北京市及河北省小麥赤霉病菌群體遺傳結構及生物學特性

董 杰, 張金良, 楊建國, 張 昊, 馮 潔

(1. 北京市植物保護站, 北京 100029; 2. 中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

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調查研究

北京市及河北省小麥赤霉病菌群體遺傳結構及生物學特性

董 杰1*, 張金良1, 楊建國1, 張 昊2, 馮 潔2

(1. 北京市植物保護站, 北京 100029; 2. 中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

本文分析了北京市與河北省小麥赤霉病菌群體遺傳結構以及基礎生物學特性。結果表明所有菌株均為禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum),屬于一個大的單一群體,群體內具有較高的遺傳多樣性。毒素化學型測定表明,北京與河北地區小麥真菌毒素污染的主要風險為DON與15ADON毒素。表型測定顯示,與F.asiaticum群體相比,F.graminearum具有較高的產孢能力,而生長速率和產毒能力較低。該群體對主要殺菌劑多菌靈、戊唑醇和氰烯菌酯均無抗藥性。

小麥赤霉病; 禾谷鐮刀菌; 群體遺傳結構; 殺菌劑抗性

由禾谷鐮刀菌復合種(Fusariumgraminearumspecies complex, FGSC)引起的小麥赤霉病是世界范圍內的重要病害[1],已經被國際玉米小麥改良中心(CIMMYT)確定為限制小麥產量的一個主要因素[2]。除了引起小麥產量損失外,鐮刀菌還能夠產生多種真菌毒素,造成食品安全上的重大隱患。近十年來,小麥赤霉病在我國頻繁暴發,特別是2012年,發病面積達1 000萬hm2,約占全國小麥總面積的50%。在我國,長江中下游地區如江蘇、安徽、湖北等省份是小麥赤霉病的傳統流行區[3],但是由于氣候變化及耕作制度改變等因素的影響,赤霉病北移十分明顯。北部黃河流域省份原來只有零星發生,但近幾年河北南部、河南、山東、山西、陜西南部也相繼發生較為嚴重的小麥赤霉病。

2004年,O’Donnell等采用宗系譜法創建了禾谷鐮刀菌新的分類框架,認為傳統的禾谷鐮刀菌是一個至少包含有9個獨立種的復合種[4]。隨后,又不斷有新種被發現,目前禾谷鐮刀菌復合種共包含15個種[5]。這一分類體系也被世界各國研究者廣泛接受。Zhang等[6]對中國小麥赤霉菌的群體遺傳結構進行了大范圍的研究,確定中國南北方優勢群體分別為F.asiaticum和F.graminearum,其中F.asiaticum具有明顯的群體分化,產3ADON毒素的菌株為優勢群體,正在由東向西取代NIV群體；而北方各省份的F.graminearum并沒有明顯的群體分化,屬于一個大的隨機交配群體。與之相似,近年來多個國家相繼報道了赤霉菌群體在種和毒素化學型水平上的更替事件,如荷蘭F.graminearum取代F.culmorum[7]；加拿大3ADON型的F.graminearum取代15ADON群體[8]；美國路易斯安那州NIV型F.asiaticum群體的發現[9]等。這些事件說明全球貿易快速發展以及氣候、耕作制度的改變容易造成新群體的入侵和擴張,從而使病害的發生發展規律產生新的特點,毒素污染的種類與程度也會發生相應的變化。因此,對赤霉菌群體結構及基本生物學特性進行持續監測是進行有效防治的前提。中國小麥赤霉菌群體學研究多集中在長江流域,北部省份僅有少量報道。Zhang等[6]和Shen等[10]對2008-2010年中國北方部分省份的小麥赤霉菌進行鑒定,發現所有菌株均為產生15ADON毒素的F.graminearum。北美洲的研究表明,相對于15ADON,產3ADON的F.graminearum群體毒性更強,并在北美迅速擴張[8]。我國北方省份近些年赤霉菌群體組成是否發生變化,是否有高風險的3ADON群體傳入尚不清楚。本文對河北省和北京市2015年小麥赤霉病菌進行了種和毒素化學型的鑒定,并測定了生長速率、產孢量、產毒量以及對主要殺菌劑的抗性水平,分析了本地區赤霉病菌群體結構,解析了其生態適應性,為制定適應本地區的小麥赤霉病的綜合防控措施提供理論依據,同時可為整個食品安全生產鏈條中的政府決策提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種收集

