四聚乙醛亞致死劑量對福壽螺AchE、GSTs和MFO活性的影響

張文領(lǐng), 牟希東, 韋 慧, 楊葉欣, 徐 猛, 羅 渡, 胡隱昌*

(1. 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室,中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所,廣州 510380; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

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四聚乙醛亞致死劑量對福壽螺AchE、GSTs和MFO活性的影響

張文領(lǐng)1,2, 牟希東1, 韋 慧1, 楊葉欣1, 徐 猛1, 羅 渡1, 胡隱昌1*

(1. 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室,中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所,廣州 510380; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

為了解亞致死劑量四聚乙醛對福壽螺的主要靶標(biāo)酶和解毒酶活性的影響,研究了0.50 mg/L的四聚乙醛處理不同時間后福壽螺不同組織中乙酰膽堿酯酶(AchE)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和多功能氧化酶(MFO)的活力變化。結(jié)果顯示,四聚乙醛對福壽螺具有良好的殺滅效果, 96 h LC50為3.856 mg/L,安全濃度為0.039 mg/L;在用0.50 mg/L的四聚乙醛處理的24 h內(nèi),福壽螺鰓和腹足內(nèi)AchE酶活力分別升高到未處理時的1.565和1.481倍而后下降,肝和腸組織內(nèi)AchE酶活力分別下降為未處理時的0.132、0.282倍而后升高;不同組織中GSTs酶活力均呈現(xiàn)為“降低—升高—降低”的趨勢;不同組織內(nèi)MFO酶活力均為先下降后上升的趨勢。研究表明0.50 mg/L的四聚乙醛能誘導(dǎo)AchE、MFO和GST活性不同程度的增加,解毒酶MFO和GSTs可能在四聚乙醛的代謝中起著一定作用。

四聚乙醛; 福壽螺; 亞致死效應(yīng); 解毒酶系

福壽螺[Pomaceacanaliculata(Lamarck)]是世界百種惡性外來入侵物種之一[1],適應(yīng)性強,繁殖能力高,是危害水稻及各類水生作物的惡性水生動物[2],也是廣州管圓線蟲(Angiostrongyluscantonensis)的中間宿主[3]。目前,對福壽螺的防治主要使用殺螺劑。四聚乙醛(metaldehyde)作為中等毒性的殺螺劑,具有在螺體接觸或取食后短時間內(nèi)致死的效果[4]。但由于施于田間后,其在環(huán)境中的毒力隨著時間延續(xù)會逐漸遞減到亞致死劑量[5],且連續(xù)施用已經(jīng)導(dǎo)致福壽螺對四聚乙醛產(chǎn)生了抗藥性[6]。研究認(rèn)為殺蟲劑的亞致死濃度會誘導(dǎo)機體解毒酶系的變化,害蟲在亞致死濃度的選擇壓力下有利于抗藥性的積累和發(fā)展[7]。因此在使用殺蟲劑時,不僅要關(guān)注其防治效果,還應(yīng)該對其可能的亞致死效應(yīng)及害蟲抗藥性風(fēng)險進(jìn)行系統(tǒng)研究。目前對殺蟲劑亞致死效應(yīng)的研究主要體現(xiàn)在兩個方面,一是對害蟲行為、生殖和生長發(fā)育的影響[5,8-9];二是對害蟲解毒酶系影響的劑量、時序效應(yīng)及其與代謝抗性相關(guān)性的研究[7,10]。

