天然保鮮劑復配工藝優化及其對水晶肴肉中特定腐敗菌的抑制效果

姚永杰，徐寶才*，王周平，李 聰

（1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.肉品加工與質量控制國家重點實驗室，江蘇 南京 211806；3.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095；4.江蘇雨潤肉類產業集團有限公司，江蘇 南京 211806）

天然保鮮劑復配工藝優化及其對水晶肴肉中特定腐敗菌的抑制效果

姚永杰1,2，徐寶才2,3,4,*，王周平1，李 聰2,4

（1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.肉品加工與質量控制國家重點實驗室，江蘇 南京 211806；3.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095；4.江蘇雨潤肉類產業集團有限公司，江蘇 南京 211806）

通過二倍稀釋法測定ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）、乳酸鏈球菌素（Nisin）、肉桂醛、茶多酚（tea polyphenols，TP）、甘氨酸（glycine，Gly）以及復配單、雙硬脂酸甘油酯（mono-and diglycerides monostearate，GMS）對水晶肴肉特定腐敗菌的抑菌效果，其對嗜冷桿菌屬、腸球菌屬等的最低抑菌濃度分別為19.53、156.25、156.25、312.5、625、5 000 mg/kg。通過棋盤稀釋法測定兩兩之間的協同效應指數，明確了ε-PL、Nisin、TP、肉桂醛具有協同效應。通過正交試驗對其進行復配，得出最優配方為ε-PL 39 mg/kg、Nisin 468 mg/kg、TP 312.5 mg/kg、肉桂醛234.25 mg/kg。將研究結果應用于肴肉，在保質期內可明顯控制細菌總數和大腸菌群的增長，尤以7 d和15 d最為顯著，細菌總數抑制率分別達到86%、74%。

水晶肴肉；ε-PL；肉桂醛；Nisin；茶多酚

水晶肴肉亦叫水晶肴蹄，是鎮江傳統肉制品，以皮色潔白、鹵凍透明、光潔晶瑩、瘦肉鮮紅、香味濃郁、風味獨特而馳名，與鎮江的香醋、鍋蓋面并稱為“鎮江三怪”[1]。目前工業化水晶肴肉是在中式傳統工藝基礎上，引進現代低溫肉制品加工技術，但由于水晶肴肉煮制后工序工藝繁瑣，且多為人工操作[2]，容易引起微生物滋生，發生二次污染，導致產品腐敗變質[3-5]。即便產品在0～8 ℃條件下運輸、保存和銷售，仍有嗜冷菌繁殖導致產品衛生指標或產品質量指標不合格。延長水晶肴肉貨架期的可行辦法有添加抑菌劑[6-7]、控制過程衛生[8]以及巴氏殺菌，而單獨控制過程衛生，二次污染并不能得到有效解決；巴氏殺菌雖是解決產品二次污染的有效途徑，但水晶肴肉中的鹵凍主要是由精腱肉和豬皮熬制的湯冷凍而成，融點只有23 ℃左右，殺菌嚴重影響產品口感及外觀[9]。

肴肉菌譜范圍寬，細菌品種繁多（如乳桿菌屬、肉食桿菌屬、耶爾森菌屬和沙雷氏菌屬、索絲菌屬等，其中既有革蘭氏陽性菌，也有革蘭氏陰性菌），僅僅添加一種或二種單體防腐劑，較難達到理想防腐效果[3,6]，為有效延長肴肉貨架期，有必要同時使用多種天然綠色防腐抑菌劑以實現聯合抑菌。

