桃核承氣湯對慢性腎衰大鼠BMP-7及MMP-2表達影響的研究

莊秀輝，張喜奎，危美紅，蘇美玲

（1.福建中醫藥大學，福建福州350122；2.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建福州350003）

桃核承氣湯對慢性腎衰大鼠BMP-7及MMP-2表達影響的研究

莊秀輝1，張喜奎2，危美紅1，蘇美玲1

（1.福建中醫藥大學，福建福州350122；2.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建福州350003）

目的觀察桃核承氣湯對5／6腎切除大鼠BMP-7、MMP-2及TIMP-2表達的影響，探討該方治療慢性腎衰（CRF）的療效機制。方法將5／6腎切除制造CRF大鼠模型，全自動動物血液分析儀測血常規，全自動生化分析儀測腎功能，免疫組化法測BMP-7、MMP-2及TIMP-2蛋白的表達，Real－Time PCR法測BMP-7及MMP-2 m RNA的表達，同時進行光鏡觀察。結果與模型組比較，治療組能顯著升高RBC和HB（P＜0.05），顯著降低血Scr和BUN（P＜0.05），明顯提高BMP-7、MMP-2蛋白及m RNA的表達而抑制TIMP-2蛋白的表達（P＜0.05），并能在病理上減輕腎間質纖維化程度。結論桃核承氣湯可通過上調BMP-7、MMP-2蛋白及mRNA的表達，而下調TIMP-2蛋白的表達，促進細胞外基質的降解，從而減輕腎間質纖維化，延緩CRF進展。

腎間質纖維化；骨形態發生蛋白-7；基質金屬蛋白酶-2；桃核承氣湯

桃核承氣湯是治療太陽蓄血輕證的經方，經臨床觀察及實驗研究發現：該方能改善腎功能，糾正貧血，延緩慢性腎衰（CRF）進展。本實驗采用5／6腎切除方法制造CRF模型，通過觀察桃核承氣湯對5／6腎切除大鼠腎組織BMP-7、MMP-2及TIMP-2表達的影響，探討該方治療CRF的療效機制。

1實驗材料

1.1 實驗動物7周齡SPF級的雄性SD大鼠60只，體重180～200 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司［許可證號：SCXK（滬）2012-0002，動物合格證編號：2013001805578］，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心［許可證號：SYXK（閩）2014-0005］。

1.2 實驗藥物桃核承氣湯：生大黃12 g（后入），芒硝6 g（熔服），桃仁12 g，桂枝6 g，炙甘草6 g。此飲片購于福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，水煎并濃縮成42 g／100 mL的溶液，4℃保存備用；根據臨床成人用量25 g／d，將尿毒清顆粒［康臣藥業（內蒙古）有限責任公司，生產批號：20140913］配成25 g／100mL的溶液，4℃保存備用；青霉素（華北制藥股份有限公司，生產批號：141219，規格為80萬U／支）。

1.3 實驗試劑肌酐檢測試劑盒（C011-1，南京建成生物工程研究所）；尿素氮檢測試劑盒（C013-2，南京建成生物工程研究所）；BMP-7免疫組化試劑盒（BS-2242R，北京博奧森生物技術有限公司）；MMP-2免疫組化試劑盒（BS04605R，北京博奧森生物技術有限公司）；TIMP-2免疫組化試劑盒（BS-0416R，北京博奧森生物技術有限公司）；二抗（SP-9001，北京中杉金橋生物技術有限公司）；DAB顯色試劑盒（ZLI-9032，北京中杉金橋生物技術有限公司）；超純RNA提取試劑（D9108B，日本TaKaRa公司）；反轉錄試劑盒（DRRO47A，日本TaKaRa公司）；Real-time PCR試劑盒（DRR420A，日本TaKaRa公司）；5x RNA Loading Buffer（DRR420A，日本TaKaRa公司）。

1.4 實驗儀器全自動動物血液分析儀（XT-2000iV，希森美康醫用電子有限公司）；石蠟切片機（RM2015，德國萊卡公司）；微量高速離心機（TG16W，長沙湘智離心機儀器有限公司）；顯微鏡（BX51T-PHD-J11，日本奧林巴斯公司）；低溫冰箱（MDF-382E，日本三洋公司）；移液器（EPPENDORF，德國艾本德股份公司）；洗板機（AC8，芬蘭Thermo Labsystems公司）；分光光度計（NANODROP 2000，美國Thermo Scientific公司）；熒光定量PCR儀（ABI7500，美國Applied Biosystems公司）；多功能真彩色細胞圖象分析管理系統（Image-Pro Plus，美國Media Cybernetics公司）。