研究認(rèn)為多功能氧化酶(mixed-functional oxidase, MFO)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferases, GSTs)、羧酸酯酶等是動物體內(nèi)的重要解毒酶系[11]。在殺蟲劑等異源物質(zhì)的解毒代謝中,MFO的重要組分CYP450酶系[12]主要參與生物降解的第一階段,將化合物在單加氧酶作用下還原為次級代謝產(chǎn)物,然后在GSTs、羧酸酯酶等和抗氧化機制的作用下進(jìn)一步代謝轉(zhuǎn)化[13]。它們的表達(dá)具有組織特異性和可誘導(dǎo)性,在受到藥劑等異源物質(zhì)脅迫時,會在特定的組織中活性增強[14]。目前,關(guān)于農(nóng)藥對解毒酶系亞致死效應(yīng)的研究主要集中于殺蟲劑、除草劑殘留對昆蟲的毒性[15]及水體污染物對海洋魚、貝類代謝的誘導(dǎo)[16-17]。雖然已有研究報道了殺螺胺乙醇胺鹽、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽和茶皂素對福壽螺的亞致死效應(yīng),包括影響其乙酰膽堿酯酶(AchE)、GSTs和纖維素酶的活性等[18],但作為重要殺螺劑，四聚乙醛對福壽螺的亞致死效應(yīng)未見報道,本研究從四聚乙醛對福壽螺的急性毒性入手,研究四聚乙醛處理不同時間后福壽螺不同組織內(nèi)MFO、AchE和GSTs的活性變化,以了解四聚乙醛對福壽螺解毒酶系的誘導(dǎo)作用,指導(dǎo)四聚乙醛的合理使用,為了解解毒酶系活性變化與福壽螺耐藥性形成的關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試螺體

試驗所用福壽螺均于2015年4月采集于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所外來水生生物入侵風(fēng)險評估中心(113°13′375′′E,23°03′375′′N),水體未施加任何農(nóng)藥,所用螺體質(zhì)量為9.32～15.28 g,殼高3.5～4.5 cm。試驗時間段內(nèi)水溫為24～38℃,自然光照條件,暫養(yǎng)于去氯充氧的淡水培養(yǎng)箱(150 cm×150 cm×70 cm)中,備用。

1.2 藥品及試劑

四聚乙醛(metaldehyde),MYM USA Corp;二硫蘇糖醇(DTT)、丙基硫脲嘧啶(PTU)、苯甲基磺酰氟(PMSF),美國SIGMA公司;牛血清蛋白(BSA)、考馬斯亮藍(lán)G-250試劑、NADPH、80%H3PO4,廣州威佳;對硝基苯甲醚,麥克林(上海);Tris,MBCHEM;EDTA、KH2PO4、Na2HPO4、NaOH、KCl、NaCl、乙醇、蔗糖、甘油,廣州化學(xué)試劑廠,均為分析純。

乙酰膽堿酯酶(AchE)測試盒(貨號:A024)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)測定試劑盒(貨號:A004)購于南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器

Mettler Toledo AL204電子天平;Neofuge 15R高速冷凍離心機;Eppendorf 5415R離心機;Thermo Multiskan FC酶標(biāo)儀;METASH UV8000S型紫外可見分光光度計;上海精宏DK-8D型電熱恒溫水槽;河南天馳YDS-30L液氮罐;上海SX-611酸度計。

1.4 急性毒性測定

每組取2只健康福壽螺置于體積為8 L的塑料盆中,加脫氯自來水4 L,設(shè)置8重復(fù),以孔徑約0.2 cm×0.2 cm網(wǎng)罩住,防止逃逸。在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上,分別設(shè)置四聚乙醛濃度為0、1.5、3、4.5、6、8、10、12、16 mg/L。試驗期間充氧,不喂食和換水。定期查看,每12 h統(tǒng)計各濃度下的福壽螺死亡率,及時將死亡螺移出水體,試驗進(jìn)行96 h。參考譚曉珍等[19]的研究方法,預(yù)測福壽螺的安全濃度。

參考韓文素等[20]取XLC50值作為亞致死濃度,X的取值應(yīng)考慮實際試驗條件及實驗動物的種類；應(yīng)用魚粉混藥飼喂法處理試驗福壽螺,在0、2、6、12和24 h 時分別取樣;每次取3個福壽螺冰上解剖,每只取少量肝、鰓、腸及腹足組織,相同組織合并,用生理鹽水洗去血污,吸水紙吸去水分,置于液氮罐備用;每次取樣設(shè)置3重復(fù)。

