青枯菌Po82菌株Ⅵ型分泌系統(tǒng)基因簇功能研究

羅亞婷, 許景升, 徐 進(jìn), 張 昊, 馮 潔

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193)

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研究報(bào)告

青枯菌Po82菌株Ⅵ型分泌系統(tǒng)基因簇功能研究

羅亞婷, 許景升, 徐 進(jìn), 張 昊, 馮 潔*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193)

Ⅵ型分泌系統(tǒng)(type Ⅵ secretion system, T6SS)是革蘭氏陰性細(xì)菌中新近發(fā)現(xiàn)的分泌系統(tǒng),控制細(xì)菌的毒性和蛋白泌出。本試驗(yàn)構(gòu)建了植物青枯菌Po82菌株的T6SS基因簇完全缺失菌株,從全局水平初步分析了T6SS的功能。與野生型菌株相比,T6SS基因簇的缺失導(dǎo)致了突變菌株運(yùn)動(dòng)能力顯著增強(qiáng),在接種前期突變株病情指數(shù)明顯下降;通過(guò)qRT-PCR分析Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)子基因,其中popA、popB和popP基因表達(dá)量上調(diào),而popC表達(dá)水平下調(diào)。T6SS基因簇的缺失影響了Po82菌株的運(yùn)動(dòng)能力和Ⅲ型效應(yīng)子基因的表達(dá),使得Po82病程延長(zhǎng)。這些結(jié)果說(shuō)明,T6SS參與青枯菌的致病過(guò)程,且T6SS與T3SS之間有復(fù)雜的未知調(diào)控關(guān)系。

青枯菌; Ⅵ型分泌系統(tǒng); 基因簇; 致病力

由青枯菌(Ralstoniasolanacearum)引起的植物細(xì)菌性枯萎病是危害性巨大的植物細(xì)菌性病害之一。青枯菌寄主范圍非常廣,可危害馬鈴薯、煙草、番茄、香蕉、花生、茄子和姜等重要作物,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。青枯菌通過(guò)非常復(fù)雜的多元件網(wǎng)絡(luò)調(diào)控眾多致病因子,如胞外蛋白酶,細(xì)胞壁降解酶,多糖和Ⅲ型分泌系統(tǒng)及其效應(yīng)蛋白等[3],感知內(nèi)部和外部環(huán)境的變化,增強(qiáng)其致病力和適應(yīng)能力。

Ⅵ型分泌系統(tǒng)(type Ⅵ secretion system,T6SS)廣泛存在于致病性革蘭氏陰性細(xì)菌中,包括霍亂弧菌(Vibrocholerae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、沙門(mén)氏菌(Salmonellaenterica)和鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderiamallei)等,與病原菌的致病力、細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)及互作等多種生命活動(dòng)密切相關(guān),其分泌的效應(yīng)蛋白作用于原核和真核細(xì)胞。T6SS通常由一個(gè)平均長(zhǎng)度超過(guò)20 kb的基因簇編碼[4]。關(guān)于T6SS及其效應(yīng)子的研究多集中在人類(lèi)病原菌中,如,黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、霍亂弧菌(V.cholera)和銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)。比較基因組分析和功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),動(dòng)物病原菌中的T6SS在細(xì)菌毒性方面具有重要作用[5-7],而在其他細(xì)菌存在的情況下,動(dòng)物病原菌中的T6SS通過(guò)刺激菌體增殖,抑制寄主免疫反應(yīng),從而增加自身對(duì)環(huán)境的競(jìng)爭(zhēng)適應(yīng)性[8]。目前研究人員也在根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)、青枯菌(R.solanacearum)、丁香假單胞菌(P.syringae)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)和P.protegens等植物病原菌中開(kāi)展T6SS的相關(guān)研究。在P.syringaepv.tomatoDC3000菌株中有3個(gè)T6SS,分別缺失T6SS-Ⅱ和T6SS-Ⅲ后均影響病原菌在煙草上的定殖以及對(duì)番茄的致病力[9]。

