響應面法優化β-環糊精提取葡萄葉白藜蘆醇工藝

王周利，袁亞宏，劉宇璇，岳田利，蔡 瑞，崔 璐*

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

響應面法優化β-環糊精提取葡萄葉白藜蘆醇工藝

王周利，袁亞宏，劉宇璇，岳田利，蔡 瑞，崔 璐*

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

研究水、50%甲醇溶液和β-環糊精溶液對葡萄葉中多酚和白藜蘆醇提取效果的影響，并采用分子對接方法分析β-環糊精與白藜蘆醇之間的相互作用。結果表明：50%甲醇溶液提取所得多酚的提取量最大，而β-環糊精所得白藜蘆醇的提取量最大；β-環糊精的疏水性空腔可以容納白藜蘆醇分子，并通過氫鍵的形成維持復合物的穩定。通過單因素和響應面優化試驗對β-環糊精提取葡萄葉中白藜蘆醇的工藝參數進行分析和優化，結果表明，3 個因素對白藜蘆醇提取量的影響主次順序為提取溫度＞β-環糊精質量濃度＞處理時間；白藜蘆醇的最佳提取條件為β-環糊精質量濃度28 g/L、提取溫度50 ℃、處理時間68 min，在此條件下，白藜蘆醇提取量為152.2 μg/g。

葡萄葉；白藜蘆醇；β-環糊精；分子對接；提取

白藜蘆醇又稱芪三酚，其結構如圖1所示，是一種天然的二苯乙烯類多酚物質，主要存在于虎杖、藜蘆、葡萄、花生、桑葚等植物中[1-2]。研究表明白藜蘆醇具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗菌消炎、預防心血管疾病和保護肝臟等生理藥理活性，因此在食品、藥品和化妝品等領域應用前景十分廣闊[3-6]。目前，白藜蘆醇的制備主要是以虎杖、葡萄、花生等為基礎原料，采用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有機溶劑提取獲得[7-9]。由于這些植物資源的日益匱乏和有機溶劑本身的危害性，其揮發和排放不但會污染環境，還會對人體產生一定的危害，

尋求獲得新的植物來源并探究白藜蘆醇提取新方法是食品工業中研究的熱點之一。

圖1 白藜蘆醇的二維分子結構Fig.1 2D Molecular structure of resveratrol

我國是全球第二大葡萄種植區，每年秋季丟棄的葡萄葉數量可觀，而葡萄葉中含有豐富的白藜蘆醇[10-11]。研究和開發葡萄葉中白藜蘆醇提取新技術，不但可以實現葡萄葉廢棄物的再利用，減少環境壓力，還可以擴大白藜蘆醇的植物來源，因此具有重大意義。β-環糊精作為一種環狀低聚糖，其特殊的環狀中空圓筒型結構可以對一些生物活性物質進行包合，如揮發油和多酚類化合物等，從而增加這些物質的穩定性、溶解度和生物利用率[12-14]。早在1998年β-環糊精即被美國食品和藥品管理局列入“一般公認安全”名單，目前已廣泛地應用于食品工業中[15]。近年來，采用β-環糊精提取中藥活性成分的研究逐漸增多，也有學者在多酚類物質提取方面開展了積極的嘗試，并取得了較理想的結果[16-19]。與有機溶劑提取相比，β-環糊精提取法以水作為溶劑，因此更安全、經濟和環保。β-環糊精在生物活性物質制備方面的優勢為白藜蘆醇的提取提供了思路。

本研究首先對不同溶劑（水、50%甲醇溶液和β-環糊精溶液）對葡萄葉中白藜蘆醇的提取效率進行評價，并采用分子對接方法對β-環糊精與白藜蘆醇之間的相互作用進行分析；其次，通過單因素試驗（β-環糊精質量濃度、提取溫度和處理時間）和響應面優化試驗對β-環糊精提取葡萄葉中白藜蘆醇的工藝參數進行優化，旨在為白藜蘆醇的資源開發和葡萄廢棄物的綜合利用提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

戶太八號葡萄葉，2015年10月采自西安市戶縣葡萄園。白藜蘆醇（純度≥99%） 美國Sigma公司；β-環糊精（≥98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈（色譜純） 美國Tedia公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

