羽化率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應用SPSS 16.0對試驗數(shù)據(jù)做方差分析，處理組與對照組之間的差異采用t檢驗進行分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 室內(nèi)人工培育蜜蜂幼蟲的技術(shù)

建立實驗室內(nèi)人工飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲的技術(shù)，是蜜蜂幼蟲作為模式生物研究的基礎，是開展農(nóng)藥對蜜蜂幼蟲毒性試驗的前提。需要探索可行的蜜蜂幼蟲的飼養(yǎng)模式，優(yōu)化關鍵因素，如環(huán)境條件、日糧配方、蟲齡、化蛹條件等，提高幼蟲存活率、蛹化率和羽化率。本研究通過篩選，獲得了比較理想的蜜蜂幼蟲日糧營養(yǎng)配方(50%的新鮮蜂王漿和50%的含1%的酵母提取物、6%的葡萄糖和6%果糖的水溶液)，同時發(fā)現(xiàn)1 d齡后期幼蟲飼喂效果明顯優(yōu)于1 d齡前期幼蟲，墊干燥的無菌擦鏡紙的化蛹板更有利于幼蟲的發(fā)育，其中幼蟲存活率、蛹化率和羽化率均可達到90%以上。

2.2 吡蟲啉對蜜蜂幼蟲存活率影響

2.3 吡蟲啉對蜜蜂幼蟲化蛹率影響

化蛹是完全變態(tài)昆蟲在幼蟲和成蟲之間的一個發(fā)育階段，蛹期主要是把內(nèi)部器官加以改造和分化，形成成蜂的各種器官。逐漸呈現(xiàn)出頭、胸、腹3部分，附肢也顯露出來，顏色由乳白色逐步變深，是幼蟲轉(zhuǎn)變成為蟲過程的過渡時期。化蛹率表示蜜蜂幼蟲生長到一定階段轉(zhuǎn)化成蛹的能力，用蛹化數(shù)占7 d存活幼蟲的比例表示。統(tǒng)計分析試驗結(jié)果(圖3)可知，當處理劑量小于等于150 ng·幼蟲-1時，處理組幼蟲化蛹率與對照組間無明顯差異，當處理劑量大于等于1 500 ng·幼蟲-1時，處理組幼蟲化蛹率與對照組間存在顯著性差異(P<0.05)。

2.4 吡蟲啉對蜜蜂幼蟲羽化率影響

發(fā)育成熟的蛹，脫下蛹殼，咬破巢房封蓋，羽化為成蜂。用羽化為成蜂數(shù)占7 d存活幼蟲的比例表示。統(tǒng)計分析試驗結(jié)果(圖4)可知，當處理劑量小于等于15 ng·幼蟲-1時，處理組幼蟲羽化率與對照組間無明顯差異，當處理劑量大于等于150 ng·幼蟲-1時，處理組幼蟲羽化率與對照組間存在顯著性差異(P<0.05)。

圖1 蜜蜂幼蟲毒性試驗流程注：A，基礎日糧；B，基礎日糧+1 μL處理藥液。Fig. 1 The process of honeybee larvae toxicity testNote: A, basal diet; B, basal diet + 1 μL test solution.

圖2 吡蟲啉對蜜蜂幼蟲存活率影響注：a，b，c，d，e，f表示各組間差異，相同字母代表差異不顯著，顯著水平P<0.05；C1，空白對照；C2，溶劑對照。Fig. 2 The impact of imidacloprid on survival rate of honeybee larvaeNote: a, b, c, d, e, f show the difference between each group, the same letter represent no significant difference, significant level P<0.05; C1, blank control; C2, solvent control.

圖3 吡蟲啉對蜜蜂幼蟲化蛹率影響注：a，b，c，d，e，f表示各組間差異，相同字母代表差異不顯著，顯著水平P<0.05。Fig. 3 The impact of imidacloprid on pupation rate of honeybee larvaeNote: a, b, c, d, e, f show the difference between each group, the same letter represent no significant difference, significant level P<0.05.

