菌酶協同處理金槍魚暗色肉制備飼用肽的研究

趙小惠，吳麗娜，楊宇杰，方旭波，2*，余輝，袁高峰，張銀照

（1.浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江舟山316022；2.浙江省水產品加工技術研究聯合重點實驗室，浙江舟山316022；3.浙江豐宇海洋生物制品有限公司，浙江舟山316104）

菌酶協同處理金槍魚暗色肉制備飼用肽的研究

趙小惠1，吳麗娜1，楊宇杰1，方旭波1，2*，余輝1，袁高峰1，張銀照3

（1.浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江舟山316022；2.浙江省水產品加工技術研究聯合重點實驗室，浙江舟山316022；3.浙江豐宇海洋生物制品有限公司，浙江舟山316104）

本試驗以金槍魚暗色肉為原料，主要研究了枯草芽孢桿菌和中性蛋白酶協同發酵制備飼用肽的最佳工藝條件。以飼用肽的小肽含量為指標，利用單因素試驗和正交試驗考察了發酵溫度、發酵時間、接種量、加酶量等因素對飼用肽中小肽含量的影響。最佳菌酶協同工藝為：發酵溫度37℃、發酵時間48 h、接種量2%（V/m）、加酶量200 U/g。在此條件下，小肽含量從28.89 mg/g提高到了185.59 mg/g，氨基酸組成平衡，蛋白質相對分子質量主要分布在6.5～14.4 kD，大分子蛋白得到有效降解。

金槍魚暗色肉；菌酶協同處理；飼用肽

金槍魚在加工過程中會產生高達三成以上的魚肉、魚骨、魚皮和內臟等下腳料，其中暗色肉占50%以上。但是由于加工技術滯后，小部分下腳料只能通過壓榨、烘干，被簡單加工成魚粉飼料；也有部分被直接丟棄，這既造成資源浪費，又污染了環境，導致產品資源利用率和附加值較低（胡靜，2015）。目前，對于金槍魚暗色肉等下腳料的高值化加工利用主要通過酶解法制備飼料肽，對金槍魚暗色肉的微生物發酵研究較少。研究表明，采用微生物發酵法制備肽能夠提高飼用肽的適口性，提高小肽含量和蛋白質含量，提高消化吸收利用率，而且省去了肽酶和脫苦的成本，簡化了生產工序（楊虹坤等，2015；劉峰等，2012）。應用較廣泛的蛋白飼料發酵菌種包括乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌等，其中枯草芽孢桿菌作為益生菌能通過調節腸道菌群平衡、防止腹瀉、提高免疫力等作用，促進動物生長，提高生產性能（祝天龍等，2015）。但是單純依靠微生物發酵作用所得的小肽含量并不高，而且發酵周期較長（張吉鹍，2010）。因此本試驗針對金槍魚下腳料暗色肉的原料特性，優化枯草芽孢桿菌和中性蛋白酶協同處理金槍魚暗色肉制備飼用肽的工藝條件，以提高飼用肽的利用率和營養價值，為實際生產飼用肽提供理論指導與技術支撐。

1　材料與方法

1.1試驗材料金槍魚熟制暗色肉，由浙江豐宇海洋生物制品有限公司提供；中性蛋白酶，由廣西南寧龐博生物工程有限公司提供；枯草芽孢桿菌，由浙江海洋學院食品與醫藥學院菌種保藏室提供；分子質量標準品：維生素B12（Mr1335，上海伯奧生物科技有限公司）、抑肽酶（Mr6500，美國Sigma公司）、細胞色素C（Mr14400，美國Sigma公司）、牛血清白蛋白（Mr66700，華美生物工程有限公司）。其他化學試劑均為分析純。