我們前期研究發(fā)現(xiàn),青枯菌Po82菌株的4個(gè)核心基因vasF、hcp、vgrG和impA的缺失,可導(dǎo)致病菌致病力明顯減弱,但致病性并未完全喪失,而Ⅵ型分泌系統(tǒng)重要組成基因tssM的突變不僅影響了病菌的致病力,而且影響了Ⅲ型分泌系統(tǒng)部分效應(yīng)子的表達(dá)[10],表明Ⅵ型與Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system, T3SS)之間可能存在著某種未知的協(xié)同調(diào)控機(jī)制。單個(gè)基因的突變不足以反映T6SS的整體功能,因此我們決定整體缺失Po82菌株中T6SS基因簇,通過(guò)致病力和基礎(chǔ)生物學(xué)測(cè)定,以期評(píng)價(jià)T6SS的作用和發(fā)掘T6SS與T3SS之間的調(diào)控關(guān)系,探究T6SS在青枯菌致病過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和質(zhì)粒

本研究所使用的菌株、質(zhì)粒特征及來(lái)源見(jiàn)表1。青枯菌菌株P(guān)o82采用NA或NB培養(yǎng)基,28℃條件下培養(yǎng)。大腸桿菌(EscherichiacoliDH5α)采用LB培養(yǎng)基(固體或液體),37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

表1 本試驗(yàn)所用菌株與質(zhì)粒

1.2 主要試劑和儀器

2×GC buffer I、Ex Taq 酶、dNTP Mix (2.5 μmol/L)等購(gòu)自大連寶生物(TaKaRa)公司;Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、HiScriptⅡ Q Select RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)、SYBR Green Master Mix (Low ROX Premixed)等購(gòu)自諾唯贊(Vazyme)生物科技公司;其他試劑和儀器包括DNA ladder、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Axygen)、質(zhì)粒小提試劑盒(Axygen)、中美泰和無(wú)縫連接試劑盒;熒光定量PCR儀(ABI 7500),分光光度計(jì)(Analitik Jena)等。氨芐青霉素Amp(終濃度100 μg/mL),慶大霉素Gm(終濃度50 μg/mL),卡那霉素Kan(終濃度50 μg/mL)。

1.3 培養(yǎng)基

1%蔗糖NA培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)基加1%(W/V)蔗糖,10%蔗糖NA培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)基加10%(W/V)蔗糖;半固體培養(yǎng)基(SMM):葡萄糖100 mg,蛋白胨100 mg,乙二胺四乙酸二鈉38 mg,pH=7.0的磷酸鹽緩沖液10 mL,瓊脂2.5 g,用蒸餾水定容到1 000 mL,121℃滅菌15 min;hrp誘導(dǎo)培養(yǎng)基[11]等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 青枯菌Po82菌株T6SS基因簇缺失載體構(gòu)建

本試驗(yàn)采用USER(uracil-specific excision reagent)技術(shù)一步構(gòu)建自殺載體進(jìn)行同源重組雙交換,敲除目標(biāo)基因[12-13]。參照Po82(全基因組序列GenBank登錄號(hào): CP002819),根據(jù)T6SS基因簇的上下游序列設(shè)計(jì)引物。其中左臂引物為821UF/UR,右臂引物為821DF/DR(表2)。以青枯菌菌株P(guān)o82基因組DNA為模板分別擴(kuò)增T6SS基因簇的上下游,得到左臂片段2.5 kb,右臂片段2.8 kb。擴(kuò)增條件為:95℃ 3 min;93℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 2 min,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后備用;將基因左臂序列、右臂序列連接到酶切處理后的pKMS1-gm(+U)載體上,連接體系25 μL:USER酶(1 000 U/mL)1 μL,pKMS1-gm(+U)質(zhì)粒4 μL,上游片段(+U)10 μL,下游片段(+U)10 μL;連接條件:37℃,20 min;25℃,20 min。

連接產(chǎn)物采用熱擊法轉(zhuǎn)化E.coliDH5α:轉(zhuǎn)化菌液涂于含50 μg/mL Gm 的LB平板上37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑單菌落于含50 μg/mL Gm的液體LB培養(yǎng)基中,37℃,180 r/min培養(yǎng)過(guò)夜,離心收集菌體提取質(zhì)粒。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒(pKMS1-Ⅵ-gm)進(jìn)行PCR驗(yàn)證后交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

