莪術醇與奧沙利鉑聯合腫瘤內注射對裸鼠胃癌移植瘤生長、瘤細胞增殖的影響及其機制

王冬，李勇，郭志朋，趙群，范立僑，檀碧波，崔平

(1河北醫科大學第四醫院，石家莊050011；2河北省人民醫院)

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莪術醇與奧沙利鉑聯合腫瘤內注射對裸鼠胃癌移植瘤生長、瘤細胞增殖的影響及其機制

王冬1，李勇1，郭志朋1，趙群1，范立僑1，檀碧波1，崔平2

(1河北醫科大學第四醫院，石家莊050011；2河北省人民醫院)

目的 觀察莪術醇與奧沙利鉑聯合腫瘤內注射對裸鼠胃癌移植瘤生長、瘤細胞增殖的影響，并探討其機制。方法 20只裸鼠，建立胃癌移植瘤模型，將其隨機分為對照組、莪術醇組、奧沙利鉑組、聯合組各5只，對照組腫瘤內注射生理鹽水(0.05 mL/10 g)，莪術醇組腫瘤內注射莪術醇(100 mg/kg)，奧沙利鉑組腫瘤內注射奧沙利鉑(30 mg/kg)，聯合組腫瘤內注射莪術醇(100 mg/kg)與奧沙利鉑(30 mg/kg)，每4 d 1次，共4次。觀察各組腫瘤生長情況，MTT法測算各組腫瘤組織中的瘤細胞存活率，熒光定量PCR檢測各組腫瘤組織Bcl-2、Caspase-3 mRNA，免疫組化法檢測各組腫瘤組織Bcl-2、Caspase-3蛋白。結果 與對照組相比，聯合組、莪術醇組、奧沙利鉑組腫瘤體積小、重量低、瘤細胞存活率低、Caspase-3表達高、Bcl-2表達低，且聯合組變化更明顯(P均<0.05)。結論 莪術醇聯合奧沙利鉑腫瘤內注射可抑制裸鼠胃癌移植瘤生長并抑制瘤細胞增殖，這可能與上調Caspase-3、下調Bcl-2表達有關。

莪術醇；奧沙利鉑；胃癌；裸鼠移植瘤模型；B淋巴細胞瘤2；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶

研究[1]發現，中藥及其提純物聯合化療藥物治療胃癌術后，在提高患者生存質量、延長生存期、提高免疫功能、減輕化療毒副作用等方面均優于單純化療。莪術醇是中藥莪術的主要有效成分，對于結腸癌、肺癌、胃癌、骨肉瘤等多種腫瘤細胞具有明顯的抑制作用[2～5]。莪術醇可以抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡，還可以通過調控一些信號通路的表達及活性而對腫瘤細胞發揮抑制作用。但這些結果大多是由體外研究得來，有關莪術醇抗腫瘤的體內研究少見。本研究觀察了莪術醇與奧沙利鉑聯合腫瘤內注射對裸鼠胃癌移植瘤生長、瘤細胞增殖的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 22只4～5周齡、雄性BALB/c裸鼠，體質量17.5～23.5 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，SPF級飼養。莪術醇純品購自中國食品藥品檢定研究院(純度>99%)；Bcl-2、Caspase-3基因引物由上海生工生物公司合成，抗體為美國Santa Cruz公司產品。

1.2 細胞培養 胃癌細胞株BGC-823(河北醫科大學第四醫院科研中心)細胞在37 ℃、5% CO2、相對濕度為95%培養箱中常規培養，培養液為含有10%胎牛血清的RPMI1640。細胞2～3 d換液1次，常規傳代。

1.3 裸鼠胃癌移植瘤模型制備 將對數生長期的BGC-823細胞(3.0×106/mL)0.2 mL注射于2只裸鼠腋部皮下。在瘤體直徑約1.0 cm時，處死裸鼠，剝離瘤體，剪成約1 mm3的瘤塊種植于20只裸鼠的腋部皮下，當瘤體直徑約1.0 cm時開始后續實驗。

1.4 莪術醇、奧沙利鉑用法 將20只荷瘤裸鼠模型隨機分為對照組、莪術醇組、奧沙利鉑組、聯合組各5只，對照組腫瘤內注射生理鹽水(0.05 mL/10 g)，莪術醇組腫瘤內注射莪術醇(100 mg/kg)，奧沙利鉑組腫瘤內注射奧沙利鉑(30 mg/kg)，聯合組腫瘤內注射莪術醇(100 mg/kg)與奧沙利鉑(30 mg/kg)，每4 d 1次，共4次。計算腫瘤體積，腫瘤體積=1/2×a×b2(a、b分別代表移植瘤最長徑和最短徑，單位mm)。第17天處死裸鼠，剝離瘤體、稱量瘤重(g)，計算抑制率。抑制率=(對照組瘤重-實驗組瘤重)/對照組瘤重×100%。