本研究針對肴肉特定腐敗菌（中間耶爾森菌、屎腸球菌和清酒乳桿菌）[6]，選用了ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）、乳酸鏈球菌素（Nisin）、肉桂醛、茶多酚（tea polyphenols，TP）、甘氨酸（glycine，Gly）以及復配單、雙硬脂酸甘油酯（mono-and diglycerides monostearate，GMS）（主要包括月桂酸單甘酯等）等具有環境友好、生物活性多樣等優勢的天然防腐劑，以最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）和部分抑菌濃度指數（fractional inhibitory concentrations index，FICI）為指標篩選出抑菌效果較好的4 種綠色抑菌劑，并采用正交試驗的方法對種抑菌劑進行復配，并應用于水晶肴肉中，觀察抑菌效果，從而為控制肴肉微生物增長這一行業難題提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

前期對腐敗肴肉菌相進行高通量測序得其腐敗菌，主要為厚壁菌門（31.3%），其中比較多的是以下幾個屬：巨球菌屬、變形桿菌屬、嗜冷桿菌、鹽水球菌屬、葡萄球菌、肉食桿菌屬、漫游球菌屬、明串珠菌屬、腸球菌、摩根氏菌屬，其中只有摩根氏菌屬、變形桿菌屬為革蘭氏陰性，其余均為革蘭氏陽性菌。測序工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。為更加接近肴肉實際菌相，實驗以實際分離到的混合菌為受試菌。

ε-PL 浙江工業大學實驗室；GMS 杭州康源食品科技有限公司；Nisin 山東福瑞達生物科技有限公司；TP 煙臺強諾商貿有限公司；Gly 河南盛之德商貿有限公司；肉桂醛 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇、PCA培養基、營養肉湯及其他實驗所需試劑均由江蘇雨潤國家重點實驗室提供；豬皮、精腱肉、鹵湯及香辛料均由江蘇雨潤肉類產業集團肴肉生產車間提供。

1.2 儀器與設備

磁珠菌種保存管 青島海博生物科技有限公司；96 孔酶標板 泰州為爾康醫用品有限公司；超凈工作臺揚州凈化設備有限公司；GRP-9080隔水式恒溫培養箱上海森信實驗儀器有限公司；1 mL、200 μL移液槍德國Eppendorf公司；MJ-7BA高壓蒸汽滅菌鍋 施都凱儀器設備（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備[10-11]

真空包裝水晶肴肉冷藏40 d后，表面已長大量菌斑，出水、發黏、有氣泡、惡臭。配成10%的菌懸液后，于腦心浸出液肉湯36 ℃增菌24 h，并用磁珠凍存管保存。每次實驗前，取一磁珠至營養肉湯（nutrientbroth，NB），36 ℃條件下復壯后配制成菌數量濃度為105～106CFU/mL的菌懸液，備用。

1.3.2 保鮮劑溶液配制

用無菌蒸餾水溶解ε-PL、Nisin、TP、GMS配制成1%的溶液；Gly配成10%的溶液；肉桂醛用20%乙醇溶液[12]配制成1%的溶液。

1.3.3 MIC的測定[13-14]

采用二倍稀釋法測定MIC：取無菌96 孔平底板，從第1～12列依次加入100 μL NB，第1列再加入100 μL蒸餾水，第12列再加100 μL培養液分別作陰性和陽性對照，第2列加入1%的防腐劑100 μL，混勻后吸取100 μL至第3列中，依此類推進行倍比稀釋至第11列，混勻后棄掉100 μL，使稀釋后各孔中的受試藥物濃度倍比減少，最后于2～12號孔中各加入菌懸液100 μL，培養。評判標準為：有抑菌作用：菌液清澈透明；無抑菌作用：菌液混濁、有沉淀或絮狀懸浮物或在液面下或孔壁上形成菌膜[15]。將有抑菌作用最低含量記為MIC。實驗設置2個平行，每次實驗進行2 次驗證。

1.3.4 FICI的測定

根據單一防腐劑MIC測定結果，按棋盤稀釋法[16]略作修改進行測定。取無菌96 孔板在第1列加入100 μL水和100 μL NB作陰性對照，第2～8列依次加入

8～1/16 MIC的防腐劑a，以同樣方法在第A～F行依次加入8～1/16 MIC的防腐劑b，然后加入100 μL菌懸液，混勻于36 ℃培養24～36 h，觀察結果。按下式計算FICI判定防腐劑復配效果：

