高糖環境下不同濃度黃芩苷對人腎小管上皮細胞凋亡的影響

孫 韜 黃竹娟 蘇 寧*

1.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510006；2. 廣州市豐華生物工程有限公司，廣東 廣州 510730

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高糖環境下不同濃度黃芩苷對人腎小管上皮細胞凋亡的影響

孫 韜1,2黃竹娟1蘇 寧1*

1.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510006；2. 廣州市豐華生物工程有限公司，廣東 廣州 510730

目的：研究在高糖環境下不同濃度黃芩苷干預對人腎小管上皮細胞凋亡的影響。方法：本研究通過體外實驗，分別檢測在高糖環境下不同濃度黃芩苷干預24h、48h、72h 上皮細胞增殖及凋亡情況，并同時設立陰性對照組(低糖組)、陽性對照組(高糖組)和陽性藥物對照組(RGZ)。結果：24h、48h時間點，黃芩苷干預下的上皮細胞以促進增殖、抑制凋亡為主要表現；72h時間點，低劑量黃芩苷(50、100μmol/L)干預下的上皮細胞仍以促進增殖、抑制凋亡為主要表現，但高劑量黃芩苷組別(200μmol/L)干預下的上皮細胞以抑制增殖、促進凋亡為主要表現。在高糖環境下黃芩苷可抑制上皮細胞凋亡，與陽性藥物對照(RGZ)的趨勢一致。結論：黃芩苷可能通過抑制細胞凋亡的藥理作用，發揮對腎臟的保護作用。

黃芩苷；人腎小管上皮細胞(HK-2)；細胞凋亡；糖尿病

糖尿病腎病[1](diabetic nephropathy，DN)是以腎臟微血管病變作為最主要表現的糖尿病并發癥，也是造成慢性腎衰的主要病因，發病機制尚不完全清楚。近年來，隨著研究的深入，證實細胞凋亡參與DN發生機制。細胞凋亡是機體內細胞死亡的重要途徑[2]，細胞的死亡和更新是多細胞生物整個生命過程中不可缺少的環節，可及時清除機體內的多余細胞和受損傷細胞，對各組織器官的發育及免疫系統的建立發揮重要作用。通常情況下，細胞凋亡過程受機體內嚴格調控，以維持整個生命過程中各組織器官的穩定性。但當細胞凋亡調控失衡時，可引起細胞過度增殖或過度凋亡，都是導致糖尿病腎病患者腎功能進一步惡化的重要因素之一。

傳統藥物黃芩(scutellaria baicalensis georgi)為唇形科植物黃芩的干燥根，迄今己有2000多年的藥用歷史，該藥在《神農本草經》中列為中品，用于“諸熱黃膽，腸泄痢，逐水，下血閉，惡瘡疽蝕火瘍”。黃芩苷(baicalin bai，BB)是從黃芩中提取的一種黃酮類化合物，具有抗菌、消炎、抗氧化、治療或預防糖尿病及其并發癥等藥理作用[3]。在前期研究中發現黃芩苷對糖尿病腎病大鼠腎臟具有保護作用[4-8]。在此基礎上，本文通過體外實驗，觀察在高糖環境下不同濃度的黃芩苷對人腎小管上皮細胞(HK-2)細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 HK-2細胞株購自于中山大學實驗動物中心，鹽酸羅格列酮標準品、黃芩苷標準品(廣東省食品藥品檢驗所,批號20141201)，DMEM 低糖和高糖培養基、胰蛋白酶(上海立菲生物技術有限公司)，胎牛血清(FBS，浙江天杭生物科技有限公司)，噻唑藍(MTT，美國sigma公司)、二甲基亞砜(DMSO，美國sigma公司)。