1.5 瘤細胞增殖檢測 采用MTT法。將剛離體的瘤體制成單細胞懸液。取對數生長期的瘤細胞懸液(3.1×104/mL)，接種于96孔板，每組設5個復孔，每孔200 μL含10%小牛血清的培養液。在CO2培養箱中分別培養24、48、72 h后，加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT，繼續培養4 h，棄上清，加入150 μL的DMSO，震蕩10 min。測定波長為490 nm的光密度(OD)值。細胞存活率(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.6 腫瘤組織Bcl-2、Caspase-3 mRNA檢測 采用熒光定量PCR法。取-80 ℃保存的腫瘤組織約200 mg，TRIzol提取RNA，檢測RNA完整性和純度，逆轉錄合成cDNA。以合成的cDNA為模板，進行目的基因的擴增。PCR反應體系為cDNA 2.0 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，DEPC水7 μL，SYBR Green Supermix 10 μL。PCR反應參數為95 ℃預變性10 min、95 ℃變性15 s、60 ℃退火60 s，40個循環，72 ℃延伸30 s。擴增完畢后，進入結果分析界面，以GAPDH為內參照基因，按照2-ΔΔCt相對定量公式，計算出各組目的基因相對表達量。

1.7 腫瘤組織Bcl-2、Caspase-3蛋白檢測 將甲醛固定的瘤組織制成蠟塊，切片，進行HE染色和免疫組織化學染色(S-P法)。以PBS代替一抗作為陰性對照。光鏡下(400×)隨機觀察5個視野，采取二次計分法，首先按染色強度計分，無色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；再按陽性細胞百分比計分，陰性計0分，陽性細胞≤10%計1分，>10%～50%計2分，>50%～75%計3分，>75%計4分。將染色強度得分和細胞數得分的乘積判斷表達結果，0<積分≤2為弱表達，>2為強表達。

2 結果

2.1 各組裸鼠腫瘤體積、重量比較 聯合組、莪術醇組、奧沙利鉑組、對照組第17天腫瘤體積分別為(1 087.00±120.95)、(1 674.77±170.85)、(1 322.20±135.10)、(2 081.64±193.69)mm3，腫瘤重量分別為(0.96±0.11)、(1.48±0.10)、(1.36±0.17)、(2.02±0.23)g，聯合組、莪術醇組、奧沙利鉑組與對照組相比，聯合組與莪術醇組、奧沙利鉑組相比，P均<0.05。聯合組、莪術醇組、奧沙利鉑組、對照組腫瘤抑制率分別為51.8%±6.3%、26.0%±12.3%、31.9%±11.3%、100.0%。

2.2 各組裸鼠腫瘤組織瘤細胞存活率比較 結果見表1。

2.3 各組裸鼠腫瘤組織Bcl-2、Caspase-3 mRNA比較 見表2。

2.4 各組裸鼠腫瘤組織Bcl-2、Caspase-3蛋白比較 聯合組、莪術醇組、奧沙利鉑組、對照組Caspase-3強表達陽性率分別為93.33%、66.67%、86.67%、26.67%，Bcl-2強表達陽性率分別為13.33%、23.33%、25.00%、86.67%，聯合組、莪術醇組、奧沙利鉑組與對照組相比，聯合組與莪術醇組、奧沙利鉑組相比，P均<0.05。

表1 不同培養時間各組裸鼠腫瘤組織瘤細胞存活率比較

注：與對照組相比,*P<0.05；與莪術醇組、奧沙利鉑組相比,#P<0.05。

表2 各組裸鼠腫瘤組織Bcl-2、Caspass-3 mRNA相對表達量比較±s)

注：與對照組相比,*P<0.05；與莪術醇組、奧沙利鉑組相比,#P<0.05。

3 討論

胃癌的治療是綜合治療[6]。化療在胃癌的治療中占有重要的地位，但可導致胃癌細胞藥物抵抗的形成，最終導致化療失敗。奧沙利鉑是用于胃癌化療的一線藥物，同樣存在上述問題，故聯合新藥物治療改善奧沙利鉑的治療效果有重要意義。近年來，中藥及其提取物已成為研究的重點。中藥抗腫瘤具有多靶點、多環節、多效應的特點，并且毒副作用較小，能提高患者免疫力，不易產生耐藥性[7]。莪術醇為近年受關注的藥物之一。