FICI＝FICa+FICb＝MIC（a/a+b）/MICa+MIC（b/a+b）/MICb

式中：FIC為部分抑制濃度；MIC（a/a+b）、MIC（b/a+b）為當a與b的復合物對某種微生物達到完全抑制時，復合物中a或b的抑制濃度；MICa、MICb為防腐劑a或b對該菌的最低抑制濃度。

FICI＜0.5，協同作用；FICI＝0.5～1，部分協同或相加作用；FICI＝1～2，無關作用；FICI＞2，拮抗作用。設置2 個平行，每次實驗進行2 次驗證。

1.3.5 復配保鮮劑對供試菌抑制效果測定

4 種保鮮劑的復配：根據1.3.3節和1.3.4節確定的4 種保鮮劑進行復配，以TP、Nisin、ε-PL和肉桂醛為單因素，每個因素設置3 個水平（其中肉桂醛具有濃郁肉桂味，根據前期實驗，用量達到312 mg/kg時會影響肴肉風味，而234 mg/kg不至于降低風味），做四因素三水平的正交試驗，以抑菌率為指標，確定4 種天然抑菌劑的最佳用量，正交試驗因素與水平設計如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平Table1 Levels of the factors used in the orthogonal array design

復配抑菌劑離體抑菌效果的測定：于9 mL NB中加入200 μL已稀釋的菌懸液，0號管加800 μL蒸餾水作對照組，其余試管依次按配方終用量加入相應體積的防腐劑溶液，置于36 ℃恒溫箱中培養24 h，然后用平板稀釋法測定各管中活菌濃度，計算抑菌率。每次試驗平行3 次。

1.3.6 保鮮劑產品應用效果評價

將1.3.5節中篩選出的較優搭配應用于產品，參照GB 4789.2—2010《菌落總數測定》和GB 4789.3—2010《大腸菌群計數》測定產品0、7、15、22、30 d的細菌總數和大腸菌群。水晶肴肉加工工藝及保鮮劑添加方法如下：

保鮮劑用無菌純水分別配成10 g/100 mL的溶液后，按配比稱好與鹵湯混勻，倒入模具，裝模成型。

2 結果與分析

2.1 MIC測定結果

表2 6 種抑菌劑對受試菌的MICTable2 MICs of six food preservatives against the tested bacteria

由表2可知，MIC測試結果表明幾種抑菌劑對肴肉雜菌的抑菌作用由強到弱依次為：ε-PL＞肉桂醛= Nisin＞TP＞Gly＞GMS。GMS的MIC達到5 000 mg/kg，大于GB 2760—2014限量，并未表現出明顯的抑菌效果，可能與GMS中發揮主要抑菌作用的月桂酸單甘酯（GML，具有乳化和抑菌雙重功能，抑菌譜廣[17]）比例較低有關，且實驗中所用指示菌為肴肉腐敗菌，主要為革蘭氏陰性[6]，而GML對革蘭氏陰性菌的抑制效果弱于革蘭氏陽性菌且培養溫度不利于GML最好的發揮作用。Gly的MIC為625 mg/kg，超過GB 2760—2014限量，同時也沒有表現出明顯的抑菌效果，可能與抑菌劑及受試菌本身的特性有關。ε-PL對指示菌有明顯的抑菌效果，這與其廣譜抗菌性有很大關系。據文獻報道，在中性及偏酸環境中ε-PL對腸膜明串珠菌[18-20]、金黃色葡萄球菌的MIC分別為50、12 mg/kg，ε-PL對革蘭氏陰性菌中，大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、空腸彎曲菌及銅綠假單胞菌的MIC為50、16、100、3 mg/kg。另外，ε-PL具有使用成本低、抗菌譜廣（包括耐熱性芽孢桿菌在內的細菌）、耐高溫（120 ℃，20min）、pH值使用范圍廣（pH 2～9）、協同增效性強[21]、安全性高等特點，可在肴肉煮制過程中單獨加入，以防止煮制后等待后續工藝過程中微生物的增長。因此，ε-PL有可能在后期防腐劑復配實驗及抑制產品中腐敗菌生長方面發揮主要作用。Nisin、肉桂醛的MIC均為156.25 mg/kg，這與其他文獻所記錄數據基本一致[22-25]。肉桂醛抑菌效果較好，但由于其本身特有的濃重桂皮味道，且肴肉配方中本身也含有肉桂，高用量的肉桂醛則會影響產品的風味。TP的MIC所測結果為312.5 mg/kg，TP在低用量的時候可以誘導群體感應信號分子產生，達到一定質量濃度才對混合菌起抑制作用[26-28]。