1.5 解毒酶活性測定

MFO測定參照王燕紅[21]的方法并稍作改進(jìn);AchE、GSTs的活性均采用南京建成生物工程研究所的相應(yīng)試劑盒測定。

1.5.1 MFO酶活性測定[21]

酶液制備:分別從液氮罐中取肝臟、鰓、中腸和腹足組織,剪碎混勻后,精確稱量0.05 g,加入1 mL 0.1 mol/L pH 7.8 緩沖液(含 l mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、l mmol/L PTU、l mmol/L PMSF 和 20%甘油),勻漿, 3～6℃,12 000 g 離心 20 min,取上清液用于酶活測定。

MFOO-脫甲基活性測定:配制20 mmol/L對硝基苯甲醚的乙醇溶液,再用預(yù)熱的 0.1 mol/L pH 7.8 的磷酸緩沖液稀釋到2 mmol/L。分別于96孔酶標(biāo)板中依次加入 100 μL 2 mmol/L 對硝基苯甲醚和90 μL 酶制備液,30℃溫育 3 min,加入 10 μL 9.6 mmol/L 的 NADPH(現(xiàn)配現(xiàn)用)開始,反應(yīng)在30℃下進(jìn)行。多功能酶標(biāo)儀在 405 nm 下記錄光密度值,每3 min記錄1次,共記錄15 min。MFO的活力以每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生的對硝基苯酚的量(nmol)表示(nmol p-nitrophenol/min/mg protein)。

1.5.2 AchE和GST酶活性測定

采用南京建成生物工程研究所AchE和GSTs測定試劑盒進(jìn)行測定。按試劑盒說明書制備組織酶液,預(yù)留部分酶液進(jìn)行蛋白含量的測定。AchE活性單位定義為:每毫克組織蛋白在37℃保溫6 min,水解反應(yīng)體系中1 μmol的基質(zhì)為1個活力單位(U);GSTs活性單位定義為:每毫克組織蛋白,在37℃反應(yīng)1 min扣除非酶促反應(yīng),使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個活力單位。

1.6 蛋白質(zhì)含量測定

參考Bradford[22]的方法以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品測定組織酶源蛋白的含量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 19.0的幾率值(probit)分析法對急性攻毒試驗數(shù)據(jù)分析,獲得24、48、96 h半致死濃度LC50,及毒力回歸方程。

熒光定量數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件統(tǒng)計,采用成對數(shù)值的t檢驗(雙尾)和單因素方差分析(ANOVA)檢驗不同組織,不同時間酶活性的差異。并于Excel軟件中作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 四聚乙醛對福壽螺的急性毒性

試驗發(fā)現(xiàn),在用藥初期福壽螺分泌少量黏液,活動能力有所下降;處理6 h時,福壽螺繼續(xù)分泌黏液,腹足部分外露,浮于水面,隨后相繼關(guān)閉厴甲沉于水底,12 h后幾乎無活動。說明四聚乙醛具有顯著促進(jìn)福壽螺黏液分泌、抑制其活動的作用。四聚乙醛對福壽螺24、48、96 h的LC50及毒力回歸方程見表1。四聚乙醛對福壽螺的安全濃度為96 h LC50值的1%,0.039 mg/L;綜合預(yù)試驗中24 h內(nèi)福壽螺死亡及耐受能力的實際情況，本試驗亞致死濃度XLC50的X值取3%，即以0.5 mg/L作為亞致死濃度進(jìn)行后續(xù)試驗[20]。

