CAFs及IL-8對裸鼠人卵巢癌移植瘤生長的影響

李猛，楊璐璐，陳琢，陳穎

（1中國醫科大學附屬第四醫院，沈陽110032；2中國醫科大學；3沈陽醫學院）

·基礎研究·

CAFs及IL-8對裸鼠人卵巢癌移植瘤生長的影響

李猛1，楊璐璐2，陳琢3，陳穎1

（1中國醫科大學附屬第四醫院，沈陽110032；2中國醫科大學；3沈陽醫學院）

目的 探討癌相關成纖維細胞（CAFs）及白細胞介素8（IL-8）對裸鼠卵巢癌生長的促進作用。方法CAFs和成纖維細胞（NFs）原代培養并鑒定，培養人卵巢癌細胞株（OVCAR3細胞）。將10只裸鼠隨機分為10組，分別接種NFs、CAFs、OVCAR3、NFs+OVCAR3、CAFs+OVCAR3及IL-8（100 ng／mL）干預后的以上細胞，并根據相應接種細胞分組，建立裸鼠皮下移植瘤模型。觀察各組成瘤情況，計算腫瘤體積；處死裸鼠，剝離瘤體，HE染色后鏡下觀察裸鼠荷瘤組織病理變化。結果 NFs組、CAFs組、NFs+OVCAR3組、CAFs+IL-8組、NFs+IL-8組、NFs+ OVCAR3+IL-8組未見腫瘤生長。OVCAR3+CAFs+IL-8組、OVCAR3+CAFs組、OVCAR3+IL-8組成瘤體積明顯大于OVCAR3組（P均＜0.05），在前期OVCAR3+CAFs+IL-8組成瘤體積最大（P均＜0.05）。HE染色鏡下見OVCAR3+CAFs+IL-8組癌組織惡性程度最高。結論 CAFs、IL-8能在體內促進裸鼠卵巢癌移植瘤的生長，且二者有協同作用。

卵巢腫瘤；癌相關成纖維細胞；白細胞介素8；小鼠

近年來研究證明，卵巢癌的發生、發展及轉移與腫瘤微環境、慢性炎癥有密切關系［1，2］。卵巢癌微環境中癌相關成纖維細胞（CAFs）能分泌多種因子促進腫瘤血管、淋巴管生成，促進腫瘤的侵襲和遠處轉移［3］。慢性炎癥的長期刺激可誘發人正常細胞增殖、突變、阻止細胞凋亡并且導致細胞惡變［4］，還能通過誘導浸潤在腫瘤微環境的細胞分泌細胞因子和趨化因子等增加患癌風險。白細胞介素8（IL-8）可通過促進腫瘤細胞的增殖、轉移和血管生成來促進卵巢癌的進展［5］。但目前關于腫瘤微環境、慢性炎癥導致卵巢癌發生發展的具體機制仍不清楚。本研究于2015年6～11月通過建立裸鼠卵巢癌移植瘤模型，探討CAFs及IL-8對卵巢癌成瘤的作用。

1　材料與方法

1.1材料 人卵巢癌細胞株OVCAR3（中國醫科大學贈送）；DMEM培養基、RPMI1640培養基、青鏈霉素（Hyclone公司），磷酸鹽緩沖液（PBS）、IL-8（中杉金橋），胰蛋白酶、胎牛血清（天津灝洋公司），二甲基亞砜（Sigma公司）；BALB／C-nu雌性裸鼠10只（北京華阜康），4～5周齡，體質量14～16 g，按三級動物要求由中國醫科大學動物實驗中心在SPF環境中飼養。

1.2CAFs、成纖維細胞（NFs）提取及鑒定 無菌條件下取卵巢癌組織標本3例、宮頸癌根治術中正常卵巢組織標本3例。取上皮性卵巢癌組織，反復清洗，修剪，剪碎，置于培養瓶中培養，傳至3代進行CAFs免疫組化鑒別。從正常卵巢組織提取并培養NFs，鑒別同CAFs。將胞質中出現淡棕色或棕黃色顆粒判為陽性染色。CAFs細胞的波形蛋白和α-SMA均為陽性表達，胞質呈黃棕色著色，角蛋白呈陰性表達。NFs細胞的波形蛋白為陽性表達，胞質呈黃棕色著色，α-SMA與細胞角蛋白均為陰性表達。