LC-20A型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（包括LC-20AD高壓泵、SPD-M20A型二極管陣列檢測器、SIL-20A型自動進樣器、CBM-20A型系統控制器、CTO-10AS型柱溫箱、LC solution工作站） 日本島津公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；QJ3-W1000A高速萬能粉碎機天津泰斯特儀器有限公司；KQ-700GVDV雙頻恒溫數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；RE-5205旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；MCFD冷凍干燥機美國SIM公司；HC-3018R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多酚物質的提取

將葡萄葉于恒溫干燥箱中50 ℃干燥12 h，粉碎后過80 目篩。準確稱取葡萄葉粉末1.0 g置于50 mL具塞三角瓶中，分別加入水、體積分數50%甲醇溶液和15 g/L β-環糊精溶液各20 mL，在功率300 W、溫度40 ℃條件下，超聲提取40 min后，于10 000×g、4 ℃條件下離心2 min。50%甲醇溶液提取上清液40 ℃旋轉蒸干，殘渣溶于20 mL甲醇；水和β-環糊精提取上清液進行冷凍干燥，取20 mL甲醇用于沉淀β-環糊精[20]，同時溶解多酚物質，對所得甲醇溶液進行總酚含量測定和HPLC分析。

1.3.2 總酚含量的測定

采用福林-酚法測定總酚含量[21]。取0.5 mL樣品，分別加入0.5 mL Folin-Ciocalteau試劑、2 mL 7.5% Na2CO3溶液和2 mL蒸餾水，搖勻，35 ℃水浴中反應90 min后，在波長765 nm處測定吸光度。配制沒食子酸的質量濃度分別為0、2、4、8、16、32、64、100 μg/mL，以沒食子酸質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作標準曲線，所得回歸方程為：y=0.011 5x+0.030 5（R2=0.998 9）。

1.3.3 HPLC分析

采用HPLC法分析樣品中的白藜蘆醇。色譜柱：Waters C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A為乙腈，B為0.2%乙酸溶液；等度洗脫程序為20% A洗脫30 min；進樣體積20 μL；柱溫40 ℃；流速1.0 mL/min；二極管陣列檢測器波長306 nm。

配制不同質量濃度的白藜蘆醇（0.5、1、2、4、6、8 μg/mL和10 μg/mL），以白藜蘆醇質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程：y=198 419x+5 667（R2=0.997 2）。

1.3.4 分子對接

從PubChem數據庫獲得β-環糊精和白藜蘆醇的分子模型，并在UCSF Chimera程序中分別添加AMBER14SB力場和AM1-BCC電荷，進行幾何優化，優化后結構用于對接計算。對接參數為：對接盒子大小為34×40×26，對接中心坐標為（7.894，12.159，11.776），搜索步長為0.375??，其余采用程序默認設置，采用拉馬克遺傳算法進行100 個構象運算。對結果進行聚類分析，均方根偏差為2.0 ?，β-環糊精與白藜蘆醇對接結果用PyMOL顯示。

1.3.5 β-環糊精提取葡萄葉中白藜蘆醇工藝優化

1.3.5.1 單因素試驗

將β-環糊精提取葡萄葉中白藜蘆醇的初始工藝參數設定為：β-環糊精質量濃度15 g/L、提取溫度40 ℃、處理時間60 min，并固定料液比1∶20（g/mL）、超聲功率300 W。分別考察β-環糊精質量濃度（5、10、15、20、25 g/L和30 g/L）、提取溫度（20、30、40、50、60 ℃和70 ℃）及處理時間（20、40、60、80、100 min和120 min）對β-環糊精提取葡萄葉中白藜蘆醇提取量的影響。

1.3.5.2 響應面優化試驗設計

在單因素試驗基礎上，采用統計分析軟件Design-Expert 8.0.6中Box-Behnken試驗方法，以β-環糊精質量濃度、提取溫度和處理時間為自變量，以白藜蘆醇提取量為響應值，設計3因素3水平試驗方案，確定最佳的白藜蘆醇提取工藝參數，因素及水平編碼如表1所示。