河北省與北京市小麥赤霉病樣品采集于2015年5月,具體采集地信息如表1,采用張昊等[11]報道的方法進行單孢分離。每個病穗保存一株鐮刀菌,共分離鐮刀菌60株。采用安徽省采集的10株F.asiaticum菌株作為生物學特性鑒定的對照。

表1 菌種信息表

1.2 種的鑒定

種的鑒定采用TEF-1α基因測序鑒定法[12],擴增引物為EF1: 3′-ATGGGTAAGGA(A/G)GA CAAGAC-5′; EF2: 3′-GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT-5′,擴增產物約700 bp,由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,序列提交FUSARIUM ID或GenBank數據庫進行BLASTn比對,種鑒定閾值設為核苷酸一致性99%。采用MEGA 5.0軟件MP法構建系統發育樹進行驗證。基因多樣性相關參數由DnaSP軟件計算。

1.3 毒素化學型的鑒定

毒素化學型采用基于毒素合成基因Tri3的引物組合進行多重PCR鑒定[8],共包含4條引物,3CON: 3′-TGGCAAAGACTGGTTCAC-5′; 3NA: 3′-GTGCACAGAATATACGAGC-5′; 3D15A: 3′-ACTGACCCAAGCTGCCATC-5′; 3D3A: 3′-CGCATTGGCTAACACATG-5′。其中NIV、15ADON和3ADON 毒素化學型的特征條帶分別為840、610和243 bp。

1.4 菌絲生長速率測定

將菌株接種于PDA培養基,28℃培養3 d后,在靠近生長邊緣打取6 mm菌餅,接種于新的PDA培養基中央,每個菌株3個重復,28℃避光培養,在24 h和72 h分別在菌落邊緣標記4個不同的點,測量24～72 h之間的菌落生長長度,計算生長速率。

1.5 分生孢子產量測定

將一個6 mm菌餅放入盛有2 mL綠豆湯培養基的15 mL離心管,30°傾斜放入搖床,恒溫28℃、220 r/min振蕩培養10 d。采用DM4000B顯微鏡的計數模塊測定分生孢子濃度,每個菌株3次重復。

1.6 毒素產量測定

各菌株毒素產量采用液相色譜-質譜聯用法進行測定,色譜條件參照Suga等[13]的報道。NIV、15ADON和3ADON 毒素標準品購自Sigma。首先,將菌株接種于PDA培養基,28℃培養3 d,用6 mm打孔器在菌落生長邊緣打取5個菌餅,均勻接種于大米培養基中,每個菌株3次重復,以不加病原菌的三角瓶做對照,前3天每天輕輕晃動1次,25～27℃避光培養7 d。將三角瓶放入烘箱60℃過夜烘干,放入A11研磨儀研磨30 s,取10 g放入80 mL乙腈/水(80∶20,v/v),120 r/min振蕩1 h,采用Whatman No.4濾紙過濾,取2 mL濾液過Bond Elut單端孢霉烯族毒素SPE固相萃取柱,再取1 mL濾液過0.22 μm過濾器,裝入Agilent 2 mL進樣瓶,上機檢測。