1.2儀器與設備LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；SPX-250B-Z生化培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HHS電熱恒溫水浴鍋，上海棱光技術有限公司；BS110電子分析天平，北京賽多利斯天平有限公司；四方均質器，鐵道部電化院四方電氣設備廠；DGC-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱，北京林茂科技有限公司；HYP-1004消化爐，上海纖檢儀器有限公司；KDN-9140MBE自動定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；UV-6000紫外分光光度計，蘇州江東精密儀器有限公司；Agilent 1100高效液相色譜儀，美國安捷倫有限公司；AKTA Purification10蛋白純化系統，瑞典安瑪西亞公司。

1.3培養基和營養液

1.3.1斜面培養基蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0 g，NaCl 5.0 g，MnSO4·H2O 5 mg，瓊脂15.0 g，蒸餾水1.0 L，pH 7.0。

1.3.2搖瓶培養基蛋白胨5.0 g，牛肉浸取物3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1.0 L，pH 7.0。

1.3.3營養液2%（NH4）2·SO4，0.5%葡萄糖，0.4%KH2PO4，0.1%MnSO4。

1.4方法

1.4.1種子液的制備參照孫宏（2013）的方法，從斜面培養基挑取一環枯草芽孢桿菌接入40 mL搖瓶培養基中，在250 mL的三角瓶中于37～40℃溫度下培養20～24 h，即得到種子液。

1.4.2飼用肽的制備精確稱取50 g金槍魚暗色肉，于121℃條件下滅菌15 min，冷卻到40～50℃。在無菌操作下添加一定量的種子液和一定量的中性蛋白酶，并加入50 mL的營養液調節物料含水量至30%～40%(m/m)。混合均勻后將物料分裝入若干個三角瓶中，用六層紗布封口。置于恒溫培養箱發酵一定時間后取出，50℃烘干，粉碎過80目篩后即得飼用肽，備用待測。

1.4.3菌酶協同工藝的單因素試驗

1.4.3.1發酵溫度對飼用肽的小肽含量的影響在發酵時間36 h，接種量1%（V/m），加酶量250 U/g條件下發酵，溫度分別選擇21、30、37、44℃，發酵結束后，測定飼用肽的小肽含量。

1.4.3.2發酵時間對飼用肽的小肽含量的影響在發酵溫度30℃，接種量1%（V/m），加酶量250 U/g條件下，分別發酵12、24、36、48、60 h，發酵結束后，測定飼用肽的小肽含量。

1.4.3.3接種量對飼用肽的小肽含量的影響在發酵溫度30℃，發酵時間36 h，加酶量250 U/g條件下，分別接種0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%（V/m）的種子液，發酵結束后，測定飼用肽的小肽含量。

1.4.3.4加酶量對飼用肽的小肽含量影響在發酵溫度30℃，發酵時間36 h，接種量1%（V/m）條件下，分別添加中性蛋白酶0、100、150、200、250、300、350 U/g，發酵結束后，測定飼用肽的小肽含量。

1.4.4菌酶協同工藝的正交優化試驗根據單因素試驗結果，以接種量、加酶量、發酵溫度、發酵時間為試驗因子，進行四因素三水平L9（34）的正交優化試驗，以飼用肽的小肽含量為指標，篩選出優化組合。

1.4.5飼用肽的測定項目及方法

1.4.5.1飼用肽常規成分分析粗蛋白質含量依據GB/T 5009.5—2010凱氏定氮法測定；粗脂肪含量依據GB/T 5512—2008測定；粗灰分含量依據GB/T 6438—2007測定。

1.4.5.2小肽含量測定飼用肽測定參照陳升軍等（2008）的方法。

1.4.5.3氨基酸成分分析氨基酸測定參照胡燃等（2015）的方法。

1.4.5.4飼用肽的蛋白質相對分子質量測定菌酶協同發酵后的金槍魚暗色肉蛋白經AKTA蛋白純化系統凝膠色譜柱分離后，與標準品比較。選用牛血清白蛋白、細胞色素C、抑肽酶、維生素B12作為相對分子量標準品。AKTA蛋白純化系統凝膠條件為流動相：0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.2；分析柱：Superdex75 10/300 GL預裝柱；色譜設備：AKTA蛋白純化系統；流速：1 mL/min；檢測波長：220 nm。