表1 四聚乙醛對福壽螺的毒力測定結(jié)果

2.2 亞致死濃度四聚乙醛對福壽螺不同組織3種酶活性的影響

采用0.5 mg/L的四聚乙醛分別處理福壽螺0、2、6、12及24 h后,福壽螺肝臟、鰓、腸和腹足組織中的AchE、GSTs及MFO酶活性隨處理時間延長而變化。

未施藥時福壽螺各組織內(nèi)AchE活力有顯著差異(P<0.05),大小關(guān)系為:腸>鰓>腹足>肝。腸AchE活力在用藥之后24 h內(nèi)無顯著變化(圖1)。肝臟中AchE在用藥6 h后迅速下降為正常酶活力的13.2%,然后緩慢上升至正常酶活力的28.2%,并在用藥12～24 h內(nèi)維持此酶活狀態(tài)(圖1)。鰓和腹足AchE活力在藥劑處理24 h內(nèi)均先升高后降低。處理后12 h時,鰓組織內(nèi)AchE活力上升到最大值,為正常酶活力的156.5%,隨后急劇下降; 而腹足內(nèi)AchE活力在處理后6 h時上升至最高,為正常酶活力的148.1%,然后緩慢下降(圖1)。

圖1 0.5 mg/L四聚乙醛處理后福壽螺不同組織乙酰膽堿酯酶活性變化Fig.1 Dynamics of AchE specific activity in different tissues of Pomacea canaliculata treated with 0.5 mg/L metaldehyde

藥劑處理前福壽螺不同組織中GSTs的活性具有顯著差異(P<0.05),酶活力大小依次為肝>鰓>腸>腹足(圖2)。用0.5 mg/L四聚乙醛處理后,肝組織內(nèi)GSTs活力在2 h內(nèi)急劇下降到正常酶活力的64.7%,維持到6 h后繼續(xù)下降至未處理時的49.6%;鰓組織內(nèi)GSTs活力整體呈下降趨勢;腸組織GSTs活力在6 h內(nèi)未呈現(xiàn)劇烈變化,到12 h時急劇下降,24 h時僅為正常酶活的64%;腹足中GSTs活性在6 h內(nèi)緩慢上升至原來的1.222倍,而后急劇下降為處理前的65.8%(圖2)。

圖2 亞致死濃度四聚乙醛下福壽螺谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶活性變化Fig.2 Dynamics of GST specific activity in Pomacea canaliculata treated with metaldehyde at sublethal concentration

藥劑處理前MFO酶活性在福壽螺不同組織中同樣存在顯著差異(P<0.05),從高到低依次為:腸>肝>腹足>鰓(圖3)。用0.5 mg/L的四聚乙醛處理后,腸和肝中MFO活力均呈現(xiàn)緩慢下降趨勢,在24 h時活力分別下降到正?；盍Φ?9.7%、46.2%;腹足內(nèi)MFO 活力先下降,到6 h和12 h時恢復(fù)到處理前水平,到24 h下降至最低,為正常值的36.3%;鰓MFO活力在處理的24 h內(nèi)均顯著低于正常酶活力,變化趨勢為先升高后降低(圖3)。

圖3 亞致死濃度四聚乙醛下福壽螺多功能氧化酶活性變化Fig.3 Dynamics of MFO specific activity in Pomacea canaliculata treated with metaldehyde at sublethal concentration

3 討論

本研究通過急性毒性試驗獲得了處理不同時間后四聚乙醛對福壽螺的LC50,明確了四聚乙醛對福壽螺的毒力與時間的關(guān)系;探討了亞致死濃度的四聚乙醛短期處理對福壽螺AchE、GSTs和MFO活性的影響。

研究認(rèn)為AchE由突觸前膜釋放,降解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿,終止信號對突觸后膜的刺激,以維持正常信號傳遞,且發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)以外部位也存在[23]。在亞致死濃度的脅迫下,乙酰膽堿酯酶活力在福壽螺鰓和腹足內(nèi)先上升后下降,肝臟和腸內(nèi)AchE活力則是先降低再升高。說明四聚乙醛能夠誘導(dǎo)肌肉內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性增加,引起福壽螺突觸內(nèi)乙酰膽堿的降解,阻斷或降低神經(jīng)脈沖的傳導(dǎo)。肌肉組織的麻痹引起消化器官活力下降,從而消化系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶活力降低,使得突觸釋放的乙酰膽堿積累,消化系統(tǒng)功能受損。據(jù)此推測,四聚乙醛脅迫可能導(dǎo)致腹足與鰓組織麻痹以及消化系統(tǒng)損傷從而引起福壽螺進(jìn)入短期休眠狀態(tài)。