植物青枯菌Po82菌株的自然轉(zhuǎn)化[14-15]:挑取Po82菌株單菌落于hrp液體培養(yǎng)基中,28℃,180 r/min培養(yǎng)至A600=0.8～1.0,取50 μL菌液于1.5 mL離心管中后加入2～5 μg 重組自殺質(zhì)粒后混勻備用,將滅菌后的0.45 μm的濾膜放在hrp固體培養(yǎng)基中,約3～5個(gè)/皿。將菌液點(diǎn)在濾膜上,不倒置,28℃培養(yǎng)48 h。

基因突變菌株的篩選和鑒定:(1)自然轉(zhuǎn)化培養(yǎng)48 h后,用無(wú)菌水洗脫濾膜上的菌膿并涂布于含Gm 的NA平板上,28℃培養(yǎng)24～48 h,從中挑取單菌落,用含Gm 的1%蔗糖NA液體培養(yǎng)基搖菌3～4次后,用植物青枯菌特異性引物759/760鑒定篩選的菌株為青枯菌;(2)將上一步得到的菌液稀釋到10-6后,取200 μL涂布于含Gm 的10%蔗糖NA固體平板上,于28℃培養(yǎng)24～48 h。將長(zhǎng)出的單菌落挑出,用含Gm 的10%蔗糖NA液體培養(yǎng)基搖菌;(3)用T6SS基因簇核心基因引物(表2)進(jìn)行目的基因擴(kuò)增鑒定,根據(jù)擴(kuò)增情況判斷是否發(fā)生雙交換,最后得到突變菌株P(guān)o82ΔVI。

1.4.2 基因互補(bǔ)菌株的構(gòu)建

根據(jù)基因序列,以青枯菌Po82基因組DNA為模板,設(shè)計(jì)T6SS基因簇3個(gè)核心基因vgrG1、vgrG2、hcp引物對(duì):VgrG1OF/R、VgrG2OF/R和HCPOF/R,引物對(duì)含上游約600 bp區(qū)域,可能包含其啟動(dòng)子(表2)。PCR擴(kuò)增條件為:95℃ 3 min;93℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 1 min,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。質(zhì)粒pBBR1MCS-4是廣寄主克隆載體,在細(xì)菌體內(nèi)表達(dá)能力較弱,故加入一段強(qiáng)啟動(dòng)子序列得到重組質(zhì)粒pBBR1MCS-4_PSA,作為互補(bǔ)質(zhì)粒。設(shè)計(jì)引物對(duì)pBR4PSAF/R(表2),PCR擴(kuò)增條件為:95℃ 3 min;93℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃4 min,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。所得PCR產(chǎn)物(vgrG1為1 238 bp,vgrG2為1 232 bp,hcp為1 143 bp)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化,連接到質(zhì)粒pBBR1MCS-4_PSA上。連接體系為10 μL:2×Master Assembly Mix 5 μL,pBBR1MCS-4_PSA (64 μg/mL)1 μL,片段2 μL,ddH2O 2 μL。50℃連接15 min,采用熱擊法轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。

在含Amp的LB平板上挑取單菌落于含Amp的液體LB中振蕩培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒(pBR4PSA-vgrG1、pBR4PSA-vgrG2、pBR4PSA-hcp)進(jìn)行PCR驗(yàn)證后交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定后用于互補(bǔ)試驗(yàn)。

制備青枯菌Po82菌株電擊感受態(tài):參照Lavie等[16]的方法,將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pBR4PSA-vgrG1、pBR4PSA-vgrG2、pBR4PSA-hcp分別電擊導(dǎo)入青枯菌Po82ΔⅥ菌株中,在含有Gm和Amp的平板上篩選后進(jìn)行PCR檢驗(yàn)和測(cè)序驗(yàn)證,最終獲得具有抗性的互補(bǔ)菌株P(guān)o82ΔⅥ-vgrG1、Po82ΔⅥ-vgrG2和Po82ΔⅥ-hcp。