1.3OVCAR3、CAFs、NFs培養 于37℃、5%CO2條件下，用含10%胎牛血清的DMEM培養CAFs和NFs，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養OVCAR3。待OVCAR3、CAFs和NFs生長至70%～80%，取部分OVCAR3、CAFs、NFs用含IL-8（100 ng／mL）培養基培養24 h。將細胞進行計數，根據計數用PBS將各類細胞分別配制成終濃度為2×107／mL、4×107／mL。再按1∶1比例將濃度為2×107／mL的細胞分別混合制成OVCAR3+CAFs、NFs+ OVCAR3、OVCAR3+CAFs+IL-8、NFs+OVCAR3+ IL-8細胞混懸液（終濃度4×107／mL）。1.4 裸鼠皮下移植瘤模型建立 將10只裸鼠隨機分為10組，分別接種NFs、CAFs、OVCAR3、NFs+ OVCAR3、CAFs+OVCAR3及IL-8干預后的以上細胞。每只裸鼠分別取3處接種細胞，將裸鼠雙前肢腋窩皮下和后背作為接種點，每處接種0.15 mL，注射后用鑷子夾閉針孔，觀察成瘤情況。當腫瘤長至0.3 cm×0.3 cm時，記錄測量腫瘤最大徑線（a）、與最大徑線垂直的最長徑線（b），計算腫瘤體積（V＝1／6πab2）（mm3）。觀察腫瘤，待腫瘤表面破潰時處死裸鼠，剝離瘤體，一部分立即放入-80℃冰箱保

存，另一部分用甲醛固定后石蠟包埋，保存。HE染色后觀察裸鼠荷瘤組織病理變化。

1.5統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料用±s表示，多組比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1CAFs和IL-8對裸鼠移植瘤生長的影響 NFs組、CAFs組、NFs+OVCAR3組、CAFs+IL-8組、NFs +IL-8組、NFs+OVCAR3+IL-8組未見腫瘤生長。其余各組腫瘤體積生長變化見表1。

表1　各組不同時點腫瘤體積比較（mm3，±s）

表1　各組不同時點腫瘤體積比較（mm3，±s）

注：與OVCAR3組比較，aP＜0.05；與OVCAR3+IL-8組比較，bP＜0.05；與CAFs+OVCAR3組比較，cP＜0.05。

組別腫瘤體積接種第17天接種第19天接種第21天接種第23天接種第25天OVCAR3組16.21±1.4319.35±1.2223.50±2.74106.96±11.82163.15±1.85 OVCAR3+IL-8組46.93±6.93a59.82±7.10a92.85±10.67a131.57±15.48a170.66±4.49aCAFs+OVCAR3組67.25±8.75ab100.46±14.94ab147.70±16.04ab219.37±21.98ab282.78±54.94abCAFs+OVCAR3+IL-8組63.54±11.74abc75.38±17.59abc135.74±21.97ab187.93±39.35ac241.15±79.39ac

2.2裸鼠成瘤組織的病理變化 裸鼠成瘤組織HE染色鏡下見OVCAR3+CAFs+IL-8組癌組織惡性程度最高（經中國醫科大學附屬第四醫院病理科證實）。

3　討論

腫瘤微環境是近年來腫瘤課題研究的熱點，腫瘤細胞與腫瘤微環境是一個不可分割的整體，它們之間的功能互動性已經得到了普遍的認可，腫瘤基質在腫瘤的發展、增殖及浸潤等進程中起到了“土壤”的作用［6］。在卵巢癌腫瘤微環境中，CAFs的數量遠遠大于卵巢良性腫瘤和交界性腫瘤（P＜0.01），而且CAFs數量增加與卵巢癌患者出現淋巴結轉移和大網膜轉移以及淋巴管密度和腫瘤微血管密度增加有關［7］。研究發現，CAFs能通過分泌組蛋白甲基化轉移酶、血管內皮生長因子、趨化因子等促進腫瘤血管生成、淋巴管生成和腫瘤細胞的侵襲力來協同促進腫瘤發展及浸潤［7，8］。本實驗中，CAFs+ OVCAR3組裸鼠皮下成瘤體積明顯高于OVCAR3組，表明CAFs能明顯促進卵巢癌組織的增殖，這與以往文獻［8］報道一致。腫瘤細胞周圍的NFs可受到癌細胞分泌多種因子的影響，進入活化狀態［1，9，10］。在本實驗中，NFs+OVCAR3組在裸鼠皮下未見腫瘤生長，說明正常NFs對腫瘤無促進作用，這與NFs低表達或不表達成纖維細胞活化蛋白（FAP）、IL-8、轉化生長因子β（TGF-β）、HGF等有關［2］，而NFs轉化為活化NFs的機制有待進一步研究。

持續、慢性的炎癥環境能促進細胞轉化，導致組織損傷并引起修復反應，包括分泌生長因子、組織重建的酶類、免疫調節因子等，但慢性炎癥環境中所含的炎癥細胞、細胞因子及趨化因子等也可誘發人正常細胞增殖、突變，阻止細胞凋亡甚至惡變，并且能促進腫瘤細胞的生長、擴散、浸潤［4，11］。炎癥環境中的趨化因子參與許多腫瘤的生長過程，如卵巢癌、乳腺癌和結腸癌等［12］，但趨化因子和趨化因子受體調節惡性疾病的發生及進展的具體機制目前不清楚。IL-8是CAFs分泌的趨化因子之一，有文獻證明IL-8濃度為100 ng／mL時對腫瘤促進作用最明顯［13］。在本實驗中，OVCAR3+IL-8組裸鼠成瘤體積明顯大于OVCAR3組，表明IL-8能明顯促進卵巢癌細胞的增殖。本實驗中OVCAR3+NFs+IL-8組未見明確的腫瘤形成，這與以往文獻報道相異［10，15］，可能與本實驗中IL-8未能將NFs激活，也可能與NFs對腫瘤細胞有直接接觸抑制作用有關，其機制有待進一步研究。