圖4 吡蟲啉對蜜蜂幼蟲羽化率影響注：a，b，c，d，e，f表示各組間差異，相同字母代表差異不顯著，顯著水平P<0.05。Fig. 4 The impact of imidacloprid on eclosion rate of honeybee larvaeNote: a, b, c, d, e, f show the difference between each group, the same letter represent no significant difference, significant level P<0.05.

3 討論(Discussion)

根據(jù)OECD試驗準則的要求，空白對照組存活率不低于80%，通過對試驗環(huán)境條件、日糧配方、蟲齡以及化蛹板的優(yōu)化，本試驗空白對照組存活率為91.67%，符合試驗的質(zhì)控要求，試驗方法有效、可行。

Yang等[10]通過研究蜂巢中不同劑量的吡蟲啉對蜜蜂幼蟲的影響發(fā)現(xiàn)：當吡蟲啉劑量達到24 ng·蜂-1時，不影響蜜蜂幼蟲的化蛹率和羽化率，當處理劑量越高，化蛹率和羽化率越低。本試驗結(jié)果表明15 ng·幼蟲-1的吡蟲啉處理劑量不影響存活率、化蛹率和羽化率；當處理劑量越高，存活率、化蛹率和羽化率越低，呈高度負相關，研究結(jié)果與前人結(jié)果較為吻合。

試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當處理劑量大于等于1 500 ng·幼蟲-1時，處理組幼蟲存活率和化蛹率與對照組間存在顯著性差異(P<0.05)，而當處理劑量大于等于150 ng·幼蟲-1時，處理組幼蟲羽化率與對照組間存在顯著性差異(P<0.05)，可見吡蟲啉對蜜蜂幼蟲羽化抑制作用明顯。Wu等[11]研究了巢脾中殘留劑量的吡蟲啉對蜜蜂幼蟲和成年工蜂壽命的影響，結(jié)果表明：蜂巢中殘留劑量的農(nóng)藥使蜜蜂幼蟲的羽化時間增長。Abbott等[12]用30～300 μg·kg-1的吡蟲啉飼喂蜜蜂得出了相同的結(jié)論。可見吡蟲啉延長蜜蜂幼蟲的羽化時間，對種群發(fā)育產(chǎn)生不良影響。

Li課題組設計合成了一種比率型的汞離子探針BT(見圖4)。當加入汞離子后，縮硫醛與汞離子作用恢復成醛基，使探針的發(fā)射波長從530 nm藍移至454 nm。在含有2%DMSO溶液中，探針對汞離子的檢測限為7.6 nmol/L。在pH=5～9范圍內(nèi)，對汞離子的響應較好，探針具有較好的選擇性，響應時間約為35 min，將該探針成功應用于細胞成像。

統(tǒng)計以往吡蟲啉對蜜蜂急性毒性試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)蜜蜂半數(shù)致死劑量為3～81 ng·蜂-1[13-14]。本試驗中當吡蟲啉處理劑量低于150 ng·幼蟲-1時，幼蟲存活率沒有影響，計算得到幼蟲半數(shù)致死劑量為2 300 ng·幼蟲-1，可見蜜蜂幼蟲對吡蟲啉的耐受性高于成蜂。吡蟲啉作為乙酰膽堿受體的抑制劑，能夠結(jié)合乙酰膽堿受體而阻礙乙酰膽堿與受體的結(jié)合。乙酰膽堿在蜜蜂腦中的分布非常廣泛，在蜜蜂頭部，尤其是復眼和單眼，有大量乙酰膽堿酯酶分布，在蜜蜂的觸角葉、蘑菇體的蕈體冠和α葉都有乙酰膽堿酯酶(AChE)和乙酰膽堿受體(nAChR)存在。蜜蜂幼蟲缺失許多乙酰膽堿酯酶，例如蘑菇體內(nèi)的內(nèi)源神經(jīng)細胞肯揚細胞，即吡蟲啉的靶細胞[15]，這可能是蜜蜂幼蟲對吡蟲啉的耐受性高于成蜂的原因。Gregorc等[16]研究發(fā)現(xiàn)飼喂?jié)舛葹?00 mg·kg-1的吡蟲啉對蜜蜂幼蟲中腸細胞凋亡有顯著影響。因此蜜蜂幼蟲時期接受高劑量的吡蟲啉導致死亡，歸因于細胞凋亡，而不是神經(jīng)毒性。

