成像流式細胞儀檢測細胞自噬水平研究*

時景仁，郭向華，王珊珊，劉 凱，喬錄新，張玉林，陳德喜

(首都醫科大學附屬北京佑安醫院/北京市肝病研究所，北京 100069)

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·論 著·

成像流式細胞儀檢測細胞自噬水平研究*

時景仁，郭向華，王珊珊，劉 凱，喬錄新，張玉林，陳德喜△

(首都醫科大學附屬北京佑安醫院/北京市肝病研究所，北京 100069)

目的 采用新型成像流式細胞儀量化檢測細胞自噬水平，完善自噬檢測手段。方法 用綠色熒光蛋白(GFP)-微管相關蛋白輕鏈3(LC3)表達質粒轉染Huh7細胞和H1299細胞，并進行24 h饑餓處理，誘導自噬發生，分別用熒光顯微鏡拍照、蛋白免疫印跡法和成像流式細胞術3種方法檢測細胞自噬水平。用IDEAS軟件對成像流式細胞術的細胞自噬結果進行量化分析。結果 熒光顯微鏡顯示，Huh7細胞比H1299細胞中的自噬斑點少；蛋白免疫印跡法顯示，與H1299細胞比較，Huh7細胞LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比例較低，但2種方法均不能獲得通量統計數據。成像流式細胞儀結果顯示細胞自噬圖像，2種細胞的GFP-LC3質粒轉染效率基本一致(25.2%和27.6%)；比較兩者發生高水平自噬(LC3斑點數目為6個以上)的細胞比例，Huh7細胞僅為9.0%，顯著少于H1299細胞(26.2%)。結論 采用新型成像流式細胞儀檢測細胞自噬，兼具量化分析和成像的優點，能彌補熒光顯微鏡和蛋白免疫印跡法的不足，是一種更優秀的自噬檢測方法。

自噬； 成像流式細胞儀； 微管相關蛋白輕鏈3

自噬是指細胞為維持自身穩態，將細胞質內物質運輸到溶酶體內，進行分解代謝的一種重要保守過程[1]。自噬參與了機體眾多的生理和病理過程，如炎性反應、衰老、腫瘤、神經變性、心血管疾病及感染等[2]。檢測細胞自噬水平是科研工作中的重要部分。目前傳統的自噬檢測技術并不完美：在電子顯微鏡下能夠直接觀察到細胞的自噬狀態，但需要專業技術人員進行操作；微管相關蛋白輕鏈3(LC3)是自噬體的標志物[3]，用熒光顯微鏡檢測和計算LC3斑點數目存在主觀性強、統計計算方法待規范等問題；蛋白免疫印跡法需要與熒光顯微鏡成像相結合才能準確判定細胞自噬活性；流式細胞術檢測自噬雖然具有高通量的特點，但缺乏圖像數據佐證[4]。筆者采用新型成像流式細胞儀，對Huh7細胞和H1299細胞的自噬水平進行檢測，將流式細胞術的高通量數據處理能力與細胞成像相結合，對自噬檢測手段進行完善。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人肝癌細胞系Huh7和人肺癌細胞系H1299由本實驗室保存。

1.2 儀器與試劑 DMEM培養基購自上海Hyclone公司；胎牛血清、胰酶、青鏈霉素購自美國Gibco 公司；綠色熒光蛋白(GFP)-LC3質粒由美國南加州大學歐競雄教授惠贈；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法蛋白水平測定試劑盒購自北京康為世紀基因有限公司；所用儀器為德國Merck公司的ImageStreamX MarkⅡ成像流式細胞儀和日本Nikon公司80i熒光顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養與處理 將Huh7細胞和H1299細胞按照5×104/mL分別接種在24孔細胞培養板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養基，以5%CO2、37 ℃的條件進行培養。待細胞貼壁后，轉染GFP-LC3質粒，24 h后換用無血清培養基培養細胞，進行饑餓處理24 h；同時設立正常培養細胞作為對照。

1.3.2 熒光顯微鏡和蛋白免疫印跡法檢測細胞自噬 細胞經過饑餓處理24 h后，采用熒光顯微鏡觀察GFP-LC3 熒光斑點并拍照。同時，收集細胞于高鹽蛋白裂解液中，4 ℃裂解20 min后，全速離心收集上清液，即為所提細胞總蛋白。BCA法蛋白水平測定按照試劑盒說明書進行。收集的細胞進行蛋白免疫印跡分析，電化學發光法(ECL)檢測蛋白的表達，X 線膠片曝光。

1.3.3 成像流式細胞儀檢測細胞自噬 細胞經過饑餓處理24 h后，用胰酶進行消化并離心收集，經磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)清洗細胞2次后，重懸在含1%胎牛血清、0.1%疊氮鈉的PBS溶液中，上機檢測，每個標本收集5 000個事件。儀器設置如下：488 nm激光功率為10 mW；758 nm激光功率為0.55 mW；成像放大40倍。

1.4 統計學處理 采用儀器配置的IDEAS軟件進行數據分析處理。

2 結 果

2.1 熒光顯微鏡檢測細胞自噬 與正常培養的細胞比較，經過饑餓處理后，細胞出現顯著的自噬斑點。Huh7細胞與H1299細胞比較，其饑餓產生的自噬斑點相對較少，見圖1。

圖1 熒光顯微鏡檢測細胞自噬

2.2 蛋白免疫印跡法檢測細胞自噬 與正常培養的細胞比較，經過饑餓處理后，細胞LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比例顯著增高。Huh7細胞與H1299細胞比較，LC3-Ⅱ的產生較少，細胞LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比例較低，見圖2。

