水酶法水解液中大豆多肽的吸附純化及其氨基酸組成分析

張巧智，畢 爽，馬文君，李 楊，隋曉楠，江連洲*

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

水酶法水解液中大豆多肽的吸附純化及其氨基酸組成分析

張巧智，畢 爽，馬文君，李 楊，隋曉楠，江連洲*

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

考察大孔吸附樹脂對水酶法水解液中大豆多肽的吸附性能和純化效果，通過靜態吸附和解吸實驗對8種樹脂進行了初步篩選，并進一步研究了上樣體積、上樣流速、解吸劑體積分數等條件對大孔吸附樹脂純化能力的影響。結果表明：DA201-C大孔吸附樹脂對水酶法大豆多肽的吸附性能優于其他7 種樹脂，其最佳動態吸附工藝為：上樣體積140 mL、上樣流速1.5 mL/min、水洗體積350 mL，體積分數25%、50%、75%、100%乙醇溶液分級洗脫，每次80 mL，流速2 mL/min。經純化后各大豆多肽組分純度均在80%以上，總回收率為95.65%，樹脂吸附量為13.32 mg/g，糖類及鹽類雜質分別降低51%及90%以上；乙醇分級洗脫可分離4 個大豆多肽組分，其中75%體積分數組分SP-DA75氧自由基清除能力最強，肽段的抗氧化性與其疏水性氨基酸含量及酸性氨基酸含量具有一定相關性。

水酶法；大豆多肽；大孔吸附樹脂；純化；氨基酸組成

傳統的大豆油制取方法主要有壓榨法和浸出法，這些方法雖然可制得95%以上的油脂，但易導致蛋白質變性，難以進一步利用，造成蛋白質資源的巨大浪費，而且存在設備復雜、有害溶劑殘留、生產安全性差等問題[1-2]。水酶法作為一種新興的綠色提油技術，它以機械破碎和酶解為手段，萃取條件溫和，所制油品質高，同時分離得到的蛋白可進行深加工，進一步應用于多種食品體系[3-5]。與此同時，提油過程中酶的作用會伴隨大豆蛋白的有限水解，釋放短鏈多肽，大豆多肽已被證明具有調節免疫、抗病毒、抗氧化、降低血壓、降低膽固醇等多種生理功能[6-7]，雖活性稍低，但來源廣泛，廉價易得，食用安全性高，前景十分廣闊。水酶法工藝中低分子大豆多肽主要存在于酶解離心后的水相——水解液中，水解液中同時還存在著不完全水解的大分子蛋白、可溶性低聚糖及少量細小油滴[8-9]，此外，為中和酶解過程中肽鍵斷裂產生的H+維持體系pH值而持續加入的堿液，也增加了酶解物中的鹽分含量[7,10]，這些物質的存在影響了產品感官特性以及后續生物活性肽的效用發揮，也極大地限制了其在食品等領域的應用，因此，對水解液中雜質的去除以及潛在功能性大豆多肽的分離純化研究對水酶法副產物增值及產業化推廣具有重要意義。

大孔吸附樹脂作為一類新型的非離子型吸附劑，是由苯乙烯、二乙烯苯、二甲丙烯酸酯等聚合而成的具有網狀孔穴結構的高聚物，兼具吸附和分子篩功能，可根據分離物分子大小及極性差異進行分離。同時由于樹脂與分離物之間為物理吸附作用，被吸附物解吸容易，理化性質影響小，且具有成本低廉、操作簡單、選擇性好、再生容易等優點[11-12]，已逐漸在生物活性物質純化領域得到應用。如馬寒冰等[12]研究發現DA201-C型大孔吸附樹脂對大豆多肽的吸附和脫鹽效果最佳；Zhu Kexue等[13]利用大孔吸附樹脂對麥芽蛋白水解物中的鋅螯合肽進行純化處理，脫鹽率和肽回收率均較理想。氧自由基清除能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）是目前國內外應用較廣的體外抗氧化活性判定方法，具有靈敏度高、穩定性好、與體內實驗相關性強等優點，被最新推薦為抗氧化能力測定的標準方法之一[7,14]。