1.2 細胞培養及分組 HK-2細胞株置于體積分數為5%CO2的37℃恒溫培養箱中用含10%FBS的DMEM低糖培養基傳代培養，胰蛋白酶消化細胞后，用計數板計數，按以4000/孔的密度接種于96孔板，每孔加入100μL 含10%FBS的低糖培養液培養24h，使細胞同步于G0期。棄去培養液，將HK-2細胞隨機分為7組(每組設5個復孔)：A組(NG)：DMEM 低糖培養液(D-葡萄糖濃度為5.5mmol/L)；B組(HG)：DMEM 高糖培養液(D-葡萄糖濃度為25mmol/L)；C組(HG+R5)：DMEM 高糖培養液和RGZ(終濃度為5μmol/L)；D組(HG+R10)：DMEM 高糖培養液和RGZ(終濃度為10μmol/L)；E組(HG+BB50)：DMEM 高糖培養液和BB(終濃度為50μmol/L)；F組(HG+BB100)：DMEM 高糖培養液和BB(終濃度為100μmol/L)；G組(HG+BB200)：DMEM 高糖培養液和BB(終濃度為200μmol/L)。分別干預24、48、72h，共設3個實驗觀察點。

1.3 MTT比色法檢測細胞增殖 當實驗點結束(24、48、72h)時，使用濃度為5mg/mL的MTT溶液加入待測孔，孵育4h，棄去廢液，重新加入DMSO 150μL /孔，振蕩10min后，放入iMark 吸收光酶標儀(選擇490nm波長，Bio-Rad 公司)進行檢測并記錄結果(OD值)。1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 采用AnnexinV-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)雙標記染色法檢測細胞凋亡情況。按上述分組方法，以4000/孔的密度將細胞培養于96孔板中，當實驗點結束(24、48、72 h)時，用流式細胞儀檢測各組腎小管上皮細胞的凋亡率(Q2+Q4)。

2 實驗結果

2.1 高糖環境下不同濃度黃芩苷對HK-2細胞增殖的影響 在24h的實驗點中，B組、C組、D組、E組、F組和G組與A組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。F組與B組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，其余組別與B組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。在48h的實驗點中，B組、C組、D組、E組、F組和G組與A組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。B組、C組、D組、E組、F組和G組與B組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。在72h的實驗點中，B組、C組、D組、E組和F組與A組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其余組別與A組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。C組、D組和F組與B組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，其余組別與B組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。結果詳見表1和圖1。

2.2 高糖環境下不同濃度黃芩苷對HK-2細胞凋亡率的影響 在24h的實驗點中，C組、D組、E組、F組和G組與A組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。C組、D組、E組、F組和G組與B組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。在48h的實驗點中， C組、D組、E組、F組和G組與A組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。C組、D組、E組、F組和G組與B組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。在72h的實驗點中，B組、C組、E組和與A組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；D組、F組與A組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。C組、D組、E組、F組和G組與B組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。結果詳見表2。

表1 高糖環境下不同濃度黃芩苷對HK-2細胞增殖的影響 (OD值)

注：與A組同時段比較，*P<0.05；與B組同時段比較，**P<0.05。

表2 高糖環境下不同濃度黃苓苷對HK-2細胞凋亡的影響 (%，Q2+Q4)

注：與A組同時段比較，*P<0.05；與B組同時段比較，**P<0.05。

3 討論

MTT比色法是目前檢測細胞增殖的常用手段之一，其主要原理[9]是利用四甲基偶氮唑鹽在活細胞線粒體的琥珀酸脫氫酶作用下，由淡黃色被還原成藍紫色或藍黑色的MTT-甲肷，形成的量與活細胞代謝率及細胞增殖程度成正相關。在研究中觀察到，在高糖環境下，HK-2細胞增殖快速(B組與A組比較)，低、中濃度黃芩苷影響下的HK-2細胞增殖快速，高濃度黃芩苷影響下的HK-2細胞增殖受抑制，72h觀察時間點最為顯著。提示高糖對HK-2細胞產生雙重效應，既能誘導細胞增殖，在高濃度藥物環境下，又可抑制細胞增殖。本實驗使用的陽性對照組(RGZ)的HK-2細胞增殖情況與既往研究的報道[10]基本一致。