四聚乙醛脅迫下,福壽螺機體除肝組織外,鰓、腸和腹足內(nèi)GSTs活性均呈現(xiàn)為“降低—升高—降低”的趨勢。這種時間效應(yīng)與亞致死濃度氟胺氰菊酯對中華蜜蜂AchE活力的影響十分相似,靳三省[24]研究認(rèn)為這種趨勢是由農(nóng)藥在代謝過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物所引起的。GSTs在生物降解代謝第二階段中參與脂溶性有機物的代謝和抵御氧化壓力的脅迫[25]。本研究中四聚乙醛處理初期抑制了福壽螺GSTs活性,但是隨著處理時間延長,可能其次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生誘導(dǎo)了GSTs的表達(dá),從而導(dǎo)致其活性升高[25]。GSTs活力的第二次降低可能是由于隨著處理時間延長而引起機體損傷或福壽螺在受到藥物脅迫作用下進(jìn)入休眠狀態(tài),從而影響酶的活性,具體機制有待進(jìn)一步深入研究。

細(xì)胞色素P450是MFO的重要組分[12],是生物體內(nèi)廣泛存在的一類代謝酶系,種類眾多,起著末端氧化酶的作用[26],在內(nèi)源和外源性物質(zhì)的代謝,尤其是殺蟲劑的代謝中起著重要作用[27]。四聚乙醛處理后福壽螺肝、鰓和腸組織內(nèi)MFO酶活性呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,說明MFO酶很可能也參與了對四聚乙醛的代謝。

本研究表明,福壽螺不同組織中AchE、GSTs和MFO酶的活力存在顯著差異;亞致死濃度的四聚乙醛處理后24 h內(nèi)不同組織中AchE、GSTs和MFO酶活力存在不同變化趨勢,推測對AchE活性的影響可能與其進(jìn)入休眠狀態(tài)有關(guān);而藥物處理對GSTs和MFO的影響說明這兩種酶可能參與了對四聚乙醛的解毒代謝。本試驗只測定短期脅迫下四聚乙醛對AchE、GST和MFO酶活力影響,但這三種酶是否在福壽螺耐藥性中起作用,還需要進(jìn)一步系統(tǒng)研究。

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(責(zé)任編輯:田 喆)

Effects of sublethal dose of metaldehyde on the activities of AchE,GSTs and MFO inPomaceacanaliculata

Zhang Wenling1,2, Mu Xidong1, Wei Hui1, Yang Yexin1, Xu Meng1, Luo Du1, Hu Yinchang1

(1. Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application & Cultivation, Ministry of Agriculture,Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China;2. College of Fisheries and Life Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

To explore the sublethal effect of metaldehyde exposure on main target enzymes and detoxification enzymes inPomaceacanaliculata, the activity dynamics of AchE, GSTs and MFO were measured under sublethal concentrations of metaldehyde. The results showed that metaldehyde could significantly killP.canaliculata, and 96 h LC50and the safe concentration were 3.856 mg/L and 0.039 mg/L, respectively. Under 0.50 mg/L metaldehyde stress, AchE enzyme activity in gills and pleopod increased to 1.565 and 1.481 times as that of the control group, respectively, while the AchE activity in liver and intestine decreased to 0.132 and 0.282 times as that of the control group, respectively, but increased subsequently. GSTs activities were presented as a trend of “decrease-increase-decrease”; MFO activities decreased at the beginning and then were induced to increase to different extents. The results indicated that the activities of AchE, MFO and GSTs were induced to enhance to some extent during metaldehyde metabolism, and MFO and GSTs might play important roles in metaldehyde metabolism.

metaldehyde;Pomaceacanaliculata; sublethal effect; detoxification enzyme

2016-01-26

2016-03-31

國家自然科學(xué)基金(31300468)；農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)入侵防治項目(2130108)

S 482.5

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.008

* 通信作者 E-mail:huyc2@163.com