筋骨草總黃酮對腎小球系膜細胞增殖的影響

南麗紅，黃枚，賴文芳，賈銣，鄭燕芳，楊瀾，謝晴晴，彭衛華

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122；2.南京軍區福州總醫院，福建福州350025）

筋骨草總黃酮對腎小球系膜細胞增殖的影響

南麗紅1，黃枚1，賴文芳1，賈銣1，鄭燕芳1，楊瀾1，謝晴晴1，彭衛華2

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122；2.南京軍區福州總醫院，福建福州350025）

目的觀察筋骨草總黃酮對大鼠腎小球系膜細胞增殖的影響。方法LPS誘導大鼠腎小球系膜細胞增殖，筋骨草總黃酮含藥血清干預24、48 h后，用MTT法檢測腎小球系膜細胞增殖情況，硝酸還原酶法、Elisa法分別檢測培養液上清中NO、iNOS、MCP-1的含量。結果LPS能明顯誘導腎小球系膜細胞增殖，培養液上清中NO、iNOS、MCP-1的含量明顯高于正常對照組（P＜0.05或0.01）。10%、5%筋骨草總黃酮含藥血清干預后OD值及培養液上清中NO、iNOS、MCP-1的含量均明顯減少（P＜0.05或0.01）。結論筋骨草總黃酮能抑制LPS誘導的腎小球系膜細胞異常增殖和炎癥介質NO、iNOS、MCP-1的釋放。

腎小球系膜細胞；增殖；一氧化氮；一氧化氮合酶；單核細胞趨化蛋白-1；筋骨草總黃酮

腎小球系膜細胞（glomerularmesangialcell，GMC）是腎小球中功能最活躍的固有細胞，GMC異常增生以及由此而導致細胞外基質（extracelluarmatrix，ECM）的過量生成和聚積，是許多腎小球疾病常見的病理改變，并可最終引起腎小球硬化，是使腎小球疾病發展至終末期腎病的中心環節之一［1］，因此抑制GMC增生是治療增生性腎臟病、防止病變惡化的關鍵環節。單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）與一氧化氮（nitric oxide，NO）是GMC激活后產生的2種炎癥介質，一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）是NO合成反應的限速酶。其中誘導型NOS（inducible NOS，iNOS）在多種因素刺激下表達增加，導致NO過量生成，從而對系膜細胞產生病理性損傷。筋骨草（Ajuga decumbens Thunb）具有清熱抗炎、抑制I型變態反應等作用，其有效成分為黃酮類化合物［2］。課題組前期研究［3-5］發現筋骨草總黃酮（total flavonoids of Ajuga，TFA）能明顯抑制系膜增生性腎小球腎炎模型大鼠GMC增殖、減少細胞外基質積聚，具有促進腎小球病理改變恢復的作用，其作用與抗脂質過氧化損傷和抑制核轉錄因子-κB等表達有關。但TFA對GMC分泌NO、MCP-1的影響，目前未見相關報道。故我們通過LPS誘導體外大鼠GMC增殖模型，觀察TFA含藥血清對GMC增殖及分泌NO、iNOS、MCP-1的影響，為TFA在慢性腎臟疾病治療中的應用提供實驗依據。

1實驗材料

1.1 實驗動物和大鼠GMC清潔級SD雄性大鼠，體質量（200±20）g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，合格證號：0054797。大鼠HBZY-1腎小球系膜細胞株（無錫博慧斯生物醫藥科技有限公司）。

1.2 藥物及試劑TFA（福建中醫藥大學藥物制劑實驗室）；PRMI 1640培養液（美國Hyclone公司）；胎牛血清（FBS，美國Hyclone公司）；胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；MTT（美國Amresco公司）；脂多糖（LPS，美國Biosharp公司）；DMSO（美國Amresco公司）；大鼠MCP-1 Elisa試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；NO、iNOS試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 儀器HERAcell 150型CO2培養箱（德國Heraeus公司）；ELX800型全自動酶標儀（美國BioTek公司）；TDL-5-A離心機（上海安亭科學儀器廠）；IX70倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；BS210S分析電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；Costar TM 96孔、24孔培養板（美國Corning公司）。