表2 所用引物序列

續(xù)表2 Table 2(Continued)

引物名稱Primername引物序列(5′?3′)(下畫(huà)線部分為接頭)Primersequences(Theunderlinedpartisthejoint)靶標(biāo)基因Targetgene退火溫度/℃Annealingtemperature延伸時(shí)間ExtensiontimepBR4PSAFpBR4PSARATCGTCGAACGGCAGCGATAAAGCTTGCTGCAGGTCGAATGTCTGGAAGATCCTCGAGAGCTCCGATGATAAGCTGpBR4PSA604min82tssLF82tssLRCCGGCGAAACGTTCTTCATCGAATAGCCCTCCAGCGTCTCtssL6030sDUF876FDUF876RAGAAGTCGGTGAAGCTGGTGGAAGTAGCGCGTCGAGATCADUF8766030sDUF877FDUF877RCGAGTACGCCAAGTGGAAGTCACCGGTTGAGGAAGGTCTCDUF8776030s82HcpF82HcpRTGAAGGATATCTACGTCAAGTTCGAACCGAGTAGGTCTTGTCGTTChcp6030s82vasAF82vasARAAGCGGTCGGCTTTACAGAAACCACGGACAGATGGTTGAGvasA6045s82vgrGF82vgrGRGCTCGATTTGCTGACCCAACGTACTGGCCGGGGTAATCGvgrG6030s82impAF82impARTGACCGAGATCAAGGAAGCGCCCAACCCCAACAGTTCCTCimpA601mingyrBFgyrBRGACCTTCCAGGGGTTGATCGTCTCCCCCAGCCCCTTATACgyrB5830spopAFpopARTTCAGGAGCTTCACCAGGTCTCAACACCAATGGCAACTCCAApopA5830spopBFpopBRTGTTCATCAGCGCATCCTCCCCGATACAGGCGGCGATACpopB5830spopCFpopCRGCTTGTGCTTGTGCTTGTGCTTTGCTGCGGAATCAGCTTGCGGTGpopC5830spopPFpopPRCTCGGTATAGCCCGGCAAATCAAAGGATGCGTTTGTGGCApopP5830s

1.4.3 野生型、突變菌株以及互補(bǔ)菌株致病力測(cè)定

采用傷根澆注菌液接種法[17],接種番茄感病品種‘中雜9號(hào)’,每株番茄苗澆注30 mL濃度為3×107cfu/mL的菌懸液,野生型、突變株及互補(bǔ)菌株各接種20株,接種試驗(yàn)各重復(fù)3次。培養(yǎng)條件:光照培養(yǎng)箱,L∥D=16 h∥8 h光周期,28～30℃,相對(duì)濕度90%。調(diào)查方法:青枯病的病情調(diào)查參照Meng等[18]的方法。每天調(diào)查發(fā)病情況,持續(xù)觀察2～3周,記錄病情指數(shù)并進(jìn)行方差分析。

1.4.4 野生型、突變菌株以及互補(bǔ)菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

分別挑取植物青枯菌Po82菌株、基因簇缺失突變株和互補(bǔ)菌株的單菌落,接于含10 mL NB培養(yǎng)基的三角瓶中,28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取過(guò)夜培養(yǎng)菌液稀釋至A600=0.1,然后按1∶100的體積比分別接種于100 mL NB液體培養(yǎng)基內(nèi)。28℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)。從振蕩培養(yǎng)開(kāi)始,每隔3 h,取樣檢測(cè)培養(yǎng)基中的菌體濃度(A600),以不含菌液的NB培養(yǎng)基為空白對(duì)照,當(dāng)所測(cè)樣品的濃度A600>1.0時(shí),對(duì)樣品進(jìn)行梯度稀釋,使每個(gè)稀釋后樣品的A600<1.0,再根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出原始菌液的A600值,試驗(yàn)重復(fù)3次,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.5 野生型、突變菌株以及互補(bǔ)菌株運(yùn)動(dòng)性的測(cè)定