本研究以大豆水酶法提油后的水解液為原料，通過靜態及動態吸附、解吸實驗，確定純化大豆多肽的最佳吸附條件，進一步利用不同體積分數乙醇溶液對大豆多肽分級洗脫，以ORAC值為指標評價不同洗脫組分的抗氧化能力，并與氨基酸組成相聯系，探討不同的氨基酸種類對其抗氧化活性的貢獻，為后續水酶法大豆多肽的富集純化、活性研究以及工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東北大豆（水分含量9.83%，脂肪含量21.54%，蛋白含量39.12%，灰分含量4.20%） 黑龍江紅興隆農墾沃野有機食品有限公司；堿性蛋白酶Protex 6L（580 000 DU/g，適宜溫度25～70 ℃，適宜pH 7.0～10.0）杰能科（中國）生物工程有限公司；D101、DA201-C、X-5、D3520、AB-8、DM130、NKA-Ⅱ、S-8大孔吸附樹脂 天津浩聚樹脂科技有限公司；氨基酸混合標準品、熒光素鈉、自由基產生劑2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽鹽酸（2,2’-azobis-2-amidinopropanedihydrochloride，AAPH）、抗氧化標準物質Trolox 美國Sigma-Aldrich公司；氫氧化鈉、氯化鈉、無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、石油醚等均為分析純。

1.2 儀器與設備

T20型雙螺桿擠壓機 法國Clextral公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；PHS-25數顯臺式酸度計、DDS-11A數顯電導率儀 上海雷磁儀器廠；10 kD平板聚醚砜超濾膜、MSC300杯式超濾器 上海摩速科學器材有限公司；GL-21M高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司；RE-52CS-1旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；FD5冷凍干燥機 美國西盟國際集團；K-436快速消解儀、K-370自動凱氏定氮儀 瑞士步琦有限公司；SX2-4-10箱式電阻爐 上海嘉展儀器設備有限公司；大孔吸附樹脂層析柱（2.6 cm×30 cm） 鹽城普瑞奇實驗儀器有限公司；BS-1E恒溫振蕩培養箱 金壇市科析儀器有限公司；BT300-2J精密蠕動泵 保定蘭格恒流泵有限公司；DBS-160電腦自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠；JK-UVS-752N紫外分光光度計 上海精學科學儀器有限公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；Synergy多動能酶標儀 美國Bio-Tek公司。

1.3 方法

1.3.1 化學組成測定

水分含量依據GB/T 5497—1985《糧食、油料檢驗水分測定法》進行測定；粗脂肪含量依據GB/T 5512—2008《糧油檢驗：糧食中粗脂肪含量測定》進行測定；粗蛋白含量依據GB/T 6432—1994《飼料中粗蛋白測定方法》進行測定；灰分含量依據GB/T 5508—2008《糧油檢驗：灰分測定法》進行測定；總糖含量采用苯酚-硫酸法[12]進行測定；大豆多肽含量依據李艷等[11]的方法進行測定。

1.3.2 水酶法大豆粗肽的制備

水解液作為大豆水酶法提油的副產物，本研究采用的酶解條件為已有研究[15-16]優化的兼顧油脂和蛋白提取的最佳工藝，由于水解液中含有的少量油滴會影響后續對大豆多肽的超濾回收，因此對水解液進行脫脂處理，其主要流程如下：

大豆原料→粉碎→調節水分含量為18%→擠壓膨化（70 ℃，300 r/min）→粉碎過60 目篩→調節固液比為1∶6（mg/mL）→調節溫度為50 ℃，pH 9→酶解3 h（加酶量為1.85 mL/100 g）→滅酶（100 ℃，10 min）→離心分離（10 000 r/min，20 min）→收集水解液和乳狀液于分液漏斗中，4 ℃保存10 h→水解液→冷凍干燥→脫脂（石油醚，正己烷以固液比1∶10（g/mL）各脫脂2 次，每次1 h）→低溫脫溶→大豆酶解蛋白

生物活性肽分子質量一般較低，為避免未完全水解的大分子蛋白對后續純化的影響，利用10 000 D超濾膜對上述酶解蛋白復溶液（10%干物質質量分數）在室溫條件下，壓力0.22 MPa超濾3 h，收集濾液，濃縮后冷凍干燥得到大豆粗肽。

1.3.3 大孔吸附樹脂的預處理

將樹脂用無水乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，然后用無水乙醇充分洗滌以除去上層漂浮的固體雜質及破碎樹脂，再用去離子水洗至無乙醇味，然后分別用5% HCl溶液和2% NaOH溶液洗滌，最后用去離子水洗至中性，抽濾備用[10-11]。

1.3.4 大孔吸附樹脂對水酶法大豆多肽的靜態吸附

1.3.4.1 最佳吸附樹脂的篩選

不同型號的樹脂適用于分離物質的特性不同，為篩選出吸附水酶法大豆多肽的最佳樹脂，本實驗選取了極性和孔徑各異的8 種樹脂，分別為：D101、DA201-C、X-5、D3520、AB-8、DM130、NKA-II、S-8，其各項參數列于表1。稱取上述已處理好的樹脂各2 g于250 mL具塞錐形瓶中，分別加入大豆粗肽液30 mL （10 mg/mL），將錐形瓶封好后放入恒溫搖床中振蕩24 h（25 ℃，150 r/min），使樹脂與粗肽液充分接觸，振蕩結束后抽濾分離出液體，測定吸附前后粗肽液中的多肽質量濃度，計算并比較不同型號大孔吸附樹脂對水酶法得到大豆多肽的吸附率和吸附量，計算如式（1）、（2）所示[11-12]：