1.7 對主要殺菌劑敏感性的測定

選用3種常用殺菌劑：多菌靈(carbendazim)、戊唑醇(tebuconazole)、氰烯菌酯(phenamacril)進行藥劑敏感性測定。97.5%多菌靈原藥(沈陽化工股份有限公司),95.5%戊唑醇原藥(中國農業大學種子病理藥理實驗室提供),91.2%氰烯菌酯原藥(浙江大學提供)用二甲基亞砜(DMSO)配制成1×104μg/mL母液備用。分別配制含有殺菌劑濃度為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μg/mL的PDA平板。將供試菌種在不含藥PDA平板上培養3 d,在菌落邊緣的同一圓周上用打孔器打取直徑為5 mm的菌餅,菌絲面朝下接種于含藥培養基中央,每處理3次重復,置于25℃培養箱內黑暗培養,待對照菌落接近培養皿邊緣時測定各處理菌落直徑,計算各殺菌劑的有效抑制中濃度EC50。

2 結果與分析

2.1 種和毒素化學型的鑒定結果

將測序結果與FUSARIUM ID和GenBank數據庫進行比對分析,結果顯示所有60株菌均為禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)。系統發育分析也顯示這60株菌與標準參照菌株F.graminearumNRRL6394(AF212456)和NRRL29169(AF212461)聚合在同一分支,而與F.asiaticum參照菌株NRRL6101(AF212450)和NRRL13818(AF212451)有明顯的分化(圖1)。對TEF-1α基因多樣性進一步分析,各地區檢測到的單倍型為4～6個,單倍型多態性(hd)和位點平均差異數量(π)分別為0.553～0.765和0.002 08～0.003 62,說明均具有較高的多態性水平。中性選擇參數Tajima’sD值均不顯著。具體多樣性信息見表2。

毒素化學型的鑒定結果顯示,所有菌株均產生610 bp的特異性條帶,說明這些地區的禾谷鐮刀菌的優勢產毒化學型為15ADON。

圖1 基于TEF-1α基因的小麥赤霉病菌系統發育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of Fusarium strains from wheat based on TEF-1α gene

群體PopulationnShPiAhdπD河北省館陶縣Guantao，Hebei125640．7650．00362-0．927河北省南和縣Nanhe，Hebei183430．5530．00208-1．129北京市房山區Fangshan，Beijing147440．6420．00222-0．071北京市通州區Tongzhou，Beijing165530．6830．00219-0．698

1)n: 群體數量;S: 多態位點數量;h: 單倍型數量;PiA:簡約性信息位點數量;hd: 單倍型多態性;π: 位點平均差異數量;D:D值檢驗。

n: Sample size;S: Number of segregating sites;h: Number of haplotypes;PiA: Number of parsimony informative site between alleles;hd: Haplotypic diversity;π: Average number of differences per site;D: Tajima’sD.

2.2 菌絲生長速率測定結果

菌絲生長速率測定結果顯示,北京市及河北省F.graminearum群體的平均生長速率為8.04～8.50 mm/d,4個群體間無明顯差異(表3)。而對照組F.asiaticum群體的平均生長速率為(9.03±0.42) mm/d,生長速率明顯快于F.graminearum群體(P<0.05)。

2.3 分生孢子產量測定結果

測定結果顯示,北京市及河北省F.graminearum群體的平均分生孢子產量為30.45×104～35.60×104個/mL,4個群體間無明顯差異(表3)。但顯著高于對照組F.asiaticum群體(19.95×104個/mL,P<0.05)。

2.4 禾谷鐮刀菌群體毒素產量測定結果

毒素測定結果顯示,各菌株之間毒素產量差異顯著,但4個F.graminearum群體間DON毒素及15ADON衍生物的產量無顯著差異。對照組F.asiaticum群體DON毒素產量與F.graminearum群體間無顯著差異,但3ADON毒素的量顯著高于15ADON毒素(表3)。因此,F.asiaticum群體總單端孢霉烯族毒素(trichothecene)的量顯著高于F.graminearum群體(P<0.05)。

表3 菌株生長速率、產孢量及毒素產量1)

1) 每列數據后不同字母表示在0.05水平有顯著差異。

Values followed by different letters in the same column are significantly different atP<0.05.