采用針刺接種法進(jìn)行運(yùn)動(dòng)性測(cè)定,用接種針粘取單菌落,穿刺到含0.25%瓊脂的SMM平板上,不接觸平板底部。培養(yǎng)皿不倒置,30℃靜置培養(yǎng)7～9 d[19-22]。運(yùn)動(dòng)性細(xì)菌向周?chē)佬泻髸?huì)形成一個(gè)明顯的圓形斑,觀察并測(cè)量平板上的菌落直徑并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4.6 野生型、突變菌株以及互補(bǔ)菌株生物膜的測(cè)定

生物被膜的測(cè)定方法參照Z(yǔ)hang等[10,23]。挑取NA固體培養(yǎng)基平板上的青枯菌Po82菌株、突變株和互補(bǔ)菌株的單菌落至NB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至A490=0.7～0.8;用新鮮的L液體培養(yǎng)基按比例1∶100 稀釋至60 mL三角瓶中;30℃靜置培養(yǎng)7 d,每個(gè)處理重復(fù)3次;加入600 μL 0.1%(W/V)結(jié)晶紫溶液染色30 min;用洗瓶盡量小心地沖洗,避免將生物被膜破壞,反復(fù)沖洗3～5次;加入95%乙醇1 mL進(jìn)行洗脫,采用分光光度計(jì)測(cè)量洗脫液的吸光度值(A490)。

1.4.7 qRT-PCR檢測(cè)T3SS相關(guān)基因的表達(dá)

本試驗(yàn)選取持家基因gyrB作為內(nèi)參基因,T3SS相關(guān)基因popA、popB、popC、popP進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。設(shè)計(jì)引物(表2),擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約150～200 bp。通過(guò)PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)引物特異性和擴(kuò)增效率,擴(kuò)增條件:95℃ 3 min;93℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃30 s,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。

三是大力發(fā)展民生水利，著力提高水利公共服務(wù)能力。完成17處大型灌區(qū)和9處中型灌區(qū)年度節(jié)水改造任務(wù)，實(shí)施好6個(gè)規(guī)模化節(jié)水灌溉增效示范項(xiàng)目建設(shè)，建設(shè)節(jié)水灌溉面積510萬(wàn)畝（34萬(wàn)hm2）、“旱能澆、澇能排”高標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)田385萬(wàn)畝（25.67萬(wàn)hm2）。解決360萬(wàn)人飲水安全問(wèn)題，推進(jìn)沿黃地區(qū)飲水安全平原水庫(kù)建設(shè)，建立縣級(jí)水質(zhì)檢測(cè)中心和供水服務(wù)“116”熱線。

通過(guò)TRIzol法提取青枯菌野生型和突變菌株的RNA,具體步驟參考張麗勍等[17]。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的純度。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScriptⅡQ Select RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)得到cDNA后,進(jìn)行qRT-PCR。相關(guān)基因表達(dá)情況的分析采用相對(duì)定量的方法(2-△△Ct)[24]。

反應(yīng)體系 20 μL:SYBR Green Master Mix 10 μL,cDNA 2.0 μL,Primer F/R(10 μmol/L)0.4 μL,ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序:95℃ 10 min;95℃ 15 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán);95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 30 s,60℃ 15 s。

2 結(jié)果與分析

2.1 青枯菌Po82菌株T6SS基因簇突變株的構(gòu)建與鑒定

通過(guò)培養(yǎng)基篩選得到具有Gm抗性和對(duì)蔗糖敏感的突變株后,進(jìn)行PCR驗(yàn)證,選用T6SS基因簇7個(gè)核心基因引物進(jìn)行驗(yàn)證(圖1),同時(shí)將PCR產(chǎn)物純化后送上海生工公司測(cè)序,通過(guò)序列比對(duì)后,得到性狀穩(wěn)定的突變菌株P(guān)o82ΔⅥ。

圖1 T6SS突變菌株P(guān)o82ΔⅥ的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR analysis of T6SS gene cluster of the mutant strains