表1 因素及水平編碼Table1 Coded levels for factors used in Box-Behnken design

1.4 數據處理

采用SAS 9.1軟件對數據進行方差分析和Duncan多重比較分析，當P＜0.05時，說明各處理之間存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 總酚含量的測定

圖2 不同溶劑對葡萄葉中多酚含量的提取量Fig.2 The yield of polyphenols extracted from grape vine leaves by different solvents

如圖2所示，不同溶劑提取所得多酚含量存在顯著性差異，50%甲醇溶液提取所得多酚的提取量最大（34.9 mg/g），β-環糊精對多酚提取量次之（16.7 mg/g），而水作為提取劑所得多酚提取量最小（12.1 mg/g）。

2.2 HPLC分析

圖3 白藜蘆醇標準品及不同溶劑所得提取液的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of resveratrol standard and grape vine leaf extracts obtained using different solvents

為考察不同溶劑對葡萄葉中白藜蘆醇提取的影響，對提取液進行HPLC分析，如圖3所示。白藜蘆醇標準品的保留時間為14.592 min。水作為提取溶劑時，白藜蘆醇的提取量較低，僅為15.3 μg/g（圖3b）；50%甲醇溶液進行提取時，白藜蘆醇的提取量為34.6 μg/g（圖3c）；而15 g/L β-環糊精溶液提取所得白藜蘆醇提取量大大提高，達到了111.6 μg/g（圖3d）。從以上結果可以得出β-環糊精可以顯著提高葡萄葉中白藜蘆醇的提取量，分析原因可能是白藜蘆醇溶出后立即被β-環糊精包合，從而增加了白藜蘆醇在葡萄葉組織細胞和水溶液中的濃度差，提高了白藜蘆醇的溶出率[22]，另外β-環糊精的包合作用還可以防止白藜蘆醇的氧化。

2.3 分子對接

為了探究β-環糊精與白藜蘆醇之間的相互作用，本實驗采用Autodock 4.2軟件將兩者進行分子對接研究，所得100 個最優構象的聚類分布情況如圖4a所示，可以看出對接構象主要形成了4 個集群，其中能量最低的第1個集群包含了74%的構象，在聚類數目上占絕對優勢，這表明對接結果較為理想[23]。β-環糊精與白藜蘆醇之間的最佳結合模式如圖4b所示，此時的結合能為-5.38 kcal/mol。由圖4b可以推測出復合物的形成過程為：白藜蘆醇分子向β-環糊精的大端口接近，以圖1中A環為頭進入環狀空腔，并與β-環糊精形成2 對氫鍵（O—H…O），從而形成穩定的復合物，該分子對接結果也說明了利用β-環糊精提取葡萄葉中白藜蘆醇的可行性。

圖4 β-環糊精與白藜蘆醇的對接構象聚類圖（a）及最佳結合模式圖（b）Fig.4 Docking conformation clustering (a) and optimal binding mode (b) of β-cyclodextrin with resveratrol

2.4 單因素試驗結果

2.4.1 β-環糊精質量濃度對提取葡萄葉中白藜蘆醇提取量的影響

圖5 β-環糊精質量濃度對提取葡萄葉中白藜蘆醇提取量的影響Fig.5 Effect of β-cyclodextrin concentration on resveratrol release from grape vine leaves

如圖5所示，提取溫度40℃、處理60 min時，當β-環糊精的質量濃度從5 g/L升高至25 g/L時，白藜蘆醇的提取量顯著增加，從77.1 μg/g提高到了132.2 μg/g，這是因為隨著提取液中β-環糊精質量濃度的提高，所形成的β-環糊精-白藜蘆醇包合物量越多，最終所得白藜蘆醇的提取量也越高；再繼續增大β-環糊精的質量濃度至30 g/L時，白藜蘆醇的提取量無顯著性變化，為135.3 μg/g。因此，選擇β-環糊精質量濃度20、25 g/L和30 g/L進行后續優化試驗。

2.4.2 提取溫度對β-環糊精提取葡萄葉中白藜蘆醇提取量的影響

圖6 提取溫度對β-環糊精提取葡萄葉中白藜蘆醇提取量的影響Fig.6 Effect of temperature on resveratrol release from grape vine leaves by β-cyclodextrin