2.2 FICI測定結果

不同抑菌劑作用機理不同，每種抑菌劑也可能不止一種作用機制，而且目前有些機理尚不明確，以下列出本實驗所選保鮮劑幾種可能的抑菌機理。Nisin： 1）吸附于敏感細菌細胞膜，在其表面形成孔徑，導致細胞內容物泄露，失去質子動力，細胞裂解；2）Nisin中的二十二碳六烯酸和2,5-二羥基苯甲酸能夠與某些酶的巰基發生作用，抑制細胞壁中肽聚糖的生物合成，阻斷細

胞膜和磷脂化合物的合成，從而導致細胞內物質外泄；3）在芽孢萌發前期及膨脹期通過破壞它的膜抑制其發芽過程[29]。TP：1）影響細菌膜上的酶，破壞膜結構，使細胞膜微脂粒凝集；2）特異性地沉淀細菌蛋白；3）與細胞遺傳物質結合，影響轉錄和復制[26-28]。Gly：1）具有較強的配位能力和多樣化的配位模式，其分子中活潑的氨基，易于進行化學修飾和結構改造，可增加特殊結構的配位位點，其衍生物具有較強抑菌作用[30]；2）富含甘氨酸的抗菌肽具有抗菌作用，如肉蠅毒素C端結構域富含甘氨酸，通過抑制細菌細胞壁的形成，致使細菌死亡；天蠶葛佬素的甘氨酸含量為18%，通過抑制細菌細胞最外層細胞膜蛋白的合成，導致細胞膜通透性增加；3）與ε-PL、Nisin復配應用于冷鮮豬肉、酸奶、炸雞等食品中，具有協同增效作用，能夠增加對革蘭氏陽性菌的抑制效果。ε-PL：1）與帶陰離子的物質作用產生較強的靜電作用，且對生物膜穿透力強；2）作用于生物膜系統和蛋白合成系統，與核糖體結合，從而抑制蛋白和酶生物大分子的合成；3）破壞膜結構完整性，使細胞的選擇性改變，ATP和還原物質NADH虧缺，中斷細胞的物質、能量和信息傳遞，呼吸作用受到影響，細菌能量代謝和物質代謝破壞，導致胞內溶酶體膜破裂而誘導微生物產生自溶作用。肉桂醛：1）阻礙鞭毛蛋白和細胞膜的正常合成和代謝，對菌體形態產生影；2）影響菌體正常的蛋白合成和聚集；3）抑制ATP酶，影響細菌的正常代謝；4）吸附于菌體表面，破壞細胞壁多糖結構[22-24]。GMS：1）破壞細胞膜上的電子傳遞系統和氧化磷酸化以及引起細胞壁外膜LPS外泄[31-34]；2）GML為油相的食品級微乳液作用于細菌細胞膜，使得細胞表面疏水性下降、細胞膜通透性的增加，從而導致細菌迅速死亡。

