異丙托溴銨霧化吸入治療對(duì)COPD大鼠肺功能的保護(hù)作用及機(jī)制

熊英，張金娟，黃惠妍，李玲，陳燕，周忠

（1貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽550025；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院；3貴陽市肺科醫(yī)院）

異丙托溴銨霧化吸入治療對(duì)COPD大鼠肺功能的保護(hù)作用及機(jī)制

熊英1，張金娟1，黃惠妍2，李玲1，陳燕2，周忠3

（1貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽550025；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院；3貴陽市肺科醫(yī)院）

目的 觀察異丙托溴銨霧化吸入治療對(duì)慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠肺功能的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。方法 48只SD大鼠隨機(jī)均分為模型組、治療3周組、治療6周組和對(duì)照組，前三組制備COPD大鼠模型，停止熏煙后次日治療3、6周組予以異丙托溴銨霧化治療，4 mL／次，2次／d，分別治療3、6周；對(duì)照組經(jīng)氣管插管注入生理鹽水200 μL。采用BL-420系統(tǒng)記錄呼吸曲線計(jì)算第0.3 s用力呼氣容積（FEV0.3）、FEV0.3占肺活量百分比（FEV0.3／FVC），用血?dú)夥治鰞x檢測(cè)血?dú)庵笜?biāo)：pH、PaO2、PaCO2，采用ELISA法檢測(cè)IL-8、IL-10、TNF-α水平。結(jié)果

與模型組比較，治療3周組、治療6周組FEV0.3、FEV0.3／FVC、pH、PaO2、IL-10水平升高，PaCO2、IL-8、TNF-α水平降低（P均＜0.05），治療6周組以上指標(biāo)變化（除PaCO2外）更明顯（P均＜0.05）。結(jié)論 異丙托溴銨霧化吸入治療后COPD大鼠肺功能得到改善，該作用可能與降低IL-8、TNF-α水平，升高IL-10水平有關(guān)。

肺疾病，慢性阻塞性；細(xì)胞因子；異丙托溴銨；大鼠

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是以不完全可逆的氣流受限為特征，呈持續(xù)進(jìn)行性發(fā)展的疾病，是全球

發(fā)病率和病死率較高的重要疾病。研究表明，多種細(xì)胞因子參與該病的發(fā)生發(fā)展過程，且部分細(xì)胞因子水平與疾病的嚴(yán)重程度具有一定相關(guān)性［1～4］。2013年5月～2015年3月，本研究采用熏煙加氣管內(nèi)兩次滴注脂多糖（LPS）的復(fù)合刺激法制備COPD大鼠模型，并予以異丙托溴銨霧化吸入治療，觀察治療后COPD大鼠肺功能的變化，并探討其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物、儀器及試劑 成年SD大鼠48只，體質(zhì)量（200±20）g，雄性，合格證號(hào)SCXK（軍）2012-011，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠6只，動(dòng)物室光照充足，通風(fēng)和空調(diào)設(shè)備良好。有機(jī)玻璃熏煙箱（50 cm×40 cm×20 cm），自制；BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；HX200型呼吸流量換能器（北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司）；血?dú)夥治鰞x（美國OPTITM CCA）；酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司）；超聲霧化器（402B型江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司）。“黃果樹”牌過濾嘴香煙（貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司）；LPS（索萊寶生物技術(shù)有限公司）；水合氯醛（成都金山化學(xué)試劑有限公司）；吸入用異丙托溴銨溶液（2 mL∶500 μg，法國Laboratoire Unither）；IL-8、TNF-α、IL-10試劑盒（上海滬鼎生物技術(shù)有限公司）。

