鐵皮石斛多糖對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜炎癥因子表達(dá)干預(yù)的研究

李靜文 李國(guó)文 秦瑜 李春霞

鐵皮石斛多糖對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜炎癥因子表達(dá)干預(yù)的研究

李靜文1李國(guó)文2秦瑜2李春霞2

目的觀察鐵皮石斛多糖（PDC）對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜及血清中炎癥因子表達(dá)水平的影響，探討PDC在早期糖尿病視網(wǎng)膜病變中的抗炎作用及機(jī)制。方法采用鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射的方法誘導(dǎo)SD大鼠糖尿病模型。模型建立成功6周后，分別用低劑量PDC[100 mg/（kg·d）]、中劑量PDC[200 mg/（kg·d）]及高劑量PDC[300 mg/（kg·d）]灌胃治療。8周后，2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠，取所需標(biāo)本。采用蛋白印跡法（Westen Blot）檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)大鼠血清IL-6、TNF-α的含量，免疫組化觀察大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）的表達(dá)水平。結(jié)果與正常組比較，糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)IL-6、TNF-α、VEGF的蛋白表達(dá)增加；血清IL-6、TNF-α表達(dá)增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與糖尿病組比較，PDC低、中、高各劑量組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)IL-6、TNF-α的蛋白表達(dá)明顯降低，血清IL-6、TNF-α的表達(dá)降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PDC各劑量組之間各指標(biāo)兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。免疫組化切片觀察，正常大鼠視網(wǎng)膜未見(jiàn)明顯NF-κB陽(yáng)性染色，糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)NF-κB表達(dá)高于正常組，與糖尿病組比較，PDC各劑量組NF-κB表達(dá)降低。結(jié)論P(yáng)DC可以降低糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠體內(nèi)炎癥因子（IL-6、TNF-α）的表達(dá)，進(jìn)而抑制VEGF表達(dá)上調(diào)。其作用機(jī)制可能與NF-κB通路有關(guān)。

糖尿病視網(wǎng)膜病變；PDC；炎癥因子；NF-κB

多項(xiàng)研究證實(shí)，糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy DR）是一種慢性亞臨床低度炎癥性疾病〔1〕。早期改變以白細(xì)胞黏附、聚集及移行、血管通透性增加、血-視網(wǎng)膜屏障（blood-retina barrier，BRB）破壞為病理特征，最終誘導(dǎo)VEGF表達(dá)上調(diào)，促使視網(wǎng)膜內(nèi)新生血管的形成〔2〕，進(jìn)一步加速DR的惡化，影響患者視力。因此，對(duì)DR患者早期進(jìn)行抗炎治療有可能為預(yù)防DR進(jìn)一步發(fā)展及治療提供一個(gè)新的思路。石斛作為傳統(tǒng)名貴中草藥具有低毒性的特性，其化學(xué)成分和藥理活性逐漸引起人們的關(guān)注，多糖是石斛屬植物中主要的藥用活性成分之一，研究表明鐵皮石斛多糖（polysaccharides of dendrobium candidum，PDC）提取物具有抗炎作用〔3〕。為此，我們觀察PDC對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜及血清中炎癥因子表達(dá)水平的影響，探討PDC應(yīng)用于DR的抗炎作用及機(jī)制，為DR的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠50只，雄性，體質(zhì)量120～160 g，購(gòu)自上海市斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)公司。

1.2 藥品與試劑

PDC購(gòu)自長(zhǎng)沙中仁生物有限公司，褐色粉狀，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室鑒定多糖含量50%。使用前用生理鹽水分別溶解為25 mg/ml、50 mg/ml、75 mg/ml。鏈脲佐菌素（STZ）（美國(guó)sigma公司）、血糖儀及試紙（美國(guó)強(qiáng)生公司）、單克隆兔抗腫瘤壞死因子α（TNF-α）抗體，單克隆兔抗白細(xì)胞介素-6（IL-6）抗體（英國(guó)Abcam公司），單克隆兔抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），兔抗大鼠核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）p65抗體（美國(guó)Sigma公司），大鼠IL-6、TNF-α ELLSA試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常組、糖尿病組、PDC低劑量組、PDC中劑量組、PDC高劑量組，每組10只。

1.4 造模及標(biāo)本提取方法

50只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食不禁水12 h，新配制的鏈脲佐菌素溶液按照55 mg/kg的劑量，對(duì)糖尿病組、PDC低劑量組、PDC中劑量組、PDC高劑量組行腹腔注射，正常組大鼠行等量檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。72 h后尾靜脈取血測(cè)血糖，如血糖≥16.7 mmol/L則認(rèn)為糖尿病大鼠模型成功。造模成功后，不用胰島素及其它任何藥物干預(yù)，不控制飲食飲水。喂養(yǎng)6周后，PDC低、中、高各劑量組予PDC灌胃，劑量分別為100、200、300 mg/（kg·d）；正常組和糖尿病組等量灌胃生理鹽水。標(biāo)本提取和各項(xiàng)試驗(yàn)在藥物干預(yù)8周后進(jìn)行。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo)

