柑橘綠霉病菌木聚糖酶基因(PdXY 2)功能初步研究

由書妍, 劉紅霞, 于瑞君, 鄭麗君, 范詩言, 李紅葉

(1.大連市農業科學研究院, 大連 116036; 2. 浙江大學生物技術研究所, 杭州 310058)

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柑橘綠霉病菌木聚糖酶基因(PdXY2)功能初步研究

由書妍1, 劉紅霞1, 于瑞君1, 鄭麗君1, 范詩言1, 李紅葉2*

(1.大連市農業科學研究院, 大連 116036; 2. 浙江大學生物技術研究所, 杭州 310058)

柑橘綠霉病菌(Penicilliumdigitatum)是引起柑橘儲藏期腐爛最主要的病原之一,嚴重影響了柑橘產業發展。本試驗克隆了柑橘綠霉病菌的木聚糖酶基因(PdXY2),對其表達進行研究,在柑橘發病過程中,PdXY2的表達顯著升高,至48 h達到最高,其表達量為對照的4倍。為進一步明確PdXY2基因功能,構建了PdXY2基因缺失突變株(ΔPdXY2),ΔPdXY2突變株的致病性與野生型相比沒有明顯差異。由此我們推斷,在柑橘綠霉病菌侵染柑橘的過程中PdXY2有一定的作用,但是單一缺失木聚糖酶PdXY2基因不能影響其致病性。

柑橘綠霉病菌; 木聚糖酶; 基因表達; 基因突變

植物病原菌侵入寄主時必須先破壞寄主的細胞壁,這個過程主要有兩方面作用:一方面破壞寄主的天然屏障,使病原物能侵入寄主,建立侵染關系;另一方面降解的產物能夠為病原物提供營養物質。在細胞壁的降解過程中,細胞壁水解酶起到了重要的作用[1-2]。已有研究表明細胞壁水解酶對致病性至關重要,如在黃曲霉(Aspergillusflavus)中,內切多聚半乳糖醛酸酶突變株對棉鈴的致病性降低[3];在灰葡萄孢(Botrytiscinerea)中,內切多聚半乳糖醛酸酶突變株對番茄的致病性降低[4],果膠甲酯酶突變株對多種作物的致病性均有所下降[5];在稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)中,角質酶突變株對水稻和大麥的致病性下降[6];在膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)中,果膠裂解酶突變株對牛油果的致病性下降[7-8];紫麥角菌(Clavicepspurpurea)中,多聚半乳糖醛酸酶基因突變株對黑麥的致病性下降[9]。因此,研究細胞壁水解酶對探索病原菌的致病性有重要意義。

柑橘是我國最主要的水果之一,而儲藏期柑橘腐爛病對柑橘的經濟效益造成了嚴重的影響,通常造成的損失達到20%～30%,而其中90%以上是由柑橘綠霉病菌(P.digitatum)引起的[10-11]。在柑橘綠霉病菌中,內切多聚半乳糖醛酸酶對致病性有非常重要的作用[12]。為明確柑橘綠霉病菌中其他水解酶的作用,本試驗克隆柑橘綠霉病菌的木聚糖酶基因,并對其表達及功能進行分析,以闡明其在柑橘綠霉病菌致病過程中的作用,增加對柑橘綠霉病菌致病機制的了解。

1 材料與方法

1.1 材料

柑橘綠霉病菌野生型菌株Pd01(CBS 130525)分離于浙江[13],保存于本實驗室;根癌農桿菌AGL-1、大腸桿菌DH5α保存于本實驗室;質粒pTFCM含有T-DNA插入臂序列,其潮霉素基因由構巢曲霉強啟動子PtrpC啟動,由強終止子TtrpC終止,保存于本實驗室;Real-time RT-PCR采用7300 real-time PCR系統;本試驗使用到的引物見表1,由上海桑尼公司合成。

表1 試驗中使用的引物

1.2 方法

1.2.1 柑橘綠霉病菌木聚糖酶PdXY2基因克隆

根據基因組信息設計擴增木聚糖酶基因的引物PdXY2-F和PdXY2-R(表1),以柑橘綠霉病菌野生型Pd01基因組DNA為模板擴增PdXY2基因的片段,PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后,利用AxyPrepTMDNA Gel Extration Kit (Axygen,杭州)回收目的條帶,將目的片段連接到克隆載體pMD18-T(TaKaRa,大連)上并送到Invitrogen公司進行測序。