1.2動(dòng)物分組及COPD模型制備 SD大鼠隨機(jī)分為4組：模型組、治療3周組、治療6周組和對(duì)照組，各12只。采用氣管內(nèi)兩次滴注LPS及持續(xù)熏煙8周的方法造模。于造模第1、14天，各組大鼠麻醉［5］后行氣管插管術(shù)，經(jīng)插管向模型組和各治療組動(dòng)物氣道內(nèi)注入0.1%LPS溶液200 μL，對(duì)照組則經(jīng)氣管插管注入等量生理鹽水。待大鼠清醒后放回鼠籠中飼養(yǎng)。造模第2～13天、第15～56天模型組和各治療組予以被動(dòng)吸煙（方法：在自制熏煙箱內(nèi)同時(shí)點(diǎn)燃2只香煙，待其自行燃滅后更換，共點(diǎn)燃8支香煙，時(shí)間約45 min），1次／d，氣管內(nèi)注藥當(dāng)日均不予熏煙。對(duì)照組術(shù)后不予熏煙。模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)：留取模型組大鼠左肺組織，方法：頸總動(dòng)脈插管抽盡全血后迅速開胸取出完整肺組織，生理鹽水沖凈表面血液，用10%中性甲醛固定，取左肺，石蠟包埋，切片，HE染色，行病理檢查。鏡下見肺泡壁變薄、斷裂、肺泡腔脹大或破裂融合形成肺大泡；支氣管黏膜壞死、脫落，并伴有炎性細(xì)胞浸潤等肺氣腫和支氣管炎癥的病理改變，結(jié)合肺功能指標(biāo)下降說明造模成功。

1.3異丙托溴銨霧化治療 各治療組停止熏煙后次日予以異丙托溴銨霧化治療。方法：將大鼠放入30 L的密閉盒內(nèi)，用超聲霧化器吸入0.025%的異丙托溴銨液4 mL，2次／d，分別治療3、6周。對(duì)照組、模型組不予治療。

1.4指標(biāo)檢測(cè) 模型組、對(duì)照組于熏煙結(jié)束后次日，治療組大鼠分別于治療3周（治療3周組）、6周（治療6周組）次日進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。①肺功能測(cè)定：各組麻醉后將Y型插管插入氣管，插管一端經(jīng)呼吸流量換能器與BL-420s生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)連接，另一端接三通管。參照王翠茹等［3］的方法，在呼氣末經(jīng)三通管迅速向氣管內(nèi)推入6 mL空氣（相當(dāng)于被動(dòng)深吸氣），BL-420系統(tǒng)記錄呼吸曲線，并計(jì)算第0.3 s用力呼氣容積（FEV0.3）、FEV0.3占肺活量百分比（FEV0.3／FVC）。②血?dú)庵笜?biāo)檢測(cè)：肺功能測(cè)定結(jié)束后，行頸左側(cè)總動(dòng)脈插管術(shù)抽取動(dòng)脈血0.4 mL，用血?dú)夥治鰞x檢測(cè)血?dú)庵笜?biāo)：pH、PaO2、PaCO2。③IL-8、IL-10、TNF-α水平測(cè)定：經(jīng)動(dòng)脈插管處抽取全血，于室溫下靜置20 min后離心（3 000 r／min，離心20 min）分離血清，-20℃凍存，采用ELISA法檢測(cè)IL-8、IL-10、TNF-α水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組肺功能比較 與對(duì)照組比較，模型組FEV0.3、FEV0.3／FVC降低（P均＜0.05）；與模型組比較，各治療組FEV0.3、FEV0.3／FVC均升高（P均＜0.05），且治療6周組以上指標(biāo)升高最明顯（P均＜0.05）。見表1。

表1　各組肺功能比較（±s）

表1　各組肺功能比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與治療3周組比較，cP＜0.05。

組別nFEV0.3（mL）FEV0.3／FVC（%）對(duì)照組124.85±0.1580.71±2.53模型組123.29±0.20a54.83±3.32a治療3周組123.96±0.50ab66.00±8.37ab治療6周組124.36±0.24abc72.74±3.84abc

2.2各組血?dú)庵笜?biāo)比較 與對(duì)照組比較，模型組PaO2、pH下降，PaCO2升高（P均＜0.05）；與模型組比較，各治療組動(dòng)脈血pH、PaO2升高，PaCO2降低（P均＜0.05）；與治療3周組比較，治療6周組pH、PaO2升高（P均＜0.05）。見表2。

2.2各組血清IL-8、IL-10、TNF-α水平比較 與對(duì)照組比較，模型組血清IL-8、TNF-α水平升高、IL-10水平下降（P均＜0.05）；與模型組比較，各治療組血清IL-8、TNF-α水平降低、IL-10水平升高（P均＜0.05），且治療6周組以上指標(biāo)變化更明顯（P均＜0.05）。見表3。

表2　各組血?dú)庵笜?biāo)比較（±s）

表2　各組血?dú)庵笜?biāo)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與治療3周組比較，cP＜0.05。