2　結果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1不同發酵溫度對小肽含量的影響由圖1可知，在23、30、37、44℃條件下發酵時，飼用肽的小肽含量分別較未發酵提高72.17、121.07、132.35、121.45 mg/g。在37℃下發酵時，小肽含量提高幅度最大，此時小肽含量為161.24 mg/g。當溫度為44℃時，小肽含量較37℃下降10.9 mg/g，這可能是由于溫度過高會影響枯草芽孢桿菌的生長繁殖，從而減小產酶量和減弱了蛋白酶的活力，同時影響中性蛋白酶的活力，因此飼用肽的小肽含量呈下降趨勢。所以可確定較佳的發酵溫度為37℃（圖1）。

2.1.2不同發酵時間對小肽含量的影響由圖2可知，在發酵12、24、36、48、60 h后，飼用肽的小肽含量分別較未發酵提高59.97、93.9、121.07、130.1、126.49 mg/g。發酵48 h時小肽含量提高幅度最大，小肽含量高達159.05 mg/g。發酵60 h后小肽含量呈現下降趨勢可能是部分小肽分解成為游離氨基酸；也可能是因為隨著發酵的進行，營養物質被消耗，營養物質的缺乏影響枯草芽孢桿菌代謝活動，大大減少蛋白酶的生成；也可能是發酵時間過長容易感染一些其他雜菌，產生的代謝產物會影響發酵環境。從生產成本考慮，確定48 h是較佳的發酵時間。

圖2　不同發酵時間對小肽含量的影響

2.1.3不同接種量對小肽含量的影響從圖3可知，在接種量為0.5%、1.0%、2%、3%、4%（V/m）條件下發酵，飼用肽的小肽含量分別較發酵前提高73.67、121.07、131.36、130.24、129.25 mg/g。在2%時，飼用肽的小肽含量提高幅度最大，小肽含量達到160.25 mg/g。不斷接種種子液，小肽含量變化呈先增加、后平緩的趨勢，說明初始發酵環境中的營養物質比較充足，增大接種量會提高小肽含量；隨著接種量進一步的增大，金槍魚暗色肉中的營養物質被消耗大半，枯草芽孢桿菌菌種代謝受到抑制，從而導致小肽含量有所下降。所以本試驗選擇2%（V/m）作為較佳的接種量。

圖3　不同接種量對小肽含量的影響

2.1.4不同加酶量對小肽含量的影響蛋白酶可將多種蛋白質水解為小分子的肽類及氨基酸，因此加酶量是影響菌酶協同制備飼用肽的重要變量之一。由圖4可知，當加酶量為100、150、200、250、300、350 U/g時，飼用肽的小肽含量分別較發酵前提高了71.66、111.39、119.28、122.07、120.96、119.56 mg/g。所以當添加250 U/g的蛋白酶時，小肽含量提高最大，小肽含量達到最高，為149.96 mg/g。在繼續添加中性蛋白酶，小肽含量的變化不大，這說明一定范圍內的加酶量能有效提高小肽含量，再添加蛋白酶出現下降趨勢，可能是因為過量的蛋白酶把小肽進一步水解為游離氨基酸。所以本試驗確定250 U/g作為較佳的加酶量。

圖4　不同加酶量對小肽含量的影響

2.2正交試驗結果根據單因素試驗結果，以飼用肽的小肽含量為考察指標，以發酵溫度、發酵時間、接種量、加酶量為考察因子，進行四因素三水平L9（34）的正交優化試驗，試驗設計與結果如表1所示。