綜上，蜜蜂幼蟲對吡蟲啉的耐受性高于成蜂，但高劑量吡蟲啉對蜜蜂幼蟲存活率、化蛹率和羽化率均存在影響，延長蜜蜂幼蟲的羽化時間，從而影響整個群體的生存狀態(tài)。試驗結(jié)果只能作為吡蟲啉對蜜蜂幼蟲生長發(fā)育影響的初步研究，可為吡蟲啉的合理利用提供數(shù)據(jù)支撐，全面評價吡蟲啉對蜜蜂蜂群的影響還需要進一步實驗。

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Indoor Toxicity Research of Imidacloprid on Honeybee Larvae

Tan Lichao1,*, Bu Yuanqing1,2, Cheng Yan1, Zhou Junying1,2, Shan Zhengjun1,2

1. Nanjing Institute of Environmental Science，Ministry of Environmental Protection of the People's Republic of China, Nanjing 210042, China 2. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Atmospheric Environment and Equipment Technology (CICAEET), Nanjing University of Information Science & Technology, Nanjing 210044, China

Received 10 March 2016 accepted 11 April 2016

Imidacloprid is the most widely used neonicotinoids in the world. Researches showed that it could destroy the olfactory memory ability of bees, influence their acquisition behavior and cause a variety of sublethal effects. In this paper, the Apis mellifera larvae was selected as test organisms and indoor artificial feeding technique was adopted to evaluate the impact of imidacloprid on the development of honeybee larvae. After three days of adaptive breeding, larvae were fed with diet with different concentrations of imidacloprid for 3 days. Then the survival rate, pupation rate and eclosion rate were determined. Results showed that: no significant effects of survival rate, pupation rate and eclosion rate were observed under the dose of 15 ng imidacloprid per larva, but when treated with imidacloprid of 150 ng per larva, the eclosion rate significantly decreased, while the survival rate and pupation rate did not change obviously. The calculated 7 d-LD50of imidacloprid is 2 300 ng per larva. High doses of imidacloprid could influence the survival rate, pupation rate and eclosion rate of bee larvae. The higher the dose, the lower the survival rate, pupation rate and eclosion rate, with the r coefficients of -0.99, -0.94 and -0.89 respectively. Meanwhile, the delay of feather was also observed under high dose. The results could provide reference for the reasonable use of imidacloprid.

imidacloprid; honeybee larvae; indoor toxicity

2015年中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務專項(農(nóng)藥對蜜蜂慢性毒性、幼蟲毒性試驗方法及配套技術(shù)研究)

譚麗超(1985-)，女，碩士，助理研究員，研究方向為農(nóng)藥生態(tài)毒理學，Email: tcldemengxiang@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: tcldemengxiang@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20160310007

2016-03-10 錄用日期：2016-04-11

1673-5897(2016)4-253-05

X171.5

A

簡介：譚麗超(1985-)，女，環(huán)境工程碩士，助理研究員，主要從事農(nóng)藥生態(tài)毒理學研究，發(fā)表學術(shù)論文數(shù)十篇。

譚麗超, 卜元卿, 程燕, 等. 吡蟲啉對蜜蜂幼蟲的室內(nèi)毒性研究[J]. 生態(tài)毒理學報，2016, 11(4): 253-257

Tan L C, Bu Y Q, Cheng Y, et al. Indoor toxicity research of imidacloprid on honeybee larvae [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(4): 253-257 (in Chinese)