取所需試驗(yàn)鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，開(kāi)腹，腹主動(dòng)脈取血。3 000～4 000 r/min，離心10 min，取上清，放4℃冰箱，待測(cè)。取雙側(cè)眼球，其一固定于福爾馬林溶液，石蠟包埋，用于視網(wǎng)膜組織病理切片；另一去除前節(jié)，顯微鏡下鈍性分離視網(wǎng)膜組織，置于液氮下冷凍儲(chǔ)存，用于Westen blot實(shí)驗(yàn)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。

采用Western blot檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)IL-6、TNF-α及VEGF的表達(dá)差異。使用強(qiáng)細(xì)胞裂解液提取各組視網(wǎng)膜總蛋白，以3∶1的比例加入上樣緩沖液并充分混勻，100℃水浴10 min蛋白變性。應(yīng)用雙辛丁酸（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定各組視網(wǎng)膜組織總蛋白，按每孔40 μg蛋白量調(diào)整上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜，牛血清白蛋白（BSA）封閉1 h，添加相應(yīng)一抗4℃孵育過(guò)夜。TBST洗后用相應(yīng)二抗常溫孵育1 h，最后顯影定影。采用Image J圖像處理軟件進(jìn)行灰度分析，以各目的蛋白與其總蛋白的比值表示蛋白的活性水平，即蛋白相對(duì)表達(dá)量。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)大鼠血清IL-6、TNF-α的含量。收集各組大鼠血清，每孔100 μl，設(shè)復(fù)孔，按照大鼠IL-6、TNF-α的ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)450 nm下測(cè)量光密度D（450 nm），獲取大鼠血清中IL-6及TNF-α的含量。

免疫組化法測(cè)定NF-κB的表達(dá)。取大鼠眼球做冠狀切片，石蠟脫蠟至水、修復(fù)、3%BSA封閉，添加相應(yīng)一抗4℃孵育過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗后用相應(yīng)二抗常溫孵育1 h，DAB顯色、復(fù)染細(xì)胞核、脫水封片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資

料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，3組或3組以上組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組比較，糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜IL-6、TNF-α及VEGF蛋白表達(dá)明顯增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與糖尿病組比較，PDC低劑量組、PDC中劑量組及PDC高劑量組大鼠視網(wǎng)膜IL-6、TNF-α及VEGF蛋白表達(dá)均有降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PDC不同劑量組之間兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1，圖1）

表1 Western blot法檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜IL-6、TNF-α、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較±s）

表1 Western blot法檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜IL-6、TNF-α、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較±s）

注：多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。①與正常組比較，P＜0.05；②與糖尿病組比較，P＜0.05IL-6：白細(xì)胞介素-6TNF-α：腫瘤壞死因子αVEGF：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子PDC：鐵皮石斛多糖

組別樣本量IL-6TNF-αVEGF正常組100.44±0.170.28±0.030.10±0.03糖尿病組101.10±0.20①1.12±0.10①1.33±0.12①PDC低劑量組100.48±0.07②0.47±0.07②0.51±0.08②PDC中劑量組100.64±0.02②0.34±0.08②0.48±0.11②PDC高劑量組100.61±0.12②0.66±0.07②0.60±0.11②F值5.64920.6422.72 P值＜0.05＜0.05＜0.05

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜IL-6、TNF-α及VEGF蛋白的活性水平。A.各組大鼠視網(wǎng)膜IL-6、TNF-α及VEGF蛋白表達(dá)的Western blot法檢測(cè)電泳圖1.正常組2.糖尿病組3.PDC低劑量組4.PDC中劑量組5.PDC高劑量組。B.各組小鼠視網(wǎng)膜中IL-6、TNF-α及VEGF蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較IL-6：白細(xì)胞介素-6 TNF-α：腫瘤壞死因子α VEGF：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子PDC：鐵皮石斛多糖

ELLSA檢測(cè)結(jié)果顯示，糖尿病大鼠血清中促炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α含量較正常組有所增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PDC低、中、高各劑量組大鼠血清中促炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α含量較糖尿病組均有所降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PDC高劑量組之間兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

免疫組化切片結(jié)果顯示，正常大鼠視網(wǎng)膜未見(jiàn)明顯NF-κB陽(yáng)性染色，糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜可見(jiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層（GCL）及內(nèi)核層（INL）均可見(jiàn)陽(yáng)性染色，PDC各處理組陽(yáng)性染色明顯減少（圖2）。