式中：C0為原溶液多肽質量濃度/（mg/mL）；C1為吸附后溶液多肽質量濃度/（mg/mL）；V0為原溶液體積/mL；M1為濕樹脂質量/g。

1.3.4.2 靜態吸附曲線的繪制

向250 mL錐形瓶中加入2 g處理好的樹脂，向其中加入30 mL質量濃度為10 mg/mL超濾后的大豆粗肽液，用塞子封好后放入恒溫搖床中振蕩12 h（25 ℃，150 r/min），每隔1 h取液，測定吸附后溶液中的多肽質量濃度、總糖含量及電導率值，并按公式（1）、（2）計算大豆多肽的吸附率和吸附量，繪制靜態吸附曲線。

1.3.5 水酶法水解液中大豆多肽的動態吸附及乙醇分級洗脫

采用濕法裝柱將100 g處理后的大孔吸附樹脂裝入2.6 cm×30 cm層析柱中，距柱口約3～4 cm。用去離子水平衡柱子至流出液電導率保持不變時，將質量濃度為20 mg/mL的大豆粗肽液分別以0.5、1.5、2.5 mL/min流速上柱，并檢測流出液的多肽質量濃度，以吸附曲線偏離基線為透過點，確定最佳上樣體積及上樣質量。

上樣液被吸附后，先用去離子水洗滌層析柱，流速為2 mL/min，流出液每10 mL收集一管，測定其電導率值及糖含量，當二者趨于平緩時，依次用25%、50%、75%和100%體積分數乙醇各80 mL進行分級洗脫（流速2 mL/min），洗脫液每10 mL收集一管，測定其多肽質量濃度，繪制動態解吸曲線，收集各自洗脫液，濃縮冷凍干燥即得純化后的水酶法水解液中大豆多肽，并按式（3）計算多肽回收率[7,17]：

式中：C0為原溶液中多肽質量濃度/（mg/mL）；C2為洗脫液中多肽質量濃度/（mg/mL）；V1為上樣液體積/mL；V2為洗脫液體積/mL。

1.3.6 大豆多肽乙醇分級洗脫組分的氨基酸組成測定

按照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》方法，利用氨基酸分析儀測定脫脂大豆粉、水酶法水解液以及各分級洗脫大豆多肽組分的氨基酸組成。

1.3.7 ORAC值測定

對大豆多肽的ORAC值測定參照文獻[18-19]的方法，并做適當調整：在96 孔酶標板中依次加入各大豆多肽樣品20 μL（質量濃度為1 mg/mL，用75 mmol/L磷酸鹽緩沖液配制），同時加入不同濃度Trolox作為對照，再

用多道移液器在每孔中加入20 μL 70 nmol/L熒光素鈉，37 ℃反應15 min后，迅速加入140 μL 12.5 mmol/L AAPH誘發反應，并將微孔板置于酶標儀中在37 ℃、激發波長485 nm、發射波長535 nm條件下進行測定，每1 min測定一次各孔熒光強度，連續測定80 min。繪制各樣品熒光強度-時間曲線即熒光衰減曲線，采用積分法計算曲線下面積（AUC樣品）。將樣品保護面積（AUC樣品-AUC空白）與不同濃度標準物Trolox保護面積（AUCTrolox-AUC空白）相較得到ORAC值，即Trolox當量（μmol/L）。

2 結果與分析

2.1 水酶法水解液的化學組成

表1 水酶法大豆水解液的主要化學組成（占干物質質量分數）Table1 Major chemical components of soybean protein hydrolysate from aqueous enzymatic extraction of soybean oil (on a dry matter basis) %

由表1可知，水解液中約含有11.4%干物質，其中有58.98%蛋白質（17.34%為大豆多肽）、6.7%脂肪、26.42%碳水化合物以及7.89%灰分。這一結論與已有研究[8,20]報道的以類似工藝制得的水解液組分相似。若以1 kg大豆原料產生4.5 kg水解液計[20]，水解液中將含有大豆中約77%的蛋白質、16%的脂肪以及54%的糖類。經脫脂和超濾處理后，水解液中的油脂及部分大分子蛋白被除去，蛋白質含量有所下降但多肽含量增加近3 倍，此外，由于水解液中的可溶性碳水化合物（主要為低聚糖）和鹽類物質可透過超濾膜，因此含量均有所增加，這些物質的存在極大地限制了肽類產品在食品及保健品領域的應用，需進行進一步純化。

