北京平谷區蘋果銹果類病毒檢測初報

邢 飛, 張志想, 陳 策, 王紅清, 李世訪*

(1.中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193;2. 中國農業大學園藝學院, 北京 100193)

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北京平谷區蘋果銹果類病毒檢測初報

邢 飛1,2, 張志想1, 陳 策1, 王紅清2, 李世訪1*

(1.中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193;2. 中國農業大學園藝學院, 北京 100193)

采集北京市平谷區‘中秋王’、‘寒富’蘋果葉片樣品共12份,以Northern雜交、RT-PCR方法檢測蘋果銹果類病毒(Applescarskinviroid, ASSVd)帶毒情況。結果表明,表現明顯銹果癥狀的‘中秋王’樣品均檢出ASSVd,無明顯癥狀的‘中秋王’樣品沒有檢出ASSVd,而無明顯癥狀的‘寒富’樣品全部攜帶ASSVd。測序發現,所得序列與NCBI中已報道的ASSVd基因組序列相似性為91%～99%,且兩品種中ASSVd主流序列完全相同。結果說明‘中秋王’對ASSVd較為敏感,感病后易于表現出明顯的銹果癥狀;‘寒富’對ASSVd耐性較強,感病后不表現出明顯癥狀。

蘋果銹果病; 蘋果銹果類病毒; 品種

蘋果銹果病是我國蘋果生產中的重要病害,其病原為蘋果銹果類病毒(Appleskinscarviroid,ASSVd)。ASSVd屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科(Pospiviroidae),一般包含329～331個核苷酸,具有中央保守區但沒有核酶活性,在細胞核內進行非對稱式滾環復制[1-2]。ASSVd可系統侵染包括蘋果[3]、梨[4]、櫻桃[5]等在內的多種果樹,一旦侵染,果樹將終生帶毒,給產業發展造成嚴重的經濟損失。ASSVd侵染蘋果后通常表現銹果型、花臉型、銹果-花臉混合型、環斑型和綠點型等癥狀[6-7]。該類病毒主要通過帶毒苗木或接穗、修剪工具等方式傳播,尚無蟲媒傳播該病毒的報道[1, 7-8]。由于類病毒不編碼任何蛋白質,故無法通過血清學方法檢測ASSVd。目前,ASSVd的檢測方法主要有生物學鑒定和分子生物學檢測。其中,生物學鑒定耗時長、特異性較差、工作量較大;而分子生物學具有較高的靈敏度、特異性強、檢測迅速,可用于大量樣品的檢測,主要包括核酸分子雜交技術、聚合酶鏈式反應等[9]。

北京平谷區蘋果栽培面積逐年擴大,成為帶動地區經濟發展的支柱產業之一。近年來,該區一些果園蘋果銹果病發生嚴重,使得果實產量和品質大幅下降,經濟效益受到影響。為此,我們初步調查了一蘋果銹果病發生嚴重的果園,采集樣品后利用分子生物學手段進行檢測,旨在為田間蘋果生產栽培提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

2015年7-8月,在北京平谷區山東莊鎮平谷區果品產業協會實驗示范基地一蘋果園分別從12株12年生的蘋果樹上隨機采集果實表現明顯銹果的‘中秋王’葉片及不表現明顯癥狀的‘中秋王’和‘寒富’葉片樣品,共計12份。其中,‘中秋王’樣品3份表現銹果癥狀,2份無明顯癥狀;‘寒富’樣品7份均無明顯癥狀。蘋果栽培南北走向, 1 m×3 m株行距密植栽培,籬壁式修剪。

1.2 總RNA提取及反轉錄

葉片總RNA提取參考Zhang等[10]的方法。反轉錄體系如下：5×M-MLV buffer 4 μL,10 mmol/L dNTPs 1 μL,10 μmol/L random primer 0.5 μL,10 μmol/L oligodT 0.5 μL,RNase inhibitor 0.5 μL,M-MLV reverse transcriptase 0.5 μL,總RNA 2 μL,補充DEPC 處理H2O至20 μL。42℃反應1 h,取出冰上放置5 min后,直接用于PCR反應模板或貯存于-20℃備用。