2.2 互補(bǔ)菌株的構(gòu)建與鑒定

hcp和vgrG不僅是T6SS裝置的結(jié)構(gòu)組分,也是T6SS分泌出的效應(yīng)子蛋白,作為功能性T6SS的標(biāo)志基因,存在于所有的T6SS中。本研究選取hcp、vgrG1和vgrG2作為T(mén)6SS基因簇缺失突變株的互補(bǔ)基因。根據(jù)Po82基因組中hcp、vgrG1和vgrG2核苷酸序列設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增得到3個(gè)基因片段并連接至互補(bǔ)載體pBBR1MCS-4_PSA中,經(jīng)PCR和測(cè)序驗(yàn)證,載體pBR4PSA-vgrG1、pBR4PSA-vgrG2和pBR4PSA-hcp構(gòu)建成功。隨后,將重組載體分別電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)至突變株P(guān)o82ΔⅥ中,于含有Gm和Amp抗性的NA平板上篩選轉(zhuǎn)化子。PCR檢驗(yàn)和測(cè)序驗(yàn)證,最后獲得互補(bǔ)菌株,分別命名為Po82△Ⅵ-vgrG1、Po82△Ⅵ-vgrG2和Po82△Ⅵ-hcp(圖2)。

圖2 T6SS基因簇3個(gè)核心基因互補(bǔ)菌株P(guān)o82ΔⅥ-vgrG1、Po82ΔⅥ-vgrG2和Po82ΔⅥ-hcp的鑒定Fig.2 PCR analysis of the three core gene complementary strains Po82ΔⅥ-vgrG1, Po82ΔⅥ-vgrG2 and Po82ΔⅥ-hcp

傷根澆注菌液接種法接種番茄進(jìn)行致病力測(cè)定,統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明:Po82菌株在接種后第4天開(kāi)始發(fā)病,突變株P(guān)o82ΔⅥ在接種后第5天才出現(xiàn)明顯的萎蔫癥狀;在接種后的第10天,Po82野生型菌株的病情指數(shù)達(dá)到88.89,而突變株P(guān)o82ΔⅥ僅為59.52,下降了33.04%,兩者差異極顯著(P<0.01)(圖3)。隨著接種天數(shù)的增加,15 d后,互補(bǔ)菌株的病情指數(shù)與野生型菌株沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。

圖3 野生型菌株、T6SS基因簇突變株和互補(bǔ)菌株致病力測(cè)定結(jié)果Fig.3 Virulence test of the wild-type Po82, Po82ΔⅥ,Po82ΔⅥ-vgrG1, Po82ΔⅥ-vgrG2 and Po82ΔⅥ-hcp

2.4 T6SS缺失對(duì)青枯菌生長(zhǎng)能力的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示,在NB培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下,突變株P(guān)o82ΔⅥ較野生型菌株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率減慢,差異極顯著(P<0.01)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,突變菌株、互補(bǔ)菌株的生長(zhǎng)速率與野生型菌株沒(méi)有明顯差異(P>0.05)(圖4)。結(jié)果表明:T6SS基因簇影響青枯菌Po82菌株前期的生長(zhǎng)速率。

圖4 野生型菌株、T6SS基因簇突變株和互補(bǔ)菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果Fig.4 Growth curve of the wild-type Po82, Po82ΔⅥ,Po82ΔⅥ-vgrG1, Po82ΔⅥ-vgrG2 and Po82ΔⅥ-hcp

2.5 T6SS缺失對(duì)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性的影響

將各菌株接種至半固體培養(yǎng)基,菌落直徑測(cè)量結(jié)果分析表明,突變株P(guān)o82ΔⅥ的運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng),與野生型菌株P(guān)o82有極顯著差異(P<0.01),互補(bǔ)hcp的菌株運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng),有極顯著差異(P<0.01);互補(bǔ)vgrG1的菌株運(yùn)動(dòng)能力減弱,沒(méi)有明顯差異;互補(bǔ)vgrG2基因的菌株運(yùn)動(dòng)能力明顯減弱,有極顯著差異(P<0.01)(圖5)。結(jié)果表明:T6SS基因簇影響青枯菌Po82菌株運(yùn)動(dòng)能力,并且T6SS基因簇內(nèi)不同基因?qū)η嗫菥倪\(yùn)動(dòng)性具有不同的作用。