3 討論

表2 ELLSA法檢測(cè)各組大鼠血清IL-6、TNF-α的含量（±s）

表2 ELLSA法檢測(cè)各組大鼠血清IL-6、TNF-α的含量（±s）

注：多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。①與正常組比較，P＜0.05；②與糖尿病組比較，P＜0.05IL-6：白細(xì)胞介素-6TNF-α：腫瘤壞死因子αPDC：鐵皮石斛多糖

組別樣本量IL-6TNF-α正常組1023.65±0.833.44±0.06糖尿病組1051.09±2.52①4.33±0.08①PDC低劑量組1027.38±1.23②3.74±0.09②PDC中劑量組1022.17±1.24②3.68±0.08②PDC高劑量組1027.89±1.17②3.70±0.07②F值53.9420.16 P值＜0.05＜0.05

石斛的主要化學(xué)成分有多糖類、生物堿類、氨基酸、聯(lián)芐類、菲類、倍半萜類等，其中多糖含量較高〔4〕。有動(dòng)物研究表明PDC可以抑制促炎性細(xì)胞因子（如IL-1β，IL-10，IL-6，IFN-γ等）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子（GM-CSF）和粒細(xì)胞-集落刺激因子（GCSF）的活性及表達(dá)〔5〕，發(fā)揮其抗炎作用。關(guān)于PDC

在DR早期的抗炎作用尚無(wú)研究。

本研究選取SD大鼠為研究對(duì)象，采用STZ腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病模型，采用不同方法（Westernblot、ELISA）檢測(cè)正常組、糖尿病組及各不同劑量處理組大鼠視網(wǎng)膜及血清中促炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平，進(jìn)而探索PDC在DR中的抗炎機(jī)制及作用。結(jié)果表明，與正常組比較，糖尿病組大鼠體內(nèi)促炎性細(xì)胞因子水平表達(dá)增加；與糖尿病組比較，PDC各劑量處理組大鼠體內(nèi)促炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平有所下降。說(shuō)明PDC可以抑制早期DR促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制VEGF的表達(dá)上調(diào)。此外，采用Western blot檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)水平表明，PDC各處理組可以降低NF-κB蛋白表達(dá)，其抗炎作用機(jī)制可能與其抑制NF-κB途徑的激活有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PDC可以降低糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠體內(nèi)炎癥因子（IL-6、TNF-α）的表達(dá)，進(jìn)而抑制VEGF表達(dá)上調(diào)。PDC各劑量組間比較，PDC藥效并未呈現(xiàn)明顯量效關(guān)系，提高用量可能并不會(huì)增加藥物療效。

NF-κB信號(hào)通路在DR的發(fā)展過(guò)程中起重要作用。在高糖環(huán)境下，晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）激活，多種因素導(dǎo)致視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活NF-κB并啟動(dòng)其下游基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞因子（IL-6、TNF-α等）及黏附分子〔6-7〕相互作用、聚集，引發(fā)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管阻塞無(wú)灌注、內(nèi)皮損傷、血管滲漏、新生血管形成等病理過(guò)程〔2〕。Shakhov等研究證明，若阻斷TNF-α啟動(dòng)子區(qū)域的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，則不能產(chǎn)生TNF-α，提示NF-κB通路在TNF-α產(chǎn)生中起重要作用〔8〕。高糖環(huán)境下，視網(wǎng)膜內(nèi)高水平的TNF-α、IL-6作用于視網(wǎng)膜微血管，誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）表達(dá)增加，促進(jìn)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，阻塞血管、毛細(xì)血管無(wú)灌注，破壞血-視網(wǎng)膜屏障〔9-10〕，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜的損害。此外，IL-6還可通過(guò)VEGF基因啟動(dòng)子上特異性DNA序列及5’2非翻譯區(qū)的特異性元件介導(dǎo)并促進(jìn)VEGF的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生〔11〕。

綜上所述，炎癥機(jī)制在DR早期發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，嚴(yán)格控制血糖及使用針對(duì)炎癥的藥物有益于DR的治療〔12〕。根據(jù)我國(guó)學(xué)者近年來(lái)對(duì)石斛的研究發(fā)現(xiàn)，石斛具有抗炎的藥理作用，且藥物毒副作用較小，可能為糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙诘目寡字委熖峁┬碌耐緩健?/p>

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）免疫組織染色像。A.正常組，未見(jiàn)明顯陽(yáng)性染色；B.糖尿病組，顯示神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層（GCL）及內(nèi)核層（INL）均可見(jiàn)陽(yáng)性染色（紅箭，下同）；C.PDC低劑量組；D.PDC中劑量組、E.PDC高劑量組，GCL層可見(jiàn)少許陽(yáng)性染色PDC：鐵皮石斛多糖

[1]EL-Asrar AM.Role of inflammation in the pathogenesis of diabetic retinopathy[J].Middle East Afr J Ophthalmol，2012，19（1）：70-74.