2實驗方法

2.1 實驗血清的制備SD大鼠隨機分為空白血清組、TFA血清組。TFA血清組按前期動物實驗的有效劑量2.16 g／kg，根據中藥藥理研究方法學，TFA溶液分2次給予灌胃，連續給藥3 d，最后1 d 2次給藥的間隔時間為2 h。于末次給藥1 h后，腹主動脈取血，室溫條件下靜置4 h，3 000 r／min離心15 min，無菌條件下分離血清，置56℃恒溫水浴箱中30 min作滅活處理，過濾除菌后，于-20℃冰箱

保存備用。空白血清組大鼠灌服等體積蒸餾水，與TFA血清組同時采血，提取血清方法同前。

2.2 細胞株的處理購買的大鼠HBZY-1腎小球系膜細胞株是以25 cm2／50 mL培養瓶運送，瓶內裝滿10%FBS的PRMI 1640培養液。收到細胞株，倒置相差顯微鏡下觀察GMC貼壁生長良好，體積較大，呈梭形、三角形或不規則星形。將培養瓶置于CO2培養箱中靜置24 h后，吸棄大部分培養液，繼續置CO2培養箱中至細胞達70%～80%融合時進行傳代，傳代后的GMC常規培養。

2.3 分組與含藥血清干預取對數生長期的大鼠GMC用0.25%胰酶消化后，用10%FBS的RPMI-1640培養液制成濃度為3×104個／mL的細胞懸液，接種于96孔培養板中，每孔加細胞懸液100μL。CO2培養箱中孵育24 h，細胞完全貼壁之后，棄上清液，用1%FBS的PRMI 1640培養液繼續培養24 h，使GMC同步生長于G0期。將96孔培養板中的大鼠GMC分為5組：①正常對照組：加入10%正常大鼠血清；②LPS組：加入LPS和10%正常大鼠血清；③10%TFA含藥血清組：加入LPS和10% TFA含藥血清；④5%TFA含藥血清組：加入LPS和5%TFA含藥血清；⑤2.5%TFA含藥血清組：加入LPS和2.5%TFA含藥血清。加入LPS的終濃度均為10μg／mL，血清終濃度不足10%的加入正常大鼠血清補齊。每組設6個復孔，每孔培養液200 μL，CO2培養箱中孵育24、48 h后，用MTT法檢測各組大鼠GMC增殖情況。

2.4 細胞增殖檢測含藥血清干預24、48 h后，于每孔中加入5 mg／mL MTT溶液20μL，置CO2培養箱中繼續孵育4 h后終止培養，小心吸棄孔內培養上清液。每孔加入150μL DMSO，震蕩10 min，使結晶充分溶解。選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔的光吸收值（OD值）。

2.5 NO、iNOS、MCP-1含量檢測取對數生長期的大鼠GMC以1×105個／mL接種于24孔板中，1 mL／孔，培養24 h待細胞貼壁，用1%FBS的PRMI 1640培養液使GMC同步生長于G0后。分組及藥物干預同2.3項，繼續培養24、48h后，收集細胞培養液，離心，取上清液按試劑盒說明書，用硝酸還原酶法檢測培養液上清中NO、iNOS含量，Elisa法檢測培養液上清中MCP-1含量。

2.6 統計學處理用SPSS 15.0統計軟件進行統計處理，數據屬正態分布用x±s表示，多組間均數比較用單因素方差分析。

3實驗結果

3.1 TFA含藥血清組對大鼠GMC增殖影響見表1。

表1 TFA含藥血清組對大鼠GMC增殖影響（x±s）

3.2 TFA含藥血清組對培養液上清中NO、iNOS、MCP－1含量的影響見表2～表3。

表2 TFA含藥血清組對培養液上清中NO、iNOS含量的影響（±s）

表2 TFA含藥血清組對培養液上清中NO、iNOS含量的影響（±s）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與LPS組比較，3）P＜0.05。