1.2.2 柑橘綠霉病菌PdXY2在侵染過程中的表達分析

從市場上購買成熟溫州蜜柑(Citrusnobilis),經0.1%次氯酸浸泡5～10 min后吹干待用;用無菌水洗脫PDA培養基上培養7 d的野生型菌株Pd01孢子,并將孢子稀釋到1.0×106個/mL,取3 μL孢子懸浮液接種于柑橘果實的傷口上(用針簇在果皮上刺1～2 mm深的傷口),25℃保濕培養,分別在接種后間隔12 h提取發病組織的總RNA(Xygen),并反轉錄成cDNA(TaKaRa),使用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa)進行real-time RT-PCR,用PdXY2-qF與PdXY2-qR引物擴增木聚糖酶基因,以γ-Actin基因(GenBank登錄號:AB030227)作為內參,Actin-qF和Actin-qR引物擴增內參基因,相對表達量的計算方法參考文獻[14]。

1.2.3 柑橘綠霉病菌PdXY2突變體構建

采用同源重組原理構建PdXY2基因敲除質粒,基本過程如圖1:以柑橘綠霉病菌野生型菌株Pd01的基因組DNA為模板,用引物PdXY2D(含XhoI酶切位點)和PdXY2C(含SpeI酶切位點)擴增PdXY2基因3′端側翼0.75 kb的序列,產物用限制性內切酶XhoI和SpeI消化后連接到質粒pTFCM的hph的3′端;用引物PdXY2B(含SacI酶切位點)和PdXY2A(含KpnI酶切位點)擴增PdXY2基因5′端側翼0.82 kb的序列,產物用限制性內切酶SacI和KpnI消化回收后連接到質粒pTFCM中hph基因的5′端。PCR鑒定選擇成功連接的單菌體,堿法小量抽提質粒,得到新的質粒pTFCM-XY2,將質粒電擊到農桿菌AGL-1中。

圖1 PdXY2功能缺失突變株的構建Fig.1 Construction of PdXY2 knock-out mutant

1.2.4 柑橘綠霉病菌轉化及轉化子的分析

農桿菌轉化的方法參考文獻[15]。挑取含有潮霉素抗性的單菌落轉入含有潮霉素的PDB培養基中,28℃培養5 d后取部分菌絲提取基因組DNA,用引物PdXY2jd-F和PdXY2jd-R進行PCR鑒定。利用Southern雜交分析PdXY2基因缺失突變株中外源插入潮霉素抗性基因的拷貝數,其步驟是用限制性內切酶HindⅢ消化野生型Pd01和ΔPdXY2的基因組DNA 10 μg,在37℃的水浴條件下酶切24 h,將經過酶切處理后的基因組DNA在1%瓊脂糖凝膠中電泳12 h(電壓20 V),將電泳后的基因組DNA經毛細管法轉移到尼龍膜(Millipore)上,再以地高辛標記的潮霉素基因片段為探針,用DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit II(Roche)試劑盒進行雜交,具體的操作方法詳見使用說明書。

1.2.5 ΔPdXY2突變株菌絲生長及產孢能力

野生型Pd01和ΔPdXY2的菌碟制作方法見文獻[16],將菌碟放在PDA中培養7 d后測量菌落直徑,并用無菌水或者5%吐溫洗脫孢子,將孢子稀釋后用血球計數板計數孢子量,每次試驗3個重復,整個試驗重復3次。

1.2.6 ΔPdXY2突變株致病性分析

柑橘準備方法同上,在PDA培養基上培養野生型菌株Pd01和ΔPdXY2突變株7 d,再用無菌水洗脫孢子并稀釋到1.0×106個/mL,接種方法同上,25℃保濕培養,觀察發病情況,每個菌株接種約20～30個果實,整個試驗重復3次以上。

2 結果與分析

2.1PdXY2基因的克隆

利用引物PdXY2-F和PdXY2-R擴增柑橘綠霉病菌的基因組,得到一條2 611 bp的核苷酸序列,將該序列在NCBI官方網站上進行比對,發現與其他物種的木聚糖酶基因具有較高的一致性;根據轉錄組數據測序該基因cDNA全長651 bp,含有1個大小為58 bp的內含子,能夠編碼出含有216個氨基酸的多肽,在NCBI中登錄PdXY2基因序列,登錄號為JX495171。

2.2 PdXY2蛋白分析

將柑橘綠霉病菌PdXY2編碼的蛋白在NCBI進行BLAST,結果表明該蛋白與其他絲狀真菌中水解酶/內切木聚糖酶有較高的一致性(圖2),與Ophiostomapiliferum中內切木聚糖酶(AFR33048)的一致性為91%,與Penicilliumcamemberti中糖苷水解酶(CRL24571)的一致性為90%,與Penicilliumcanescens內切木聚糖酶(ACP27610)的一致性為81%。

圖2 PdXY2蛋白與其他同源蛋白比較Fig.2 Comparison of PdXY2 with other homologous proteins

2.3PdXY2重組轉化子的分析

將獲得的轉化子進行PCR鑒定,結果(圖3a)表明,在野生型Pd01中擴增出了一條1.4 kb的條帶,而在重組突變株中擴增出一條2.4 kb的條帶(2 kb潮霉素抗性基因取代了PdXY2基因及其啟動子區1 kb片段)。取其中一個轉化子(ΔPdXY2A)進行Southern雜交鑒定,結果如圖3b所示,在野生型中潮霉素標記的探針沒有雜交出條帶,而在ΔPdXY2突變株中則會出現一條約4.5 kb的條帶,結果表明獲得的重組突變株只有一條潮霉素基因序列,不存在異位插入,可以進行后續研究。