2.5 禾谷鐮刀菌群體對殺菌劑的敏感性

對3種主要殺菌劑抗性的測定結果顯示,北京市和河北省采集的所有菌株均為敏感型菌株,沒有發現抗性菌株存在。河北與北京的群體對3種殺菌劑抗性水平相似,其EC50均無顯著差異。對照組F.asiaticum群體對多菌靈的EC50顯著高于北京與河北F.graminearum群體(P<0.05)。而對戊唑醇與氰烯菌酯的抗性水平,F.asiaticum與F.graminearum群體間無顯著差異。總體來看,氰烯菌酯的EC50范圍和平均值最低,其次為戊唑醇,多菌靈最高(表4)。

表4 禾谷鐮刀菌群體對多菌靈、戊唑醇與氰烯菌酯的抗性1)

1) 同行數據后不同字母表示在0.05水平差異顯著。

Data followed by different letters in the same row are significantly different at 0.05 level.

3 討論

小麥赤霉病是世界范圍內的重要病害,嚴重威脅小麥的安全生產。目前已知至少有20余種鐮刀菌可以引起小麥赤霉病,并且在各大洲表現出明顯不同的區域分布特征。如:F.graminearum分布最為廣泛,在各國均有分布,在北美洲、歐洲及東亞北部為優勢種;F.asiaticum主要分布在亞洲,特別是東亞地區;F.boothii和F.meridionale在南美洲和亞洲的尼泊爾分布較多,而非洲的鐮刀菌分布則更為復雜,種類也更多[14]。同時,近年來,隨著氣候及耕作制度變化,病原菌的生存環境也發生不同程度的改變。同時全球貿易一體化的發展,使病原菌隨著農產品貿易在地區之間傳播。這些都促使病原菌群體本身進行協同進化以適應環境,從而造成了病原菌群體結構的不斷變化,如Waalwijk等發現并首先報道了在歐洲北部曾經的優勢種黃色鐮刀菌(F.culmorum)被禾谷鐮刀菌(F.graminearum)所取代[7]。隨后,多個國家發現了相同趨勢[15-16]。在中國小麥赤霉病的主要流行區長江流域同樣發現了3ADON型F.asiaticum群體具有取代NIV群體的趨勢[6]。而在中國北方小麥產區,長期以來小麥赤霉病僅零星發生,因此對病原菌群體的系統性研究較少,特別是北京市小麥赤霉病菌群體組成未見報道。但近十年來,中國小麥赤霉病北移十分明顯,在河北南部、山東、河南省份頻繁發生。因此,監測北方麥區赤霉菌群體結構具有重要意義。

本研究表明,2015年收集的北京市與河北省赤霉病菌均屬于產15ADON化學型毒素的F.graminearum群體，與Zhang等[6]對中國北方小麥赤霉菌是一個大的隨機交配群體的推測一致。TEF-1α基因多樣性分析表明,同一采樣點的赤霉病菌群體內仍然存在較高的遺傳多樣性水平,表明群體內存在著頻繁的遺傳重組,這有利于赤霉菌對環境變化的快速適應以及新群體的形成。Ward等[8]發現,在加拿大3ADON型F.graminearum群體近十幾年間逐漸由東向西擴張,取代原有的15ADON群體。并且表型測定顯示,3ADON群體具有更強的致病力及產毒能力,因此是一個高風險群體。本研究并未在河北與北京檢測到3ADON型F.graminearum菌株,說明這一群體尚未傳入我國,應該加強監測,防止其傳入我國北方地區,造成更大的危害。