如圖6所示，β-環糊精質量濃度為25 g/L、處理60 min時，隨著提取溫度的升高，白藜蘆醇的提取量呈現先增加后降低的趨勢。當提取溫度從20 ℃升高至50 ℃時，提取量從96.5 μg/g提升至147.5 μg/g，分析原因可能是較高的溫度有利于白藜蘆醇的溶出；當提取溫度繼續升高時，提取量顯著下降，在70 ℃的提取條件下，白藜蘆醇的提取量為121.0 μg/g，這是因為當溫度過高時，一方面β-環糊精與白藜蘆醇形成的包合物會解包[12,24]，另一方面會加速未被包合白藜蘆醇的氧化[25]，從而造成白藜蘆醇提取量的降低。因此，選取溫度40、50 ℃和60 ℃作為后續優化試驗條件。

2.4.3 處理時間對β-環糊精提取葡萄葉中白藜蘆醇提取量的影響

圖7 處理時間對β-環糊精提取葡萄葉中白藜蘆醇提取量的影響Fig.7 Effect of extraction time on resveratrol release from grape vine leaves by β-cyclodextrin

如圖7所示，β-環糊精質量濃度為25 g/L、提取溫度為50 ℃時，當處理時間從20 min延長至60 min時，白藜蘆醇的提取量顯著提高，含量從101.0 μg/g增加至147.5 μg/g；當提取時間超過60 min時，白藜蘆醇的提取量趨于平緩，在處理120 min后，提取量為154.1 μg/g，分析原因可能是白藜蘆醇的溶出已達到飽和，溶出率趨于平衡。因此，選取處理時間40、60 min和80 min作為進一步優化提取的條件。

2.5 響應面試驗結果

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型方差分析Table3 Analysis of variance for regression equation

如表2所示，白藜蘆醇的提取量在98.4～152.1 μg/g之間。對試驗數據進行擬合，得到白藜蘆醇提取量（y）對β-環糊精質量濃度（x1）、提取溫度（x2）和處理時間（x3）的二次多項回歸模型方程：y=-702.195+12.015x1+ 16.773x2+7.827x3+0.008x1x2-0.046x1x3-0.063x2x3-

對該模型進行方差分析和模型系數顯著性檢驗，結果見表3。建立的二次回歸模型方程是顯著的（P=0.000 1）；失擬項P=0.097 2＞0.05，不顯著；相關系數R2為0.972 8，表明該模型預測值與試驗值擬合良好。模型的一次項x1、x2和x3的P值均小于0.05，說明β-環糊精質量濃度、提取溫度和處理時間對白藜蘆醇提取量的影響顯著；另外，β-環糊精質量濃度與處理時間的交互作用（x1x3）、提取溫度與處理時間的交互作用（x2x3）、提取溫度的二次項（x22）以及處理時間的二次項（x32）對提取效果也有顯著影響。回歸方程的一次項系數表明影響因素的主次順序為提取溫度＞β-環糊精質量濃度＞處理時間。

圖8 各因素及其交互作用對白藜蘆醇提取量影響的響應面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots for the extraction yield of resveratrol versus various factors

通過考察響應面的形狀，分析不同因素對β-環糊精輔助提取葡萄葉中白藜蘆醇的影響以及不同因素之間的交互作用。由圖8可以看出，響應曲面均呈現為向下開口的凸面，等高線為橢圓形，中心位于所考察的區域范圍內，因此，在各考察因素范圍內存在白藜蘆醇的最大提取量值。由圖8a可知，隨著β-環糊精質量濃度的增加及提取溫度的升高，在β-環糊精質量濃度為25.9～30.0 g/L、提取溫度為48.0～56.0 ℃時，能獲得較高的白藜蘆醇提取量。由圖8b可知，當β-環糊精質量濃度為23.6～30.0 g/L、處理時間為56.4～80.0 min時，白藜蘆醇提取效果較好。由圖8c可以看出，提取溫度在低水平時，可以通過延長處理時間提高白藜蘆醇的提取量，而提取溫度在高水平時，處理時間過長則會導致提取量明顯下降；當提取溫度為44.1～53.0 ℃、處理時間為63.0～80.0 min時，白藜蘆醇提取量較高。