[2]Stitt AW，Lois N，Medina RJ，et al.Advances in our understanding of diabetic retinopathy[J].Clinical Science，2013，125（1）：1-17.

[3]Cohen T，Nahan D，Cerem LW，et al.Interleuldn-6 induces the expression of vascular endothelial growth factor[J].Biol Chellq，1996，271（2）：736.

[4]凌志揚(yáng)，房玉良.石斛的化學(xué)成分及藥理作用[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2012，19（5）：13-16.

[5]Shie J，Chen AC.Regioselective synthesis of di-C-glycosylflavones possessing anti-inflammation activities[J].Organic&Biomolecular Chemistry，2010，10（1039）：4551-4462.

[6]Kowluru RA，Koppolu P，Chakrabarti S，et al.Diabetes-induced activation of nuclear transcriptional factor in the retina，and its inhibition by antioxidants[J].Free Radic Res 2003，37（11）：1169-1180.

[7]Lawrence T.The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation [J].Cold Spring Harb Perspect Biol，2009，1（6）：253-266.

[8]Shakhov AN，Collart MA，Vassalli P，et al.KappaB-type enhancers are involved in lipopolysaccharide-mediated transcriptional activation of the tumor necrosis factor-a gene in primary macrophages[J].J Exp Med，1990，171（1）：35-47.

[9]Ferrero E，Zocchi MR，Magni E，et al.Roles of tumor necrosis factor p55 and p75 receptors in TNF-αlpha-induced vascularpermeability [J].Am J Physiol Cell Physiol，2001，281（4）：1173-1179.

[10]Tarr J M，Kaul K，Chopra M，et al.Pathophysiology of Diabetic Retinopathy[J].ISRN Ophthalmology，2013，15：343560.

[11]Cohen T Nahari D，Cerem LW，et al.Interleukin-6 induces the expression of vascular endothelial growth factor[J].J Biol Chem，1996，271（2）：736-741.

[12]金慧昳，劉堃，許迅.炎癥、抗炎藥物與早期糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)系[J].中華眼底病雜志，2008，24（2）：312-315.

Effects of polysaccharides of dendrobium candidum on overexpression of inflammatory factors in dia- betic rats with retinopathy

LI Jingwen,LI Guowen,QIN Yu,et al.Bengbu Medical College，Bengbu 233030，China

OBJECTIVE To investigate the influence of polysaccharides of dendrobium candidum（PDC）on overexpression of inflammatory factors in diabetic retinopathy model of rats and its anti-inflammatory effects in early-stage diabetic retinopathy and further to explore the possible mechanism.METHODS The diabetic rat model was established by intraperitoneal injection of streptozotocin.After 6 weeks,they were administrated with DPC in low dosage[100 mg/（kg·d）],middle dosage[200 mg/（kg·d）]and high dosage[300 mg/（kg·d）].After 8 weeks,these animals were anesthetized for specimen collection.Then the protein expression of Interleuldn-6（IL-6）,tumor necrosis factor-α（TNF-α）and vascular endothelial growth factor（VEGF）were detected by Western blot;the expression of IL-6,TNF-α in the serum of rats were determined by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay（ELISA）; the expression of NF-κB p65 in retina was determined by immunohistochemistry.RESULTS Compared with normal group,the protein level of IL-6,TNF-α and VEGF as well as serum IL-6 and TNF-α in diabetic group were increased（P＜0.05）while these indexes all decreased when compared with diabetic group（P＜0.05）.But each marker showed no differences between three PDC groups（P＞0.05）.There was no positive staining of NF-κB in normal group,and the expression of NF-κB in three DPC groups was significantly lower than counterpart in diabetic group whose digit was higher than normal group. CONCLUSIONS PDC could reduce the expression of inflammatory cytokines（IL-6,TNF-α）in diabetic

diabetic retinopathy;polysaccharides of Dendrobium Candidum（PDC）;inflammatory factors; NF-κB

R285.5

A

1002-4379（2016）01-0007-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.01.003

上海中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合一流學(xué)科創(chuàng)新項(xiàng)目基金（2014XK003）

1蚌埠醫(yī)學(xué)院（現(xiàn)在上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院眼科），安徽省

蚌埠市233030

2上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，200082

李春霞，E-mail：cxli_66@163.com

retinopathy rats,and inhibit the VEGF expression.The mechanism might be associated with NF-κB pathway．