CAFs在腫瘤的形成過程中分泌了IL-6、FAP、TGF-β、肝細胞生長因子、表皮生長因子等多種炎性因子和趨化因子，它們在腫瘤微環境中共同組成炎癥環境促進腫瘤的生長［1，11］。在本實驗中，OVCAR3+IL-8組裸鼠成瘤體積大于OVCAR3組，而OVCAR3+IL-8+CAFs組裸鼠成瘤體積最大，說明IL-8和CAFs協同作用促進了卵巢癌細胞的生長；根據瘤組織HE染色提示，IL-8+OVCAR3+CAFs組的瘤細胞惡性程度最高，由此我們推測IL-8可能成為預測卵巢癌的惡性程度及預后的指標之一。

綜上所述，CAFs和IL-8在卵巢癌增殖過程中發揮重要作用，未來或許通過抑制其產生或轉變來抑制卵巢癌的發展，成為卵巢癌治療的分子靶點；IL-8可能成為卵巢癌預后的判斷指標之一。但CAFs和IL-8對卵巢癌發生、侵襲及浸潤的作用機制目前仍不明確，尚需進一步研究。

［1］Yi KS，Nicolas B，Andras L，et al.HOXA9 promotes ovarian cancer growth by stimulating cancer-associated fibroblasts［J］.J Clin Invest，2012，122（10）：3603-3617.

［2］Cristiana A，Giuseppe M，Gina L，et al.Epithelial-stromal interactions in human breast cancer：effects on adhesion，plasma membrane fluidity and migration speed and directness［J］.PLoS One，2012，7（12）：e50804.

［3］Ganss R.Tumor stroma fosters neovascularization by recruitment of progenitor cells into the tumor bed［J］.J Cell Mol Med，2006，10（4）：857-865.

［4］Raman D，Baugher PJ，Thu YM，et al.Role of chemokines in tumor growth［J］.Cancer Lett，2007，256（2）：137-165.

［5］Singha B，Gatla H R，Manna S，et al.Proteasome inhibition increases recruitment of IκB kinase β（IKKβ），S536P-p65，and transcription factor EGR1 to interleukin-8（IL-8）promoter，resulting in increased IL-8 production in ovarian cancer cells［J］.J Biol Chem，2014，289（5）：2687-2700.

［6］Rodrigues-Lisoni FC，Peitl P Jr，Vidotto A，et al.Genomics and proteomics approaches to the study of cancer-stroma interactions［J］.BMC Med Genomics，2010，3（18）：2746-2752.

［7］Zhang Y，Tang H，Cai J，et al.Ovarian cancer-associated fibroblasts contribute to epithelial ovarian carcinoma metastasis by promoting angiogenesis，lymphangiogenesis and tumor cell invasion［J］.Cancer Lett，2011，303（1）：47-55.

［8］Xu L，Deng Q，Pan Y，et al.Cancer-associated fibroblasts enhance the migration ability of ovarian cancer cells by increasing EZH2 expression［J］.Int J Mol Med，2014，33（1）：91-96.

［9］Jing C，Tang HT，Xu L，et al.Fibroblasts in omentum activated by tumor cells promote ovarian cancer growth，adhesion and invasiveness［J］.Carcinogenesis，2012，33（1）：20-29.

［10］Mitra AK，Marion Z，Youjia H，et al.MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer［J］.Cancer Discov，2012，2（12）：1100-1108.

［11］Lee K，Hwang H，Nam KT.Immune response and the tumor microenvironment：how they communicate to regulate gastric cancer［J］.Gut Liver，2014，8（2）：131-139.

［12］Ning Y，Manegold PC，Hong YK，et al.Interleukin-8 is associated with proliferation，migration，angiogenesis and chemosensitivity in vitro and in vivo in colon cancer cell line models［J］.Int J Cancer，2011，128（9）：2038-2049.

［13］鄒敏君，劉肖珩，李毅，等.IL-8誘導血管內皮細胞遷移的實驗研究［J］.生物醫學工程學雜志，2006，23（5）：1013-1016.

［14］Sarvaiya PJ，Donna G，Ilya U，et al.Chemokines in tumor progression and metastasis［J］.Oncotarget，2013，4（12）：317-322.

10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.009

R-332；R737.31

A

1002-266X（2016）21-0025-03

遼寧省科學技術計劃項目（2013225021）；遼寧省“百千萬人才工程”資助項目（2012921031）。

陳穎（E-mail：chenying718＠tom.com）

（2015-12-30）