組別npHPaO2（mmHg）PaCO2（mmHg）對(duì)照組127.35±0.0593.17±2.4839.17±4.07模型組127.18±0.05a50.33±2.88a56.83±3.92a治療3周組127.30±0.03b60.67±5.04ab48.71±6.94ab治療6周組127.34±0.05bc67.00±2.68abc47.28±5.93ab

表3　各組血清IL-8、IL-10、TNF-α水平比較（ng／L，±s）

表3　各組血清IL-8、IL-10、TNF-α水平比較（ng／L，±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與治療3周組比較，cP＜0.05。

組別nIL-8TNF-αIL-10對(duì)照組12356.16±6.93278.45±7.2456.42±3.15模型組12483.15±6.08a331.55±7.21a39.74±3.00a治療3周組12383.71±8.36ab293.55±7.23ab50.91±2.75ab治療6周組12364.10±8.69abc283.85±3.96abc54.94±2.59bc

3　討論

COPD是一種以氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管的慢性炎癥以及不完全可逆的氣流受限為特征的慢性疾病，吸煙與反復(fù)感染是COPD最重要的致病因素。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁成分，也可混雜在煙草的煙霧和空氣污染顆粒中，研究表明LPS的慢性暴露可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)與COPD相同的病理生理學(xué)改變［4］。鑒于吸煙和LPS均是COPD的重要發(fā)病因素［5，6］，本研究采用了宋一平等［7］發(fā)明的氣管內(nèi)兩次注入LPS加熏香煙的復(fù)合刺激法建立COPD大鼠模型。由于大鼠呼吸頻率快，且動(dòng)物無法配合，本實(shí)驗(yàn)參照安立等［8］的方法測(cè)定FEV0.3、FEV0.3／FVC代替FEV1、FEV1／FVC進(jìn)行肺功能評(píng)估。

異丙托溴銨是臨床常用的抗膽堿能藥物，通過競(jìng)爭(zhēng)支氣管、肺組織中的M受體結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性拮抗作用，其阻斷M受體后通過抑制細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷生成、減少環(huán)磷酸腺苷降解，降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，最終使氣管、支氣管平滑肌松弛，抑制氣道腺體分泌，改善肺功能。IL-8是中性粒細(xì)胞重要的趨化因子，它主要由肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，與COPD的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。國內(nèi)外研究表明，COPD患者肺內(nèi)IL-8的表達(dá)與肺功能下降密切相關(guān)［9，10］。TNF-α主要來源于活化的巨噬細(xì)胞，在COPD的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［11］。IL-10是細(xì)胞因子中為數(shù)不多的有效抗炎因子，具有重要的抗炎作用，研究認(rèn)為IL-10的減少可能是COPD氣道炎癥持續(xù)存在的原因［12］。目前已有細(xì)胞因子與COPD氣道炎癥嚴(yán)重程度相關(guān)的研究報(bào)道［13］，但對(duì)于藥物治療過程中細(xì)胞因子水平變化的研究甚少。鑒于以上三個(gè)因子與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)了異丙托溴銨霧化吸入治療過程中血清中IL-8、TNF-α和IL-10的水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較模型組大鼠血清IL-8、TNF-α水平顯著升高，IL-10水平顯著下降，予以異丙托溴銨霧化吸入治療后血清IL-8、TNF-α水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中治療6周組最為顯著；同時(shí)隨著治療時(shí)間延長IL-10水平逐漸升高，治療6周后IL-10水平與對(duì)照組接近。說明通過異丙托溴銨治療能有效改善COPD大鼠肺功能，其機(jī)制與降低炎癥因子IL-8、TNF-α水平、升高IL-10水平，減輕氣道炎癥反應(yīng)相關(guān)。

綜上所述，支氣管擴(kuò)張藥物異丙托溴銨霧化治療能有效改善COPD大鼠肺功能，且隨著治療時(shí)間的延長，體內(nèi)IL-8、TNF-α這類致炎因子水平逐漸下降，而保護(hù)性因子IL-10水平逐漸升高，提示體內(nèi)炎癥反應(yīng)減輕。進(jìn)而證實(shí)了異丙托溴銨能通過抑制體內(nèi)致炎因子的產(chǎn)生和促進(jìn)抗炎因子的表達(dá)發(fā)揮減輕氣道炎癥、改善肺功能的作用。

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10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.010

R-332；R563

A

1002-266X（2016）21-0027-03

貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合LG字［2012］014號(hào)）。

黃惠妍（E-mail：349430709＠qq.com）

（2016-01-26）