4討論

4.1 在正常生理情況下，GMC保持極低的增殖活性。在病理狀態下，多種損傷因子和有害物質均可刺激GMC活化，活化的GMC可異常增殖，自分泌炎癥介質（如IL-1、TNF-α、NO、MCP-1等），這些合成、釋放的炎癥介質與GMC上特異受體結合，又促進GMC增殖和活化，形成了增強GMC活動的自我調節環。如此循環反復，使GMC持續受損，ECM聚積，最終導致終末期腎病。

4.2 NO是一個具有廣泛生理活性的小分子，對腎

臟有明顯的雙重作用，在腎臟的生理和病理過程中起重要作用。在生理方面，對于腎血管的穩態調節、腎小管球間反饋、尿鈉排泄、交感神經遞質及腎素的釋放和溶質及水在腎小管中的交換都發揮著重要作用［6］。若NO在短期內大量合成，則可導致腎組織損傷引發急性炎癥反應［7］。NO可由NOS催化L-精氨酸與氧分子經多步氧化還原反應生成，NOS可分為2大類，一類是構成型NOS，包括內皮型NOS和神經元型NOS，是許多正常組織中基本存在的一種酶；另一類是iNOS，當細胞受到微生物內外毒素、炎癥介質等刺激后才被激活表達，從而產生過量的NO，促進GMC增生和細胞外基質沉積［8-9］。MCP-1屬于趨化因子CC亞家族的一員，可由腎組織內的系膜細胞合成和分泌，參與調節單核／巨噬細胞的浸潤，在正常人組織中有少量表達。當GMC組織受損、缺氧、中毒、炎癥等刺激下，MCP-1的表達增強，可趨化和激活單核／巨噬細胞至腎小球系膜區引起廣泛的炎癥浸潤，促進GMC的活化和增生，使ECM聚集，加速腎小球硬化［10］。

表3 TFA含藥血清對培養液上清中MCP-1含量的影響（±s）

表3 TFA含藥血清對培養液上清中MCP-1含量的影響（±s）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與LPS組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01。

4.3 根據藥理學原理，口服藥物必須經由胃腸道吸收、體內代謝為活性代謝產物后發揮藥理學作用。而血清藥理學能客觀地模擬了藥物與機體相互作用過程，其血清所含的藥物成分，也是經過體內一系列生物轉化后，真正發揮作用的有效成分及藥物作用下機體所產生的內生性有效成分，并且血清的理化性質與細胞所處的內環境相似［11－12］。因此，若TFA直接用于體外細胞，缺乏TFA在體內的代謝過程，并不能真實反映TFA在體內的藥理作用。故本實驗中采用了TFA含藥血清，有助于進一步探討TFA對GMC增殖的影響。

4.4 本實驗采用LPS作為刺激因子，作用于體外培養的GMC，結果顯示LPS能誘導GMC異常增殖，并可使NO、iNOS、MCP-1的釋放量明顯增加。TFA含藥血清干預24、48 h后能明顯抑制LPS誘導的GMC增殖，培養液上清中NO、iNOS、MCP-1含量亦明顯減少，提示TFA可明顯抑制LPS誘導的GMC異常增殖，并可明顯減少炎癥介質NO、iNOS、MCP-1的釋放，從而有利于減輕GMC的持續受損，延緩腎小球疾病的慢性進展。

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R285.5

A

1000-338X（2016）04-0034-03

2016－05－22

福建省科學技術廳自然科學基金資助課題（2014J05094）

南麗紅（1974—），女，副教授，主要從事中藥藥理研究。

彭衛華（1970—），男，副主任醫師。E-mail：pwhua7011@ aliyun.com