圖5 野生型菌株、突變菌株及互補(bǔ)菌株的運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)Fig.5 The mobility of the wild-type Po82 strain, Po82ΔⅥ,Po82ΔⅥ-vgrG1, Po82ΔⅥ-vgrG2 and Po82ΔⅥ-hcp

2.6 T6SS缺失對(duì)細(xì)菌生物膜形成的影響

采用結(jié)晶紫法對(duì)青枯菌株P(guān)o82野生菌株、突變株及互補(bǔ)菌株進(jìn)行了測(cè)定。研究表明,突變菌株P(guān)o82ΔⅥ形成生物被膜的能力較野生型弱,但差異不顯著(P>0.05)。互補(bǔ)菌株與野生型菌株形成生物被膜的能力沒(méi)有明顯差異(P>0.05)(圖6)。結(jié)果表明,青枯菌T6SS不影響青枯菌生物膜的形成。

圖6 野生型菌株,突變菌株及互補(bǔ)菌株的生物被膜形成結(jié)果Fig.6 Biofilm formation of the wild-type Po82 strain,Po82ΔⅥ, Po82ΔⅥ-vgrG1, Po82ΔⅥ-vgrG2 and Po82ΔⅥ-hcp

2.7 T6SS缺失對(duì)青枯菌T3SS分泌蛋白基因表達(dá)的影響

T3SS在青枯菌致病過(guò)程中具有非常重要的作用,T3SS分泌的效應(yīng)子多與致病性相關(guān),而前期研究發(fā)現(xiàn)Ⅵ型分泌系統(tǒng)與Ⅲ型分泌系統(tǒng)之間存在著某種競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[17]。T3SS標(biāo)志效應(yīng)子popA、popB、popC和popP的qPCR分析結(jié)果表明,突變株P(guān)o82ΔⅥ中popC表達(dá)量下調(diào),popA、popB和popP表達(dá)量上調(diào)(圖7);因此青枯菌中T6SS基因簇對(duì)T3SS效應(yīng)子蛋白表達(dá)的影響涉及復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。

圖7 qPCR檢測(cè)Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)子基因表達(dá)Fig.7 qPCR analysis of T3SS effector gene expression

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),將T6SS保守的核心基因tssM突變后,青枯菌致病力明顯降低;qRT-PCR結(jié)果表明,突變株的Ⅲ型分泌系統(tǒng)部分效應(yīng)子的表達(dá)顯著上調(diào),推測(cè)T6SS可能與T3SS存在著某種未知的競(jìng)爭(zhēng)調(diào)控機(jī)制[10]。在銅綠假單胞菌中,T6SS和T3SS通過(guò)RetS/GacS和c-di-GMP途徑來(lái)協(xié)同調(diào)控病原菌的生存方式及其感染策略[25]。采用生物信息學(xué)方法搜索青枯菌全基因組序列時(shí),并未發(fā)現(xiàn)與銅綠假單胞菌中retS或gacS同源的基因或者蛋白,僅發(fā)現(xiàn)二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶WspR同源蛋白,表明在植物青枯菌中T6SS影響T3SS效應(yīng)子的機(jī)制不同于銅綠假單胞菌。T6SS通常由一個(gè)單一的包含15～20個(gè)保守開(kāi)放閱讀框的基因簇編碼,基因簇中單個(gè)組成基因的突變不能從全局水平分析T6SS的作用,因此我們采取整體缺失T6SS基因簇的方法鑒定T6SS的功能。本研究發(fā)現(xiàn)青枯菌中T6SS對(duì)不同的Ⅲ型效應(yīng)子蛋白的表達(dá)具有不同的影響,在選取的4個(gè)T3SS效應(yīng)子蛋白中,與野生型菌株相比,其中3個(gè)(popA,popB和popP)在T6SS基因簇缺失突變體中表達(dá)量上調(diào),這與單個(gè)T6SS基因(tssM)突變后的試驗(yàn)結(jié)果一致,但是popC表達(dá)量則下調(diào),表明青枯菌通過(guò)復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制和網(wǎng)絡(luò)控制Ⅲ型效應(yīng)子蛋白的表達(dá)和泌出,究竟T6SS采用何種方式影響T3SS效應(yīng)子蛋白的表達(dá)還需要開(kāi)展更為深入的研究,以解析這種影響機(jī)制。