2.2 水酶法水解液中大豆多肽的靜態吸附

2.2.1 最佳大孔吸附樹脂的篩選

表2 不同大孔吸附樹脂對水酶法水解液中大豆多肽的吸附能力Table2 Adsorption capacities of different MARs for soybean peptides

不同型號的樹脂對目標物的選擇吸附性不同，本研究首先考察了8 種極性、孔徑和比表面積各異的樹脂對水酶法水解液中大豆多肽的吸附性能，結果見表2。

由表2可知，樹脂對大豆多肽的吸附能力與其極性有關，極性樹脂的吸附效果較差，如S-8吸附率僅為36.57%，而弱極性和非極性樹脂的吸附率較高，其中DA201-C的吸附率和吸附量均高于其他樹脂，分別為84.15%和62.76 mg/g，D101和D3520的吸附能力與DA201-C較接近，其次是X-5。在水酶法提油工藝中，隨著酶解時間的延長，大豆蛋白被逐漸水解，致使更多的疏水集團暴露，它們可通過疏水相互作用吸附在樹脂的表面及孔徑中[17]。當樹脂極性相同時，樹脂的吸附能力與其比表面積密切相關，如表2所示，弱極性樹脂DM130 （500～550 m2/g）的吸附率和吸附量均高于同極性的AB-8（480～520 m2/g）。因樹脂的表面張力隨比表面積增加而增大且超濾后水酶法大豆多肽分子質量多集中于10 kD以下，因此較大比表面積的樹脂吸附效果較好，本研究中DA201-C的比表面積約是其他非極性樹脂的2 倍以上，對小分子大豆多肽有更強的物理吸附力，因此選擇DA201-C作為水酶法大豆多肽后續純化所用樹脂，這一結果與林利美[21]、Lu Rongrong[22]等的研究一致。

2.2.2 靜態吸附曲線的繪制

圖1 DA201-C大孔吸附樹脂對水酶法大豆多肽的靜態吸附曲線Fig.1 Static adsorption curves of DA201-C resin for soybean peptides

由圖1可知，DA201-C大孔吸附樹脂對多肽的吸附屬于快速平衡型，即在最初的2 h內，吸附率迅速上升，2 h時吸附率已接近80%，而3 h之后增幅明顯趨緩，直至5 h后基本保持不變，此時樹脂對多肽的吸附已達平衡狀態，吸附率和吸附量分別為84.15%和62.76 mg/g。同時，從流出液中總糖含量的變化曲線可以看出，樹脂對多肽粗液中的糖有少量吸附，但遠低于對多肽的吸附能力，吸附平衡時，剩余溶液中仍含有原溶液60%以上的糖類物質，利用DA201-C樹脂對水酶法大豆多肽和糖類具有不同吸附能力，且對鹽類幾乎不吸附的特點（吸附液電導率幾乎不變），可以達到除去雜質、富集大豆多肽的目的。

2.3 水酶法水解液中大豆多肽的動態吸附及分級洗脫

2.3.1 大孔吸附樹脂對水酶法水解液中大豆多肽的動態吸附

圖2 不同流速對DA201-C大孔吸附樹脂吸附性能的影響Fig.2 Effects of sample loading volume on the adsorption capacity of DA201-C resin for soybean peptides

樣品質量濃度20 mg/mL，上樣流速分別為0.5、1.5、2.5 mL/min時大豆多肽的吸附透過曲線見圖2。上樣流速對樹脂的吸附性能有決定性作用，其原理主要是影響了被吸附物質向樹脂的擴散程度。當樣品流速較快時，被吸附物質來不及擴散到樹脂孔隙中就被迫流下，造成吸附量下降；而當樣品流速較低時，雖然樣品與樹脂可充分接觸，但吸附時間就會延長，吸附效率隨之降低[16,22-25]。因此，需綜合考慮樹脂的吸附能力和吸附效率確定最佳的上樣流速。由圖2可知，當流速從1.5 mL/min增加到2.5 mL/min，吸附曲線斜率明顯增大，穿透點體積從140 mL下降到120 mL，而當流速從0.5 mL/min增加到1.5 mL/min，穿透點略有下降而吸附曲線斜率幾乎保持不變，此時加快流速可縮短生產周期，因此選擇1.5 mL/min為最佳上樣流速，此時上樣體積和上樣質量分別為140 mL和2 800 mg。