2實驗方法

2.1 分組與造模大鼠購回飼養l周后，按隨機數字表法分為空白組、假手術組、模型組、對照組和治療組，每組各12只。空白組不予手術，假手術組僅做雙腎包膜剝離，其余3組均行5／6腎切除手術。具體步驟如下：參照文獻［1］，用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，之后將其固定在鼠臺上，在左腎部剪毛，常規消毒，戴手套，鋪洞巾；在左腎部斜切2 cm，剪開皮膚、肌肉，將左腎從腹側往切口托出，至充分暴露為止，剝離腎包膜，用止血鉗鉗住左腎腎蒂，以便暫時阻斷左腎的血供，盡量切除2／3腎組織的上、下兩極，然后用明膠海綿壓迫止血，直至無明顯出血，取下止血鉗，復位殘余腎臟，縫合各層組織；術后切口強力碘消毒，并在腹腔內連續3 d注射量為

7.2萬U／100 g的青霉素；1周后進行第2次手術，在右腎部位做斜切口（而后步驟同上），結扎腎門，切除右腎（而后步驟同上）。

2.2 模型鑒定造模完4周后均以尾靜脈采血用于比較各組大鼠的腎功能。結果顯示：模型組、對照組和治療組的血肌酐、尿素氮均明顯高于空白組，表明造模成功。

2.3 給藥干預造模完4周后每天上午給藥，劑量均按臨床成人每公斤體重用量的6倍換算。治療組予灌42%的桃核承氣湯溶液10 mL／（kg·d－1）；對照組予灌25%的尿毒清溶液10 mL／（kg·d－1）；其余3組分別給予灌等量生理鹽水。給藥時間為8周。

2.4 采集標本

2.4.1 檢測血常規和腎功能給藥后第57天將大鼠在腹腔麻醉下，腹主動脈采血6～8 mL。1號管：取2 m L血樣，置于預先加好2%EDTANa2的試管中，搖勻后置于4℃、3 000轉／min的離心機中離心10 min，吸取上層血漿，保存于-20℃冰箱中，用于測定血常規；2號管：取4mL血樣置于不加任何抗凝劑的試管中靜置，然后在4℃、3 000轉／min的離心機中離心10min，吸取上層血清，置于-20℃冰箱中保存，用于測定腎功能。

2.4.2 腎組織取樣采血后處死大鼠，取兩塊腎組織，分別放入4%多聚甲醛和RNA保存液中固定。前者備做蛋白檢測和光鏡觀察，后者備做基因檢測。

2.5 大鼠一般情況造模前各組大鼠體型豐滿，反應靈敏，被毛密集，毛色光亮，飲食、二便均正常，體重未見明顯變化。造模后模型組、對照組和治療組大鼠體型瘦小，反應遲鈍，活動量減少，皮毛蓬松，毛色枯槁，飲食及二便均減少，體重明顯下降。大鼠死亡情況：空白組在實驗的第5周死亡3只；假手術組分別在第1次和第2次的腎包膜剝離術后1周內各死亡1只，術后第5周死亡1只；模型組分別在第1次和第2次造模后1周內各死亡2只；對照組在第1次造模后1周內死亡3只，在第2次造模后1周內死亡1只，造模后第5周死亡1只；治療組在第1次造模后1周內死亡1只，在第2次造模后1周內死亡2只，在造模后的第5周死亡1只。

2.6 實驗室指標檢測血常規檢測采用全自動動物血液分析儀；血Scr檢測采用除蛋白苦味酸比色法；BUN檢測采用脲酶法；腎組織BMP-7、MMP-2及TIMP-2蛋白表達檢測采用免疫組化法；腎組織BMP-7、MMP-2及TIMP-2 mRNA表達檢測采用Real-Time PCR法；光鏡采用HE染色法觀察。

2.7 統計學處理采用SPSS18.0軟件包進行統計分析。計量資料均符合正態分布以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析；用Testof Homogeneity of Variance檢驗方差齊性，若方差齊則用LSD檢驗，若方差不齊則用Games-Howell檢驗。

3實驗結果

3.1 各組RBC、HB比較見表1。

表1 各組RBC、Hb比較（±s）

表1 各組RBC、Hb比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與對照組比較，3）P＜0.05。

組別空白組假手術組模型組對照組治療組Hb／（g／L）161.58±1.88 161.81±2.38 105.54±4.621）127.92±3.852）128.66±2.443）n99878 RBC／（×1012／L）9.13±0.23 9.06±0.27 6.06±0.151）6.95±0.082）7.04±0.093）

3.2 各組血Scr、BUN比較見表2。

表2 各組血Scr、BUN比較（s）

表2 各組血Scr、BUN比較（s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與對照組比較，3）P＜0.05。