圖3 ΔPdXY2突變株的PCR鑒定結果(a)和Southern鑒定結果(b)Fig.3 Identification of PdXY2-disrupted mutant by PCR (a)and Southern blot (b)

2.4PdXY2基因的表達分析

在接種柑橘的發病過程中,PdXY2基因的表達情況如圖4所示,侵染初期,PdXY2基因的相對表達量呈現出一個升高趨勢,在接種后48 h達到高峰,此時的相對表達量為對照的4倍,隨后其表達量逐漸下降,至84 h與對照差異不大,可見在侵染過程中,PdXY2基因表現出了先升高后下降的趨勢。

圖4 在侵染柑橘過程中PdXY2的表達Fig.4 Expression of PdXY2 during infection

2.5 ΔPdXY2突變株生長及產孢分析

菌絲生長試驗結果表明,ΔPdXY2突變株與野生型菌株生長速度相似,生長速率均為1.0～1.2 cm/d。產孢試驗結果顯示,ΔPdXY2突變株與野生型菌株的產孢量相似,在PDA平板上培養7 d后其孢子量均可達到1×108,因此,ΔPdXY2突變株與野生型菌株在菌落生長和產孢方面沒有明顯差異。

2.6 ΔPdXY2突變株致病性分析

致病性試驗結果(圖5)顯示,ΔPdXY2突變株能夠侵染柑橘果實,接種后培養24 h,ΔPdXY2和野生型Pd01均出現了腐爛,且病斑擴展速度差異不大,由此可見,ΔPdXY2突變株對柑橘綠霉病菌的致病性與野生型相比沒有明顯差異。

圖5 野生型(WT)與ΔPdXY2突變株接種84 h后發病情況Fig.5 Virulence of the wild type (WT) and ΔPdXY2 mutant after 84 h of incubation

3 討論

柑橘綠霉病菌是造成柑橘采后腐爛的最主要病原,對柑橘產業造成了嚴重的損失,為了增加對柑橘綠霉病菌致病分子機制的了解,本研究對柑橘綠霉病菌中的木聚糖酶基因(PdXY2)進行研究,表達分析表明PdXY2在侵染柑橘的過程中明顯升高,可能起到一定的作用。ΔPdXY2突變株的致病性與野生型相比沒有明顯的差異,可見單一突變PdXY2基因對柑橘綠霉病菌的致病性影響不大,可能與其他同源基因相關。細胞壁水解酶含有很多同源基因,很多單一水解酶功能缺失不會引起致病性的下降[17-18]。如在赤球叢赤殼(Nectriahaematococca)中,雙突變果膠裂解酶A基因和果膠裂解酶D基因能夠降低致病性,然而單一突變其中任何一個基因都對致病性沒有影響[19];內切多聚半乳糖醛酸酶對柑橘鏈格孢(Alternariacitri)引起的柑橘黑腐病致病性有影響,但是對鏈格孢(A.alternata)引起的褐斑病沒有影響[20];在稻瘟病菌(M.oryzae)中,突變內切木聚糖酶對致病性沒有影響[21];在尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)中,突變外切多聚半乳糖醛酸酶對致病性沒有影響[22];在玉米圓斑病菌(Cochlioboluscarbonum)中,雙突變胞外多聚半乳糖醛酸酶可導致酶活下降,但是致病性與野生型差異不大[23]。此外還有一些報道也同樣表明單一的突變對致病性沒有影響[24-26]。

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(責任編輯:田 喆)

Preliminary study on the function of PdXY2 in Penicillium digitatum

You Shuyan1, Liu Hongxia1, Yu Ruijun1, Zheng Lijun1, Fan Shiyan1, Li Hongye2

(1. Dalian Academy of Agricultural Sciences, Dalian 116036, China;2. Institute of Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

Penicilliumdigitatumis one of the most important pathogen causing green mold disease which impedes the development of citrus industry. In this study, we cloned a xylanase genePdXY2 and characterized its functions via knock-out strategy. The expression ofPdXY2 was up-regulated during the primary stage of infection, and reached a peak at 48 h. However,PdXY2-disrupted mutant (ΔPdXY2) showed no reduction in virulence. Taken together, our results demonstrated thatPdXY2 may play an important role in infection and single knock-out ofPdXY2 showed no reduction in virulence.

Penicilliumdigitatum; Xylanase; gene expression; gene disruption

2015-12-24

2016-02-24

國家自然科學基金(31371961); 國家現代農業產業技術體系(CARS-27)

S 436.66

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.016

* 通信作者 E-mail:hyli@zju.edu.cn