2.3.2 大孔吸附樹脂對水酶法大豆多肽的分級洗脫

粗肽液經吸附平衡后，先用去離子水洗滌層析柱以洗去與樹脂結合較弱的無機鹽和糖類物質，當流出液電導率近似于初始數值時，依次用體積分數為25%、50%、75%和100%的乙醇溶液各80 mL進行洗脫（流速2 mL/min）。圖3為DA201-C大孔吸附樹脂對水酶法大豆多肽的動態解吸過程中洗脫液電導率、糖含量和多肽質量濃度隨洗脫體積的變化曲線。

圖3 DA201-C大孔吸附樹脂對水酶法大豆多肽的動態解吸曲線Fig.3 Dynamic desorption curves of DA201-C resin for soybean peptides

由圖3可知，最初流出液的電導率和糖含量隨著水洗的進行而逐漸增大，約在30 mL和50 mL體積處達到峰值，當水洗體積超過350 mL后二者趨于穩定，說明此時層析柱中可被脫除的鹽類和糖類物質已基本流出，因此可確定水洗體積為350 mL。然后換做不同體積分數乙醇溶液對大豆多肽進行分級洗脫，可被分離成SP-DA25、SP-DA50、SP-DA75、SP-DA100共4 個組分，各組分多肽回收率分別為14.14%、20.81%、39.20%和21.50%（表3），大豆多肽總回收率為95.65%，樹脂吸附量為13.32 mg/g。因動態吸附時多肽粗液與樹脂的接觸時間較短，因此此時吸附量也低于靜態吸附時的吸附量。

2.4 水酶法大豆多肽純化效果分析

根據上述純化實驗結果，確定水酶法大豆多肽的純化工藝條件為：上樣體積140 mL（上樣質量2 800 mg）、流速1.5 mL/min、水洗體積350 mL，25%、50%、75%、100%乙醇溶液依次洗脫，每次80 mL，流速為2 mL/min。在該條件下對大豆粗肽液進行吸附，分別收集洗脫液經真空旋蒸濃縮和冷凍干燥后得到水酶法大豆多肽組分，其化學組成見表3。

表3 DA201-C大孔吸附樹脂對水酶法大豆多肽的純化效果Table3 Purification of soybean peptides using DA201-C resin

大孔吸附樹脂與被吸附物質間主要為疏水相互作用且作用力較弱，解吸劑乙醇的加入可改變體系的親水-疏水平衡，引起多肽或雜質組分的吸附或解吸[21,26-27]，因此可根據乙醇體積分數對大豆多肽進行分級洗脫。由表3可知，隨著解吸劑乙醇體積分數的增加，大豆多肽組分的純度隨之上升，當乙醇體積分數為75%時，純化效果最優，其多肽含量增加了36.31%，糖含量和灰分含量分別降低了65.81%和98.21%，這一結果與李華等[7]的研究報道一致。且不論在哪一種洗脫劑體積分數條件下，多肽組分純度均在80%以上，脫鹽率和脫糖率分別在90%和51%以上，說明采用DA201-C大孔吸附樹脂對樣品中的鹽類、糖類等雜質成分有顯著的去除效果，可有效達到富集純化的目的。

2.5 大豆多肽組分的ORAC值

圖4 Trolox（a）及大豆多肽洗脫組分（b）的熒光衰變曲線Fig.4 Fluorescence decay curves of Trolox at different concentrations and soybean peptide fractions

由圖4a可知，隨著Trolox濃度的增加，達到熒光衰變曲線的時間從0 μmol/L的35 min增加至80 μmol/L的73 min，且熒光衰變曲線下的面積隨著Trolox濃度的增加而增大，Trolox濃度與熒光衰變曲線下的保護面積間的關系可用線性方程：y=5 360x+17 933（R2=0.993 0）表示。由圖4b可知，不同體積分數乙醇洗脫組分的抗氧化活性有所不同，其中SP-DA25及SP-DA50組分ORAC值較低，分別為51.05 μmol/L和58.58 μmol/L，其次是SP-DA100組分為63.96 μmol/L，75%乙醇溶液洗脫組分SP-DA75的ORAC值最高，為72.81μmol/L，較純化前提高了200%，說明經大孔吸附樹脂純化后大豆多肽的抗氧化性有顯著提升。

2.6 水酶法水解液中大豆多肽的氨基酸組成分析

根據上述純化工藝，對所得的大豆多肽組分進行氨基酸組成分析，并與水酶法水解液的氨基酸組成進行對比，結果見表4。

表4 水酶法大豆多肽組分的氨基酸組成Table4 Amino acid composition and ORAC of soybean peptide fractions