流式Annexin V/PI 雙染法是目前比較常用、靈敏較高的細胞凋亡測定方法，其主要原理是通過Annexin V-FITC和PI雙重熒光標記以區分正常細胞、早期凋亡細胞和壞死細胞。在研究中觀察到，在高糖環境下，HK-2細胞凋亡顯著增多(B組與A組比較)，結合MTT檢測結果提示在高糖環境下HK-2呈高增殖伴高凋亡率。在藥物(包括BB、RGZ)影響下，可顯著降低凋亡率。但是高濃度黃芩苷(G組)在72h觀察時間點的凋亡率較其他用藥組別顯著升高，結合MTT檢測中低增殖的表現，考慮高濃度黃芩苷促進HK-2細胞凋亡，抑制HK-2細胞增殖，而低、中濃度黃芩苷抑制HK-2細胞凋亡、促進HK-2細胞增殖。

本研究結果與前期研究結果[4-8]提示黃芩苷可能通過抑制細胞凋亡的藥理作用，發揮對腎臟的保護作用。

[1]石巖,楊宇峰.中西醫結合糖尿病學[M].沈陽:遼寧科學技術出版社,2014:56-57.

[2]李敏,林俊.細胞凋亡途徑及其機制[J].國際婦產科學雜志,2014,41(2):103-107.

[3]辛文妤,宋俊科,何國榮,等.黃芩素和黃芩苷的藥理作用及機制研究進展[J].中國新藥雜志,2013,22(6):647-653.

[4]趙碧玲,李先濤,潘思敏,等.黃芩苷膠囊對糖尿病腎病大鼠腎臟病理形態學和蛋白激酶C的影響[J].2016,11(4):488-491.

[5]蘇寧,趙平,佘燕玲,等.黃芩苷對糖尿病腎病大鼠足細胞損傷的修復作用研究[J].中醫學報,2011,26(7):803-805.

[6]蘇寧,李豐,趙平,等.黃芩苷調節DN大鼠腎臟局部生物活性物質的實驗研究[J].世界中西醫結合雜志,2010(1):22-24.

[7]蘇寧,李豐,陳津巖,等.黃芩苷對糖尿病腎病大鼠血漿及腎組織AngⅡ的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2009,20(3):201-203.

[8]蘇寧,羅榮敬,蘇杭,等.黃芩苷對糖尿病腎病大鼠腎功能及其抗氧化應激作用的研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2007,18(5):341-344.

[9]肖湘成,周巧玲.羅格列酮對高糖作用下人腎小管上皮細胞增殖的影響[J].醫學臨床研究,2007,24(9):1533-1535.

[10]王建華，張濤，紀宗正，等.應用噻唑藍比色法進行大腸癌與膽囊細胞生長曲線的對比測定[J].現代腫瘤醫學，2005，13(3)：310-312.

(編輯：穆麗華)

Effect of Baicalin Bai on HK-2 cells Apoptosis in High GLucose Medium

SUN Tao1,2HUANG Zhujuan1SU Ning1＊

1.Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China；2. Guangzhou Fenghua Bioengineering Co., Ltd , Guangzhou 510730, China

Objective To study the effect of Baicalin Bai(BB) on HK-2 cells apoptosis in high glucose medium.Methods The cell proliferation was detemined with MTT method at 24h，48h，72h respectively after HK-2 cells were incubated with normal glucose, high glucose, high glucose plus RGZ or high glucose plus BB.Results At 24h & 48h，in comparison with NG & HG group，the proliferation of HK-2 cells in HG+BB group was increased insignificantly. At 72h，in comparison with NG group，the proliferation of HK-2 cells in HG+BB group was increased insignificantly except for the high - dose HG+BB group(200μmol/L).During the observation，the effect of BB on HK-2 cells growth cultured in high glucose medium is facilitative mainly, it′s similar to RGZ in concentration and times．Conclusion BB pharmacological effects by inhibiting apoptosis, play a protective effect on the kidneys.

HK-2；Kidney Tubules；Cell Division；High Glucose

2016-08-23

孫韜(1984-)，男，漢族，碩士研究生，主要研究方向為中醫藥防治代謝性疾病。E-mail:dick_hill@163.com

蘇寧(1966-)，女，漢族，博士，教授，碩士研究生導師。主要從事中醫藥防治免疫相關性疾病的研究。E-mail:suning@gzucm.edu.cn

R285.5

A

1007-8517(2016)21-0029-03