表3 兩種保鮮劑單用和聯用作用效果Table3 Effects of two preservatives alone and in combination against the tested bacteria

如表3所示，單一抑菌效果較差的GMS與Nisin為協同作用，但與抑菌效果最好的ε-PL為拮抗作用，因此GMS不宜用于后續復配實驗。Gly與ε-PL、Nisin均為拮抗作用，會阻礙二者抑菌作用的發揮，復配中也不宜采用。TP與ε-PL、Nisin均為協同作用，可擴大抗菌譜。肉桂醛與本實驗所選幾種防腐劑中抑菌效果最好的ε-PL為協同作用，與Nisin、TP的FICI均為1.03，表現為無關作用，不會阻礙二者抑菌作用的發揮。兩種抑菌劑的協同或拮抗作用取決于二者作用機理，現在已知的4 種協同抗菌機制包括：抑制一系列生化途徑致細菌死亡；抑制保護性細菌酶的活性；增強對細菌細胞壁的聯合作用；增強其他抗菌物質的攝取等[35]。

2.3 復配保鮮劑對供試菌抑制配方優化結果

表4 保鮮劑配方優選正交試驗設計與結果Table4 Orthogonal array design with experimental results

如表4所示，3、6號試驗即A1B3C3D3、A2B3C1D1相對于對照組抑菌率分別達到了99%、100%，效果顯著。通過對菌落數進行極差分析可得，各因素間的主次順序為肉桂醛用量、Nisin用量、TP用量、ε-PL用量。最優水平組合為A2B3C1D3，即312.5 mg/kg TP、468 mg/kg Nisin、39 mg/kg ε-PL、234.25 mg/kg肉桂醛。

表5 最優配方驗證結果Table5 Verification of the optimal formulation

對最優水平組合進行驗證，結果如表5所示，其菌落數明顯低于對照，抑菌率達到100%。

2.4 保鮮劑產品應用效果評定

由圖1可以看出，30 d貯藏期內，隨貯藏時間延長處理組和對照組的菌落總數和大腸菌群數均呈逐漸上升趨勢，且處理組上升速率低于對照組。0d時處理組和對照組無顯著差異，7 d時處理組顯著低于對照組，細菌總數及大腸菌群抑制率最高，分別達到86%、97%；7 d后微生物迅速增長，到15 d處理組抑制率稍有降低，分別為

74%、73%；22d與15d貯藏點的菌落總數無明顯差異，產品菌相達到相對穩定狀態；之后，大腸菌群又出現一個迅速增長期，細菌總數也略有增長，到30 d時保鮮劑抑制效果減弱，處理組中細菌總數及大腸菌群抑制率分別為10%、27%。在30 d貯藏期內，處理組可有效抑制細菌總數及大腸菌群的增長速率，微生物的繁殖得到了有效的控制，有望將產品保質期延長到40 d以上。

圖1 細菌總數（A）和大腸菌群數（B）變化趨勢Fig.1 Changes in total bacterial count (A) and coliform bacterial count (B) during storage of Yao meat

另外，TP、ε-PL、肉桂醛不僅可通過表3中所述機理發揮抑菌效果，還具有其他方面的作用。如Nisin可以抑制芽孢生長，從而在抑制肴肉中未殺滅的芽孢萌發，發揮主要作用[3]。TP還可以通過其抗氧化作用穩定肉色，提高鴕鳥肉[36]、豬肘[37]、腌肉[38]等的發色率，可減少肴肉生產中亞硝酸鹽的使用，從而較大幅度的降低亞硝酸鈉殘留量[38]；降低脂肪氧化速率；減緩蛋白質變性和降解速率[25,39]。肉桂醛是通過破壞菌體細胞壁多糖結構達到抑菌效果的，而哺乳動物沒有細胞壁，因而不會對人類和動物的細胞產生損害作用[24]，且肉桂醛的肉桂味可增加肴肉風味。ε-PL還可以作為營養強化劑增加肴肉賴氨酸含量。因此此生物保鮮劑配方用于水晶肴肉可安全、高效的發揮抑菌作用。