BUN／（mmol／L）6.27±0.95 6.39±0.61 25.86±2.941）16.75±2.632）12.09±1.283）組別空白組假手術組模型組對照組治療組n99878血Scr／（μmol／L）69.84±6.89 68.35±7.51 177.06±7.031）133.74±10.052）96.78±8.083）

3.3 各組BMP-7、MMP-2、TIMP-2蛋白表達結果比較見表3。

表3 各組BMP-7、MMP-2、TIMP-2蛋白表達結果比較（±s）

表3 各組BMP-7、MMP-2、TIMP-2蛋白表達結果比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與對照組比較，3）P＜0.05。

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3.4 各組BMP-7、MMP-2 mRNA相對表達量比較見表4。

3.5 病理觀察光鏡下顯示：空白組與假手術組腎組織形態結構均清晰可見，腎小球和腎小管均未

見萎縮性病變，腎間質也未見纖維增生；模型組腎組織形態結構大都消失，細胞排列分布參差不齊，多數腎小球皺縮、變硬，腎間質多呈大片狀纖維化，腎小管萎縮或擴張，甚或消失；對照組腎組織有部分結構消失，細胞排列分布較紊亂，腎小球少許皺縮、變形，腎間質纖維組織少量增生，可見部分腎小管擴張；治療組腎組織形態結構大致正常，細胞排列分布尚整齊，腎小球形態結構較正常，腎間質多無纖維增生，腎小管未見明顯病變。見圖1。

表4 各組BMP-7、MMP-2mRNA相對表達量比較（±s）

表4 各組BMP-7、MMP-2mRNA相對表達量比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與對照組比較，3）P＜0.05。

4討論

近年來許多醫家認為CRF主要病機是邪毒深入營血，化熱成毒，而致腎絡瘀阻［2］。研究發現：毒邪與瘀血貫穿CRF的始終，二者互相轉化，可膠結成瘀毒［3］。還有學者提出要從瘀論治CRF［4］。張喜奎教授［5］認為CRF病在厥陰形成的下焦瘀水互結證，與《傷寒論》所述的蓄血證類似。趙紹琴教授［6］認為CRF基本病機為濕熱深入營血，日久形成瘀毒。馬進教授［7］亦認為瘀血內阻、日久成積是CRF的主要病機。桃核承氣湯化瘀解毒、通腑瀉濁，契合CRF主要病機特點，方中桃仁能破血行瘀，去宛陳莝，使CRF瘀阻的腎絡暢通，從而改善腎功能。如李小波等［8］通過實驗研究表明：桃仁有一定的抗腎間質纖維化和保護腎小管功能作用；大黃通腑瀉濁，與桃仁共為君藥，現代研究［9］表明：大黃可促進有毒代謝產物的排出；芒硝能瀉熱軟堅，桂枝能溫陽通脈，既可助桃仁祛瘀解毒，又可制約大黃及芒硝寒涼之弊，與芒硝共為佐藥；炙甘草補中益氣，調和諸藥。

CRF的進展過程主要包括腎小球硬化、腎小管間質纖維化等。若一旦形成腎間質纖維化就預示著進展至CRF的必然性，其輕重程度更能反映腎臟病的病情演變及預后［10］。而腎間質纖維化多與細胞外基質（ECM）過度蓄積于正常腎組織有關，其形成的主要機制是ECM合成過度及降解受到抑制。ECM降解涉及多種蛋白酶，其中基質金屬蛋白酶（MMPs）和其特定的組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）是比較重要的酶類［11］。MMP-2對ECM起特異降解作用，TIMP-2對MMP-2起抑制作用。骨形態發生蛋白-7（BMP-7）能保護腎功能，其活性升高能減輕腎間質纖維化。研究發現：BMP-7可提高MMP-2的表達，使ECM積聚減少，從而減輕腎間質纖維化［12］。現代醫學已證實：在CRF進程中始終存在高凝狀態，導致腎小球濾過率（GFR）下降等，相當于中醫之“濁毒瘀血”。桃核承氣湯立法處方與CRF病機相符，本實驗結果顯示：桃核承氣湯能顯著升高RBC計數及Hb含量，顯著降低血Scr和BUN水平，提高BMP-7、MMP-2蛋白及mRNA的表達而抑制TIMP-2蛋白的表達，并能在病理上減輕腎間質纖維化程度。

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R285.5

A

1000-338X（2016）04-0037-03

2016－05－15

2013年度福建省中醫藥科技項目（wzsb201302）

莊秀輝（1988—），男，醫學碩士，研究方向：中醫腎病研究。

張喜奎（1963—），男，主任醫師，碩士生導師。E-mail：zhxk1963@aliyun.com