1.3 Northern雜交檢測

使用1×MOPS緩沖液制備含1.1%甲醛的1.5%的瓊脂糖凝膠,并把15 μL RNA原液與2 μL 10×loading buffer混合液加入點樣孔,100 V恒壓電泳,直至溴酚藍條帶遷移到凝膠中部,停止電泳,用真空轉印儀轉膜30 min,紫外交聯固定。預雜交、雜交及顯色反應按地高辛標記檢測試劑盒(Roche)說明書進行。雜交所用陰性和陽性對照分別為本實驗室前期提取的蘋果葉片健康樣品和ASSVd感病樣品的總RNA。

1.4 PCR檢測

PCR擴增體系：2×pfuPCR mix 12.5 μL,10 μmol/L上游引物(5′-CCGGTGAGAAAGGAGCTGCCAGCA-3′)0.5 μL,10 μmol/L下游引物(5′-CCTTCGTCGACGACGACAGGTGAGT-3′)0.5 μL,cDNA模板1.5 μL,補水至25 μL。反應程序：94℃預變性4 min;94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環;72℃再延伸10 min。

1.5 PCR產物回收及克隆

PCR產物回收：PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后,紫外燈下快速切膠、回收。回收步驟參照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(康寧生命科學有限公司)說明書進行。

克隆：參照零背景pTOPO-Blunt平末端克隆試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)說明書進行。PCR產物經膠回收后連接到pTOPO-Blunt載體上,并轉化DH5α感受態細胞,37℃過夜培養,挑選單克隆培養后進行菌液PCR鑒定,并把陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

2 結果與分析

2.1 田間調查

調查發現,該果園主栽蘋果品種以‘中秋王’和‘寒富’為主,接穗由山西、河北、吉林等地引進。在表現蘋果銹果病癥狀的品種中,以‘中秋王’最為突出,其果面銹果癥狀嚴重,并伴隨明顯裂果癥狀(圖1a～b,封面)。‘中秋王’接穗2003年引進時無明顯癥狀,2012年始有蘋果銹果癥狀,2015年大發生。初步調查了160株‘中秋王’蘋果樹,其中有40株的果實表現銹果癥狀。不同的是,同一果園鄰近栽培的‘寒富’果實表面并無明顯銹果癥狀(圖1c)。

圖1 平谷蘋果果實癥狀Fig.1 Symptoms of apple fruits in an orchard of Pinggu District

2.2 Northern雜交和RT-PCR檢測ASSVd

Northern雜交結果顯示(圖2a),表現銹果癥狀的‘中秋王’葉片(1、2、12)中均呈ASSVd陽性,無明顯癥狀樣品(3、11)則沒有檢測到ASSVd。在不表現明顯癥狀的‘寒富’樣品(4～10)中均能檢測到ASSVd,且檢出率高達100%。

為進一步對上述結果加以確認,利用靈敏度更高的RT-PCR方法檢測樣品中ASSVd。結果顯示(圖2b),在表現銹果癥狀的‘中秋王’樣品(1、2、12)和無明顯癥狀的‘寒富’樣品(4～10)中均檢測到ASSVd,無明顯癥狀的‘中秋王’樣品中ASSVd檢測呈陰性(3、11),結果同Northern雜交結果一致。說明對于樣品的ASSVd檢測結果較為可信。

2.3 ASSVd序列測定及 RNA二級結構預測分析

對ASSVd陽性樣品1(‘中秋王’)和5(‘寒富’)分別測得4個單克隆序列,結果表明,所得序列全長為331 bp,與NCBI中已登錄的ASSVd基因組序列相似性為91% ～99%。此外,分析了測得的8條序列,其中有6條序列完全相同(作為樣品的主流序列),另2條分別有一個堿基差異。

圖2 Northern雜交和RT-PCR檢測蘋果葉片中ASSVdFig.2 Northern blot and RT-PCR analysis of ASSVd in cultivated apple leaves