生長速率和孢子產量是鐮刀菌重要的生物學特性,對于其完成侵染十分重要。河北省和北京市各群體生長速率與分生孢子產量均無顯著差異,這與種和毒素化學型的鑒定結果一致,證明其屬于一個大的單一群體。對照組F.asiaticum群體的生長速率顯著高于F.graminearum群體,而分生孢子產量則明顯較低。這可能與兩個種所處的環境不同有關,相對于長江流域的高溫高濕環境,北方地區氣候干燥,不利于菌絲生長,F.graminearum群體通過產生更多的孢子完成侵染。雖然一般認為赤霉病菌通過子囊孢子完成初侵染,但在許多地區,特別是北方玉米-小麥輪作區,在田間植物殘體上并沒有發現大規模的子囊殼存在。因此,分生孢子也可能是其重要的侵染源。DON毒素在鐮刀菌侵染小麥的過程中發揮著重要作用[17]。毒素測定結果顯示,不同菌株之間毒素產量有顯著差異,但北京與河北各F.graminearum群體之間的毒素產量無明顯差異。而對照組F.asiaticum群體雖然DON毒素產量與各群體間也無顯著差異,但其3ADON產量明顯較F.graminearum群體的15ADON高。鐮刀菌通過將過量的DON毒素乙酰化來降低毒性,減輕對自身的危害。因此,乙酰化毒素的高產量也說明這一群體的高產毒能力。

目前,小麥赤霉病主要依靠化學防治。監測病原菌群體對主要殺菌劑的抗性水平對于指導合理用藥十分重要。本研究結果表明,F.graminearum群體中未發現3種殺菌劑的抗性菌株,并且各群體之間抗性水平無顯著差異,這與北方地區較少用殺菌劑進行防治有關。長江流域省份采用多菌靈防治小麥赤霉病已有30多年的歷史,本研究也發現多菌靈對安徽省F.asiaticum群體的有效抑制中濃度顯著高于其他群體。對3種主要殺菌劑進行對比表明,氰烯菌酯對禾谷鐮刀菌的有效濃度最低,用藥量最少,EC50僅為多菌靈的1/3。多菌靈的EC50最高。實際應用中,由于并沒有檢測到抗藥群體存在,3種殺菌劑在北京市和河北省都會有較好的防效。目前多菌靈和氰烯菌酯對禾谷鐮刀菌作用機制已經明確,作用位點為單一靶標,產生抗藥性的風險較大。因此在實際應用中,要注意藥劑輪換使用。

綜上所述,本研究首次明確了北京市小麥赤霉菌的組成,發現群體內存在豐富的遺傳多樣性,并證實其與河北省菌株同屬一個大的單一群體。毒素化學型結果表明,北京與河北地區小麥真菌毒素污染的主要風險為DON與15ADON毒素。同時,多菌靈、戊唑醇與氰烯菌酯在這一地區均具有較好防效。研究結果為制定小麥赤霉病綜合防控策略、減輕毒素污染提供了重要理論依據。

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(責任編輯:楊明麗)

Population genetic structure and biological characteristics of Fusariumgraminearumon wheat in Beijing and Hebei

Dong Jie1, Zhang Jinliang1, Yang Jianguo1, Zhang Hao2, Feng Jie2

(1.Beijing Plant Protection Station, Beijing 100029, China; 2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

In this study, the genetic diversity and several phenotypes of the pathogens ofFusariumhead blight on wheat in Beijing and Hebei were analyzed. All isolates wereFusariumgraminearum, belonging to one random mating population. High level of genetic diversity within population was observed. The determination of trichothecene chemotype showed that DON and 15ADON were the main threats to wheat production in this area. Comparing toF.asiaticum,F.graminearumpopulation revealed higher conidial production, lower growth rate and trichothecene production. No resistant isolates to carbendazim, tebuconazole and phenamacril were identified.

Fusariumhead blight;Fusariumgraminearum; population genetic structure; fungicide resistance

Investigations

2015-11-16

2015-12-14

2015年北京市創新團隊糧經作物團隊崗位專家項目；國家國際科技合作專項(2013DFG31930); 國家自然科學基金(31201477)

S 435.121

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.021

* 通信作者 E-mail：dongjiefine@126.com