試驗結果顯示，四個因素對試驗結果影響的主次順序為接種量>加酶量>發酵溫度>發酵時間，接種量、加酶量較發酵溫度、發酵時間對小肽含量影響大。較佳菌酶協同組合為A2B2C2D2即發酵溫度37℃，發酵時間48 h，接種量2.0%（V/m），加酶量200 U/g，此組合與單因素試驗得出菌酶協同組合A2B3C2D2相比，加酶量不同。對單因素試驗結果分析可知，加酶量有一個逐漸飽和的趨勢，之后繼續提高加酶量，小肽含量有下降趨勢。因此對這兩個組合分別進行3次驗證試驗，測得小肽含量分別為（185.28±0.31）mg/g和（182.59±0.27）mg/g。結果表明A2B3C2D2組合沒有A2B2C2D2組合小肽含量高。所以從生產成本和效率考慮，確定發酵溫度37℃，發酵時間48 h，接種量2.0%（V/m），加酶量200 U/g為最佳菌酶協同工藝。

表1　正交試驗設計與結果

2.3飼用肽的主要成分

2.3.1飼用肽的常規成分表2的結果表明，與原金槍魚暗色肉相比，飼用肽的粗蛋白質含量和小肽含量較高，分別較發酵前提高11.2 mg/g和156.7 mg/g；粗脂肪、灰分含量有所下降，分別較未發酵前下降2.01 mg/g和2.26 mg/g。

表2　飼用肽的常規成分測定mg/g

2.3.2飼用肽的氨基酸組成經過酸處理后，總氨基酸含量較未發酵前提高7.19 g/100 g；各氨基酸中增加幅度最大的氨基酸是谷氨酸，較未發酵前提高1.31 g/100 g；必需氨基酸中賴氨酸的含量增加最多，較未發酵提高0.41 g/100 g；呈味氨基酸中，甘氨酸含量較未發酵前提高0.82 g/100 g，天冬氨酸含量較未發酵前提高0.93 g/100 g，谷氨酸含量較未發酵前提高1.31 g/100 g，從而能有效減少飼用肽的苦味。可見，經菌酶協同處理后，飼用肽中各種氨基酸組成比例平衡，必需氨基酸種類豐富。

表3　飼用肽的氨基酸組成分析g/100 g

2.3.3飼用肽的蛋白質相對分子質量分布菌酶協同處理后的金槍魚暗色肉蛋白經AKTA蛋白純化系統凝膠色譜柱分離后，與標準蛋白進行比較，其蛋白質的相對分子質量大部分集中在6.5～14.4 kD，小于1.3 kD也占部分，說明飼用肽中的大部分蛋白質得到有效降解，以多肽、小肽或氨基酸形式存在（圖5）。由此可見，經菌酶協同處理后，提高了飼用肽的吸收利用率，有效提升了飼用肽的營養品質。

圖5　飼用肽的蛋白質相對分子質量分布

3　結論

經過單因素試驗和正交試驗優化，確定了菌酶協同處理金槍魚暗色肉制備飼用肽的最佳發酵工藝為發酵溫度37℃，發酵時間48 h，接種量2.0%（V/m），加酶量200 U/g。在此條件下，小肽含量從28.89 mg/g提高到185.59 mg/g；蛋白質分子質量集中在6.5～14.4 kD，說明經菌酶協同處理后的大分子蛋白得到良好的降解，飼用肽的利用率得到提高；對氨基酸組成分析可知飼用肽的總氨基酸含量豐富，氨基酸比例適當，且必需氨基酸含量平衡。

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An orthogonal experiment was conducted to investigate the optimal conditions of tuna dark meat fermentation by bacillus subtilis and a neutral protease for small peptides production.With the yield of small peptides as index，fermentation temperature，fermentation time，inoculation and additive amount of enzyme were determined，through single-factor and orthogonally experiment.The optimal fermentation methods were obtained：fermentation temperature was 37℃，fermentation time was 48 h，inoculums size of bacillus subtilis was 2.0%,and 200 U/g of neutral protease.Under these conditions，the content of small peptides increased from 28.89 mg/g to 185.59 mg/g，amino acid composition was balanced，protein molecular weight mainly was 6.5～14.4 kD，and macromolecular protein was effectively degraded away.

tuna dark muscle；bacteria and neutral enzyme synergy fermentation；feed peptide

S816.7

A

1004-3314（2016）10-0019-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161006

浙江省科技計劃項目（2015C32034）；國家級大創項目（14131062713）