氨基酸組成是評定蛋白及多肽營養價值的重要指標之一[24]，尤其對于肽類物質而言，其氨基酸的組成、數量及序列直接決定了其特有的生物活性[25]。由表4可知，水酶法水解液中氨基酸的分布與大豆原料相似，除甲硫氨酸（大豆的第一限制氨基酸）含量稍低外，含有其余8 種必需及半必需氨基酸（色氨酸除外）。Latif等[24]研究發現水酶法花生水解液中必需氨基酸的含量較溶劑提取和冷榨后粕中必需氨基酸的含量高，說明酶解的溫和作用，對大豆蛋白的破壞較少。經過大孔吸附樹脂的純化作用，水酶法大豆多肽中各氨基酸百分含量普遍有所提升，且隨著洗脫乙醇體積分數的增加，大豆多肽組分中疏水性氨基酸的含量呈顯著上升趨勢，75%乙醇溶液洗脫時含量最高，說明DA201-C大孔吸附樹脂可通過疏水性強弱利用不同體積分數的乙醇對大豆多肽進行分離。張曉梅等[25]通過乙醇體積分數變化分離大豆降膽固醇肽，結果同樣發現各分離組分具有疏水性差異且75%體積分數組分疏水性最高。

比較圖4b可知，隨著大豆多肽組分疏水性的增加，對氧自由基的淬滅能力呈上升趨勢，75%體積分數時達到最高，說明肽鏈中疏水性組分的存在與其抗氧化活性有一定關聯；李華等[7]在對黑豆肽抗氧化性與其氨基酸組成的關系研究中也發現隨著組分疏水性的增加，其自由基清除能力總體呈現上升趨勢。與此同時，75%及100%洗脫組分中含有較多的谷氨酸（16.48%、16.19%）和天冬氨酸（9.35%、9.16%），該兩種為酸性氨基酸，可作為質子供體發揮抗氧化作用，如Jiang[26]、Najafian[27]、Plundrich[28]、程云輝[29]等均報道了含有酸性氨基酸的抗氧化肽。以上是從氨基酸組成出發探討不同種類的氨基酸對水酶法大豆多肽抗氧化活性的貢獻，肽的活性同樣與其氨基酸序列、電荷性質、分子結構密切相關，這些均需要進一步分離純化、結構鑒定以及體外、體內實驗進行驗證。

3 結 論

水解液作為水酶法工藝的主要副產物之一，含有大豆中絕大多數的可溶性成分，僅作為廢棄物會造成大豆蛋白資源的巨大浪費，尤其是其中含有的低分子肽類，可作為功能性食品添加劑、保健食品的原料來源，具有可觀的開發前景。本研究采用大孔吸附樹脂對水酶法水解液中的大豆多肽進行吸附純化處理：通過靜態吸附試驗確定DA201-C大孔吸附樹脂對大豆多肽的吸附能力優于其他7種樹脂，其吸附率和吸附量分別為84.15%和62.76 mg/g；通過動態吸附及分級洗脫實驗，確定純化最佳工藝為：上樣體積140 mL（上樣質量2 800 mg）、上樣流速1.5 mL/min、水洗體積350 mL，25%、50%、75%、100%乙醇溶液各80 mL分級洗脫，流速2 mL/min。經純化后各大豆多肽組分純度均在80%以上，總回收率

為95.65%，樹脂吸附量為13.32 mg/g，糖類及鹽類雜質顯著減少；乙醇分級洗脫可分離4 個大豆多肽組分，其中75%體積分數組分SP-DA75的ORAC值最強，肽段的抗氧化性與其疏水性氨基酸含量及酸性氨基酸含量有一定關聯。DA201-C大孔吸附樹脂綜合性能較好，能有效脫除大豆多肽中的鹽分等雜質成分，可作為一種純化水酶法大豆多肽的有效方法，為后續進一步分離純化、活性鑒定及工業化生產提供了實驗依據。

[1] 江連洲, 李楊, 王妍, 等. 水酶法提取大豆油的研究進展[J]. 食品科學, 2013, 34(9): 346-350. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201309069.

[2] 李楊, 江連洲, 楊柳. 水酶法制取植物油的國內外發展動態[J]. 食品工業科技, 2009, 30(6): 383-387. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2009.06.094.

[3] 楊柳, 江連洲, 李楊, 等. 水酶法提取的大豆蛋白功能特性研究[J].食品與發酵工業, 2010, 36(6): 80-84. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ ts.2010.06.013.

[4] 李楊, 張雅娜, 王歡, 等. 水酶法提取大豆油與其他不同種大豆油品質差異研究[J]. 中國糧油學報, 2014, 29(6): 46-52. DOI:10.3969/ j.issn.1003-0174.2014.06.009.