對樣品中主流序列的二級結構進行預測,結果顯示該主流序列具有Pospiviroidae基因組二級結構典型特征,包括5個結構功能區,分別為左末端區(TL)、致病區(P)、中央保守區(C)、可變區(V)和右末端區(TR),能夠形成穩定的擬棒狀結構。另外,比對了該序列與ASSVd參考序列(NC_001340.1),發現兩者核酸序列相似性達98%。本試驗所得序列在8個位點發生了堿基突變,分別在V區的125位和126位之間、C區的219位和220位之間插入堿基G、U,以及TL區的G1→C、U3→ G、A4→ U、U300→ A、A319→ U和C區的G249→ U(圖3)。

圖3 平谷蘋果中ASSVd核酸序列及其二級結構預測Fig.3 The nucleotide sequences and secondary structure of ASSVd from Pinggu

3 討論

蘋果銹果病是危害蘋果產業健康發展的重要病害,在國內,陳煒等首次在表現銹果的蘋果組織中檢測到了環狀類病毒RNA,并進行了侵染性研究,為銹果病類病毒病原提供了證據[11-12]。本試驗應用靈敏度較高的探針雜交并結合RT-PCR分子生物學方法檢測了‘中秋王’和‘寒富’兩個蘋果品種的ASSVd侵染情況。結果表明,‘中秋王’和‘寒富’兩個品種對ASSVd的敏感性不同,而且‘中秋王’果實銹果癥狀與ASSVd檢出情況呈現明顯的相關性。序列比對后發現,侵染兩個蘋果品種的ASSVd主流序列完全相同,但在果實表面引起的癥狀完全不同。這可能說明了ASSVd侵染引起了部分品種的寄主植物中某些特定基因表達水平的變化,最終導致細胞組織發生病變,寄主植物表現出特有的癥狀。

另外,我們也分析了ASSVd主流核酸序列的二級結構及其變異情況,主流序列的堿基變異主要發生在TL區。在C區也有一個堿基的變異和插入,第249位的G顛換為U,219位和220位之間插入堿基U,以及V區125位和126位之間也有一個堿基G插入。但是C區和V區中三個位點突變后的堿基與首次公布的ASSVd序列日本分離物(Y00435.1)堿基完全相同[13]。之后,比對該主流序列與日本分離物序列發現,兩序列C區堿基完全相同,僅在TL區和V區有6個堿基的差異。這說明本試驗所得ASSVd主流序列比較接近日本分離物。雖然堿基突變可能引起病毒復制或致病能力的不同[14],但本試驗所測樣品(1和5)主流序列的一致性說明了序列變異并非是引起‘中秋王’和‘寒富’果實表現不同癥狀的直接原因。

總體上,試驗結果說明了蘋果品種抗性的強弱可能是致使‘中秋王’和‘寒富’果實是否表現銹果癥狀的重要因素。因此,選育抗病、耐病蘋果品種對于蘋果銹果病的防控具有重要作用。然而,ASSVd侵染‘中秋王’、‘寒富’后表現不同癥狀的致病機理尚有待進一步研究。

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(責任編輯：楊明麗)

Detection of Apple scar skin viroid in apple leaves from Pinggu District in Beijing

Xing Fei1,2, Zhang Zhixiang1, Chen Ce1, Wang Hongqing2, Li Shifang1

(1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2. College of Horticulture, China Agricultural University, Beijing 100193, China)

Twelve ‘Zhongqiuwang’ and ‘Hanfu’ apple leaf samples were collected from Pinggu District, Beijing, China, andApplescarskinviroid(ASSVd) was detected in these samples using Northern blot and RT-PCR. The results showed that symptomatic ‘Zhongqiuwang’ and asymptomatic ‘Hanfu’ samples were infected by ASSVd, while no ASSVd was detected in asymptomatic ‘Zhongqiuwang’ samples. Sequencing analysis showed that the obtained ASSVd sequences had 91%-99% similarities with other ASSVd sequences in the NCBI, and the dominant sequences of ASSVd from ‘Zhongqiuwang’ and ‘Hanfu’ were the same. Our results demonstrated that ‘Zhongqiuwang’ seems to be susceptible and sensitive to ASSVd, and ‘Hanfu’ showed a relatively strong tolerance to ASSVd.

apple scar skin disease;Applescarskinviroid; variety

2016-03-15

2016-04-06

國家自然科學基金(31471747)；公益性行業(農業)科研專項(201203076)

S 436.611

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.025

* 通信作者 E-mail:sfli@ippcaas.cn