Hcp和VgrG不僅是T6SS泌出蛋白,也是T6SS結(jié)構(gòu)組成因子。細(xì)胞外組件Hcp(溶血素共調(diào)節(jié)蛋白)和VgrG(纈氨酸-甘氨酸重復(fù)蛋白G)形成類(lèi)似細(xì)菌噬菌體尾部針狀的注射裝置,Hcp蛋白類(lèi)似于λgpV尾管蛋白,形成一個(gè)六聚管狀結(jié)構(gòu)[26-27]。VgrG三聚體位于Hcp管的遠(yuǎn)端,形成一個(gè)類(lèi)細(xì)胞穿刺裝置的尾釘,VgrG在結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于T4噬菌體中g(shù)p5-gp27融合蛋白[28]。因此選取T6SS核心組件基因hcp、vgrG1和vgrG2獲得T6SS基因簇缺失菌株的互補(bǔ)菌株。

本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建T6SS缺失突變株和3個(gè)互補(bǔ)菌株,檢測(cè)了T6SS對(duì)青枯菌致病力的影響。發(fā)現(xiàn)突變株對(duì)番茄的致病力在接種早期明顯減弱,隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng),其致病力逐漸達(dá)到野生菌株的水平,而單基因的互補(bǔ)菌株致病力并沒(méi)有完全恢復(fù)到野生型狀態(tài),盡管Hcp和VgrG是T6SS具有功能性的標(biāo)志,但是單基因不具有T6SS基因簇的完整功能,后期還需要通過(guò)基因組文庫(kù)進(jìn)行完整的T6SS基因簇互補(bǔ)分析。

隨后對(duì)T6SS基因簇進(jìn)行了運(yùn)動(dòng)性和生物膜方面的試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)T6SS基因簇影響青枯菌Po82菌株運(yùn)動(dòng)能力,并且T6SS基因簇內(nèi)不同基因?qū)η嗫菥倪\(yùn)動(dòng)性具有不同的作用。Shalom等[29]的結(jié)果表明,hcp基因可能與運(yùn)動(dòng)性相關(guān),本研究中也得到了相似的結(jié)果,hcp基因互補(bǔ)菌株的運(yùn)動(dòng)性能力顯著增強(qiáng)。

此外,Po82菌株在青枯菌新的分類(lèi)系統(tǒng)中屬于演化型2,序列變種4,進(jìn)化地位十分特殊[30-31]。本試驗(yàn)也為探究T6SS在青枯菌進(jìn)化中是否發(fā)揮作用奠定了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯:田 喆)

Functional analysis of a T6SS cluster of Ralstonia solanacearum Po82

Luo Yating, Xu Jingsheng, Xu Jin, Zhang Hao, Feng Jie

(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

The type Ⅵ secretion system (T6SS) is a machinery recently discovered in Gram-negative bacteria for translocation of proteins and also required for full virulence. In this study, T6SS gene cluster-deleted mutants ofRalstoniasolanacearumstrain Po82 were constructed in order to evaluate global functions of the T6SS cluster. We showed that the mutant strains had significantly attenuated their virulence on tomato plants in early stage. The expression of type Ⅲ effector genes,popA,popBandpopP, but notpopC, was up-regulated revealed by real-time PCR.In addition, the motility of the mutants was increased. These results indicated that the T6SS gene cluster is involved in pathogenesis ofR.solanacearumand there are complex unknown regulatory mechanisms between T6SS and T3SS.

Ralstoniasolanacearum; type Ⅵ secretion system; gene cluster; virulence

Research Reports

2016-01-26

2016-02-29

國(guó)家自然科學(xué)基金(31371908)

S 432.42

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.005

* 通信作者 E-mail: jfeng@ippcaas.cn