莪術是姜科姜黃屬的草本植物，在中醫治療中應用較為廣泛。該藥具有行氣破瘀、止痛等療效，多用于胃脹氣滯、腹痛等癥候的治療。中醫認為患者情志不舒、飲食不調、痰凝氣滯、熱毒血瘀交阻于胃而導致胃癌發生。莪術用于胃癌治療有其中醫理論依據。莪術醇是莪術的提取物，也是其主要有效成分，具有抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡的作用。對胃癌細胞的體外研究也證實了這一點[4,8]。本研究應用人胃癌細胞株皮下移植技術成功制備了裸鼠胃癌移植瘤模型，比較了不同處理方式對腫瘤的影響。結果發現，與對照組相比，莪術醇、奧沙利鉑分別及聯合應用鼠腫瘤體積減小、質量降低，且聯合用藥作用最為明顯。這一結果說明莪術醇對胃癌有治療作用，莪術醇與奧沙利鉑聯合應用效果更佳。為從細胞學角度觀察莪術醇、奧沙利鉑的作用，本研究應用MTT法檢測了各組瘤細胞的活性。結果顯示，莪術醇單獨應用即有抑制腫瘤生長的作用，并可降低瘤細胞活性，與奧沙利鉑聯合應用后抑制腫瘤細胞活性的作用更為明顯。提示莪術醇在胃癌治療中可能有較好的應用前景。為了解莪術醇抑制胃癌的生長的分子機制，本研究進一步檢測了各組腫瘤組織中的Bcl-2和Caspase-3。Bcl-2和Caspase-3是反映胃癌細胞凋亡的重要指標[9,10]。胃癌細胞具有較強的凋亡抵抗能力，這是胃癌鉑類藥物治療不理想的重要原因。本研究結果發現，與對照組相比，聯合組、奧沙利鉑組、莪術醇組Caspase-3表達升高且Bcl-2表達下降。說明莪術醇對胃癌的治療效果可能與其上調Caspase-3、下調Bcl-2表達有關。但莪術醇與奧沙利鉑聯合應用的實際效果及最適用藥方案還有待大規模的臨床研究。

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Effects of curcumol combined with oxaliplatin on xenograft growth and proliferation of gastric cancer tumor cells in nude mice

WANGDong1,LIYong,GUOZhipeng,ZHAOQun,FANLiqiao,TANBibo,CUIPing

(1TheFourthAffiliatedHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China)

Objective To observe the effects of curcumol combined with oxaliplatin on xenograft growth of gastric cancer cells in nude mice, then to explore the mechanism.Methods Twenty nude mice were selected to establish the xenograft models of gastric cancer cells in nude mice. Nude-mice xenograft models were randomly divided into four groups (n=5 in each group): the control group, curcumol group, oxaliplatin group and curcumol combined with oxaliplatin group (combined treatment group), then they were respectively treated with normal saline (0.05 mL/10 g), curcumol (100 mg/kg), oxaliplatin (30 mg/kg) and curcumol (100 mg/kg) combined with oxaliplatin (30 mg/kg), once every 4 days for four times. The growth of tumor was recorded. The cell survival rate of tumor cells in cancer tissues was determined by MTT. The expression levels of Caspase-3, Bcl-2 mRNA and protein were detected by fluorescence quantitative RT-PCR and immunohistochemistry. Results Compared with the control group, the tumor volume, weight, cell survival rate and the expression of Bcl-2 was decreased but the expression of Caspase-3 was increased in the curcumol group, oxaliplatin group and combined treatment group, and these changes were more significant in the combined treatment group (allP<0.05).Conclusion The curcumol combined with oxaliplatin may inhibit the xenograft growth and proliferation of gastric cancer tumor cells in nude mice, and the mechanism may be related to the up-regulation of Caspase-3 and down-regulation of Bcl-2.

curcumol; oxaliplatin; gastric carcinoma; xenograft models in nude mice; Bcl-2, Caspase-3

國家自然基金面上項目(81372580)；河北省中醫藥管理局科研基金資助項目(2014145D)。

王冬(1974-)，男，博士，副教授，主要從事胃癌新藥物療法的研究。E-mail: wangdongcuiping@126.com

簡介：李勇(1958-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事消化道惡性腫瘤基礎與臨床的研究。E-mail: li_yong_hbth@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.006

R735.2

A

1002-266X(2016)35-0021-03

2015-12-27)