利用Design-Expert軟件的優化功能獲得葡萄葉中白藜蘆醇的最佳提取條件為β-環糊精質量濃度28.2 g/L、提取溫度49.8 ℃、處理時間68.6 min，此時模型預測值為153.03 μg/g。考慮到實際操作的便利，將優化的提取條件修正為β-環糊精質量濃度28 g/L、提取溫度50 ℃、處理時間68 min，在此條件下進行6 次驗證實驗，所得白藜蘆醇提取量為（152.2±2.64） μg/g，與預測值沒有顯著性差異，說明了模型的可靠性和準確性。

3 結 論

本實驗比較了不同溶劑（水、50%甲醇溶液和β-環糊精溶液）對葡萄葉中白藜蘆醇的提取效率，其次采用分子對接方法分析了β-環糊精與白藜蘆醇之間的相互作用，最后通過單因素（β-環糊精質量濃度、提取溫度和處理時間）和響應面優化試驗獲得了β-環糊精提取葡萄葉中白藜蘆醇的最佳工藝參數。研究結果表明：β-環糊精提取所得白藜蘆醇的提取量最大；β-環糊精的疏水性空腔可以容納白藜蘆醇分子，并通過氫鍵的形成維持復合物的穩定；葡萄葉中白藜蘆醇的最佳提取條件為β-環糊精質量濃度28 g/L、提取溫度50 ℃、處理時間68 min，在此條件下，白藜蘆醇提取量為152.2 μg/g。本研究為白藜蘆醇的資源開發和葡萄廢棄物的綜合利用提供了理論依據和指導。

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Response Surface Optimization of Extraction of Resveratrol from Grape Vine Leaves Using β-Cyclodextrin

WANG Zhouli, YUAN Yahong, LIU Yuxuan, YUE Tianli, CAI Rui, CUI Lu*
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

The effects of β-cyclodextrin, 50% methanol and water on the recoveries of phenolic compounds and resveratrol from grape vine leaves were evaluated. The interaction between β-cyclodextrin and resveratrol was analyzed using molecular docking method. The results indicated that the highest total phenolic content was obtained by using 50% methanol, while β-cyclodextrin resulted in the highest yield of resveratrol. The hydrophobic cavity of β-cyclodextrin could accommodate the resveratrol molecule, and hydrogen bindings between β-cyclodextrin and resveratrol led to the formation of sTablecomplexes. By applying one-variable-at-a-time approach and response surface methodology, the β-cyclodextrin-assisted extraction process of resveratrol from grape vine leaves was optimized. Temperature was the most significant factor affecting the yield of resveratrol, followed by β-cyclodextrin concentration and treatment time. The optimal conditions obtained were as follows: β-cyclodextrin concentration, 28 g/L; temperature, 50 ℃; and extraction duration, 68 min, under which a resveratrol yield of 152.2 μg/g was achieved.

grape vine leaves; resveratrol; β-cyclodextrin; molecular docking; extraction

10.7506/spkx1002-6630-201622003

TS255.1

A

1002-6630（2016）22-0013-07

王周利, 袁亞宏, 劉宇璇, 等. 響應面法優化β-環糊精提取葡萄葉白藜蘆醇工藝[J]. 食品科學, 2016, 37(22): 13-19. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622003. http://www.spkx.net.cn

WANG Zhouli, YUAN Yahong, LIU Yuxuan, et al. Response surface optimization of extraction of resveratrol from grape vine leaves using β-cyclodextrin[J]. Food Science, 2016, 37(22): 13-19. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201622003. http://www.spkx.net.cn

2016-06-05

國家自然科學基金青年科學基金項目（31301498）；西北農林科技大學基本科研業務費專項（Z109021424）

王周利（1984—），男，講師，博士，研究方向為農產品加工與安全控制。E-mail：wzl1014@nwsuaf.edu.cn

*通信作者：崔璐（1981—），女，實驗師，博士，研究方向為食品工程與農產品加工。E-mail：cuiluct@nwsuaf.edu.cn