[5] CAMPBELL K A, GLATZ C E, JOHNSON L, et al. Advances in aqueous extraction processing of soybeans[J]. Journal of American Oil Chemist Society, 2011, 88: 449-465. DOI:10.1007/s11746-010-1724-5.

[6] SAMARANAYAKA A G P, LI-CHAN E C Y. Food-derived peptidic antioxidants: a review of their production, assessment, and potential applications[J]. Journal of Functional Foods, 2011, 3: 229-254. DOI:10.1016/j.jff.2011.05.006.

[7] 李華, 劉恩岐, 唐仕榮, 等. 酶法制備黑豆抗氧化肽及其分離純化與氨基酸組成分析[J]. 食品科學, 2013, 34(9): 271-276. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201309055.

[8] de MOURA B J M L N, MAURER D, YAO L, et al. Characteristics of oil and skim in enzyme-assisted aqueous extraction of soybeans[J]. Journal of American Oil Chemist Society, 2013, 90: 1079-1088. DOI:10.1007/s11746-013-2248-6.

[9] CAMPBELL K A, GLATZ C E. Protein recovery from enzymeassisted aqueous extraction of soybean[J]. Biotechnology Progress, 2010, 26(2): 488-495. DOI:10.1002/btpr.341.

[10] 劉彬, 曹棟, 孟慶然. 超濾技術結合大孔吸附樹脂純化低聚果糖[J]. 食品與機械, 2016, 32(2): 133-138. DOI:10.13652/ j.issn.1003-5788.2016.02.034.

[11] 李艷, 孫海燕, 周麗珍, 等. 大孔樹脂純化血管緊張素酶抑制肽VLPVPR的工藝優化[J]. 食品工業科技, 2014, 35(6): 206-211. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2014.06.038.

[12] 馬寒冰, 廖永紅, 徐曼, 等. DA201-C大孔吸附樹脂純化大豆多肽條件優化[J]. 中國調味品, 2014, 39(9): 43-48. DOI:10.3969/ j.issn.1000-9973.2014.09.012.

[13] ZHU Kexue, WANG Xiaoping, GUO Xiaona. Isolation and characterization of zinc-chelating peptides from wheat germ protein hydrolysates[J]. Journal of Functional Foods, 2015, 12: 23-32. DOI:10.1016/j.jff.2014.10.030.

[14] éVA B P, SALI N, K?SZEGI T, et al. Antioxidant potential, tannin and polyphenol contents of the seed and pericarp of three Coffea species[J]. Asian Pacifc Journal of Tropical Medicine, 2016, 4: 366-371. DOI:10.1016/j.apjtm.2016.03.014.

[15] 李楊, 江連洲, 張兆國, 等. 模糊評判優化水酶法提取膨化大豆油脂和蛋白[J]. 農業工程學報, 2010, 26(2): 375-380. DOI:10.3969/ j.issn.1002-6819.2010.02.066.

[16] LI Y, SUI X, QI B, et al. Optimization of ethanol-ultrasound-assisted destabilization of a cream recovered from enzymatic extraction of soybean oil[J]. Journal of American Oil Chemist Society, 2014, 91(1): 159-168. DOI:10.1007/s11746-013-2352-7.

[17] 李艷, 孫海燕, 周麗珍, 等. 大孔吸附樹脂純化重組降血壓肽VLPVPR的研究[J]. 食品工業科技, 2014, 35(7): 284-288. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2014.07.015.

[18] OU B, HAMPSCH-WOODILL M, PRIOR R L. Development and validation of an improved oxygen radical absorbance capacity assay using fuorescein as the fuorescent probe[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49: 4619-4626. DOI:10.1021/jf010586o.

[19] CAO G, ALESSIO H M, CULTER R. Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants[J]. Free Radical Biological Medicine, 1993, 14: 303-311. DOI:10.1016/0891-5849(93)90027-R.

[20] JULIANA M L N D M, BLANCA H L, NEIVA M D A, et al. Lunasin and BowmanBirk protease inhibitor concentrations of protein extracts from enzyme-assisted aqueous extraction of soybeans[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59: 6940-6946. DOI:10.1021/ jf200183m.

[21] 林利美, 胡勤玲, 王申, 等. 大孔吸附樹脂對草魚肽的脫鹽作用[J].食品科學, 2014, 35(5): 33-36. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201405007.

[22] LU R, QIAN P, SUN Z, et al. Hempseed protein derived antioxidative peptides: purification, identification and protection from hydrogen peroxide-induced apoptosis in PC12 cells[J]. Food Chemistry, 2010, 123: 1210-1218. DOI:10.1016/j.foodchem.2010.05.089.