3 結 論

本研究結果表明6 種供試防腐劑對水晶肴肉腐敗微生物的抑菌效果強弱順序為：ε-PL＞肉桂醛=Nisin＞TP＞Gly＞GMS。FICI表明ε-PL、Nisin、TP兩兩協同，肉桂醛與ε-PL也為協同作用，與Nisin、TP均為無關作用。對ε-PL、Nisin、TP和肉桂醛4 種抑菌劑進行正交復配，得出抑菌液最優水平組合312.5 mg/kg TP、468 mg/kg Nisin、39 mg/kg ε-PL、234.25 mg/kg肉桂醛的離體實驗抑菌率達到99%以上，應用于產品后，7 d時細菌總數及大腸菌群抑制率最高，分別達到86%、97%；15 d時抑制率稍有降低，分別為74%、73%。由此可得篩選出的復配生物保鮮劑可有效控制肴肉微生物增長。

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Optimization of Blends of Natural Preservatives for Improved Antimicrobial Effect against Specific Spoilage Organisms in Yao Meat

YAO Yongjie1,2, XU Baocai2,3,4,*, WANG Zhouping1, LI Cong2,4
(1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. State Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Nanjing 211806, China; 3. Collaborative Innovation Center of Meat Processing and Quality Control, Nanjing 210095, China; 4. Jiangsu Yurun Meat Product Group, Nanjing 211806, China)

The antibacterial effects of ε-poly-L-lysine (ε-PL), cinnamic aldehyde, nisin, tea polyphenols (TP), glycine (Gly), and mono-and diglycerides monostearate (GMS) added individually and in combination against special spoilage organisms in Yao meat were tested by the two-fold dilution method. The minimal inhibitory concentrations (MIC) of nisin, GMS, ε-PL, Gly, TP, cinnamic aldehyde against mixed cultures of bacteria isolated from spoiled Yao meat including Psychrobacter and Enterococcus were determined as 156.25, 5 000, 19.53, 625, 312.5, and 156.25 mg/kg, respectively. Based on the synergism index for two of these preservatives determined by the checkerboard dilution method, it was confirmed that ε-PL, nisin, TPs and cinnamic aldehyde had synergistic effects. Using an orthogonal array design, the optimum combination of these selected preservatives was determined as ε-PL 39 mg/kg, nisin 468 mg/kg, TPs 312.5 mg/kg and cinnamic aldehyde 234.25 mg/kg. When the formulation was applied in Yao meat, the growth of total and coliform bacteria could be significantly controlled during the shelf life, especially on the 7thand 15thday, with percentage inhibition of total bacteria of 86% and 74%, respectvely.

Yao meat; ε-poly-L-lysine (ε-PL); cinnamic aldehyde; nisin; tea polyphenols (TP)

10.7506/spkx1002-6630-201622001

TS251.6

A

1002-6630（2016）22-0001-06

姚永杰, 徐寶才, 王周平, 等. 天然保鮮劑復配工藝優化及其對水晶肴肉中特定腐敗菌的抑制效果[J]. 食品科學, 2016, 37(22): 1-6. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622001. http://www.spkx.net.cn

YAO Yongjie, XU Baocai, WANG Zhouping, et al. Optimization of blends of natural preservatives for improved antimicrobial effect against special spoilage organisms in Yao meat[J]. Food Science, 2016, 37(22): 1-6. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622001. http://www.spkx.net.cn

2016-04-21

國家自然科學基金面上項目（31571909）

姚永杰（1994—），女，碩士研究生，研究方向為肉品科學和產品研發。E-mail：yongjie1015@163.com

*通信作者：徐寶才（1973—），男，研究員，博士，研究方向為肉品科學和產品研發。E-mail：baocaixu@163.com