[23] LI Z, JIANG A, YUE T, et al. Purifcation and identifcation of fve novel antioxidant peptides from goat milk casein hydrolysates[J]. Journal of Dairy Science, 2013, 96(7): 4242-4251. DOI:10.3168/ jds.2012-6511.

[24] LATIF S, PFANNSTIEL J, MAKKAR H P S, et al. Amino acid composition, antinutrients and allergens in the peanut protein fraction obtained by an aqueous enzymatic process[J]. Food Chemistry, 2013, 136: 213-217. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.07.120.

[25] 張曉梅, 鐘芳, 麻建國. 大豆降膽固醇活性肽的初步分離純化[J]. 食品與機械, 2006, 22(2): 33-36. DOI:10.3969/ j.issn.1003-5788.2006.02.010.

[26] JIANG L, WANG B, LI B, et al. Preparation and identification of peptides and their zinc complexes with antimicrobial activities from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) protein hydrolysates[J]. Food Research International, 2014, 64(13): 91-98. DOI:10.1016/ j.foodres.2014.06.008.

[27] NAJAFIAN L, BABJI A S. Production of bioactive peptides using enzymatic hydrolysis and identification antioxidative peptides from patin (Pangasius sutchi) sarcoplasmic protein hydolysate[J]. Journal of Functional Foods, 2014, 9(1): 280-289. DOI:10.1016/j.jff.2014.05.003.

[28] PLUNDRICH N J, WHITE B L, DEAN L L, et al. Stability and immunogenicity of hypoallergenic peanut protein-polyphenol complexes during in vitro pepsin digestion[J]. Food and Function, 2015, 6: 2145-2154. DOI:10.1039/c5fo00162e.

[29] 程云輝, 曾知音, 郭建偉, 等. 抗氧化肽的酶法制備及其構效關系的研究進展[J]. 食品與機械, 2009, 25(6): 174-180. DOI:10.13652/ j.issn.1003-5788.2009.06.003.

Purification and Amino Acid Composition of Peptides from Soybean Byproduct Protein Hydrolysate from Aqueous Enzymatic Extraction of Soybean Oil

ZHANG Qiaozhi, BI Shuang, MA Wenjun, LI Yang, SUI Xiaonan, JIANG Lianzhou*
(School of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

In this paper, the adsorption performances and purification efficiencies of 8 macroporous adsorption resins (MARs) for peptides from soybean byproduct protein hydrolysate from aqueous enzymatic extraction of soybean oil were comparatively evaluated by static adsorption and desorption experiments in order to find the best one among these MARs. Further, the effects of feeding volume, feeding rate and desorbent concentration on the purification efficiency of MARs were investigated. Results showed that DA201-C resin had the highest adsorption capability for soybean peptides among 8 resins tested. The optimum dynamic adsorption conditions of DA201-C resin were determined as follows: sample loading volume, 140 mL; feeding flow rate, 1.5 mL/min; 350 mL of water as washing solvent; and fractional elution with 25%, 50%, 75% and 100% using 80 mL of each concentration gradient at 2 mL/min flow rate. Under these conditions, the purity of the purified soybean peptides reached above 80% with a total recovery of 95.65% and a removal rate of more than 90% and 51% for salt and sugar impurities, respectively, and the adsorption capacity of DA201-C resin was 13.32 mg/g. Four soybean peptide fractions were separated by fractional elution with ethanol. A fraction eluted with 75% ethanol, SP-DA75, showed the highest oxygen radical adsorption capacity (ORAC) among the four fractions. Moreover, there was a correlation between antioxidant activities of peptide fragments and their contents of hydrophobic amino acids and acidic amino acids. In conclusion, DA201-C resin exhibited excellent adsorption performance and could be applied as an effective method to purify soybean peptides.

aqueous enzymatic extraction; soybean peptide; macroporous adsorption resin; purification; amino acid composition

10.7506/spkx1002-6630-201622016

TS229

A

1002-6630（2016）22-0112-07

張巧智, 畢爽, 馬文君, 等. 水酶法水解液中大豆多肽的吸附純化及其氨基酸組成分析[J]. 食品科學, 2016, 37(22): 112-118. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622016. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Qiaozhi, BI Shuang, MA Wenjun, et al. Purification and amino acid composition of peptides from soybean byproduct protein hydrolysate from aqueous enzymatic extraction of soybean oil[J]. Food Science, 2016, 37(22): 112-118. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622016. http://www.spkx.net.cn

2016-02-29

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2014BAD22B00）；國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2013AA102101）；黑龍江省自然科學基金項目（ZD201302）；高等學校博士學科點專項科研基金項目（20132325110013）

張巧智（1990—），女，博士研究生，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：miumiulovelife@163.com

*通信作者：江連洲（1960—），男，教授，博士，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：jlzname@163.com