圖2 蛋白免疫印跡法檢測細胞自噬

2.3 成像流式細胞儀圈門策略 成像流式細胞儀所記錄的每一事件均可從IDEAS軟件中獲得相應的圖像，每一事件用圖像左上角的標號進行區別標注，圖像左側展示21個H1299細胞在明場和488 nm激光通道的圖像。為了方便對自噬水平和發生自噬的細胞進行統計分析，圈門時，首先選定聚焦清晰的細胞，接著在聚焦清晰群中再圈定單個細胞，然后從單個細胞群中選取轉染GFP-LC3質粒成功的GFP陽性細胞，最后對GFP陽性細胞中存在不同自噬斑點個數的細胞進行計數處理，見圖3。筆者在本試驗中設定了3種細胞群，其自噬斑點個數分別為：0個(無自噬)；1～5個(低水平自噬)；6個及以上(高水平自噬)。每個標本記錄5 000個細胞，有效細胞數目約為1 000個。

2.4 計數LC3斑點 為了定量某個細胞中LC3斑點的數目，軟件中采用斑點計數性能。斑點計數性能通過發現圖像中顯著高于區域背景的熒光信號來鑒別斑點，再采用點的適當大小和縱橫比確定斑點，以克服高背景熒光和非特異染色干擾。一旦判定方式確定，斑點計數性能就能自動對圖像中的斑點進行準確計數統計。斑點計數范圍，橫坐標表示細胞中自噬斑點的數目，縱坐標表示細胞頻次，即含有某個自噬斑點的細胞數量，見圖4A；每種數目范圍的斑點圖像，每個斑點數目選取5個細胞圖像作為代表，見圖4B。

圖3 成像流式細胞儀檢測細胞自噬的圈門策略

圖4 含有不同斑點數目的細胞圖像

2.5 GFP-LC3質粒轉染效率及具有不同LC3斑點數目的細胞比例 經過饑餓處理后，Huh7和H1299細胞均有不同程度的自噬產生。Huh7細胞轉染GFP-LC3質粒成功的細胞有27.6%，具有LC3斑點數目為0個、1～5個和6個及以上的細胞比例分別為：25.1%、65.9%和9.0%，見圖5A；H1299細胞轉染GFP-LC3質粒成功的細胞有25.2%，具有LC3斑點數目為0個、1～5個和6個及以上的細胞比例分別為31.6%、42.0%、26.2%，見圖5B。

2.6 量化分析比較Huh7和H1299細胞的自噬水平 GFP-LC3質粒對于2種細胞的轉染效率基本相同；與Huh7細胞比較，H1299細胞發生低水平自噬(LC3斑點數目為1～5個)的細胞比例較少，而發生高水平自噬(LC3斑點數目為6個以上)的細胞比例顯著增多。見表1。

表1 量化分析比較Huh7和H1299細胞的自噬水平[n(%)]

圖5 GFP-LC3質粒轉染效率以及具有不同LC3斑點數目的細胞比例

3 討 論

自噬(本研究中指大自噬)可被營養饑餓、應激、缺氧、活性氧物質及Toll樣受體激活劑等誘導發生[5]。自噬開始后，細胞質中形成1個新月形狀的雙層膜結構(即吞噬泡或者分離膜)，其中包繞著錯誤折疊的蛋白質、受損細胞器或者再循環的細胞質成分等。吞噬泡的膜繼續延伸封閉部分細胞質，形成完全閉合的雙層膜囊泡(即自噬體)。自噬體通過與溶酶體融合而形成自噬溶酶體，自噬體中的物質在自噬溶酶體中被酸性水解酶降解。LC3是自噬體的1個標志物。新合成的LC3蛋白經加工后成為LC3-Ⅰ，位于細胞質中。隨后LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺(PE) 連接，通過泛素化樣酶促反應成為LC3-Ⅱ，與自噬體的內膜和外膜均結合，自噬體內膜的LC3-Ⅱ在自噬溶酶體中被降解而進入再循環[6]。

目前，LC3的合成率、LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的轉化率和LC3通量是檢測細胞自噬的通用指標[4]。檢測方法包括：(1)采用電子顯微鏡檢測LC3的亞細胞定位、計算LC3斑點。(2)采用熒光顯微鏡觀察轉染GFP-LC3細胞的內源性LC3或者GFP-LC3定位。(3)通過蛋白免疫印跡法檢測LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉變。但是，上述方法均不理想。用電子顯微鏡評估自噬體的數量需要相關專家，使得研究者們更廣泛地使用熒光顯微鏡評估自噬體，然而，其缺點在于：自噬體數目的判定存在一定主觀性，定量方法和對LC3斑點的定義標準均需要制訂統一標準；細胞內源性LC3或GFP-LC3如果過度表達或與其他有聚集傾向的蛋白共表達，會產生非特異GFP-LC3聚集物，不能與真正的自噬體區分[7]。蛋白免疫印跡法檢測LC3-Ⅱ的量一般與自噬體數量相關，但有報道指出，即使自噬體和自噬通量受到抑制，仍可檢測到LC3-Ⅱ[8-9]。因此，蛋白免疫印跡法需要與熒光顯微鏡下檢測GFP-LC3的方法或其他形態學方法相結合，以評估細胞的自噬活性。此外，操作復雜、耗時長、結果不穩定和僅能半定量也是此傳統方法的缺點。

傳統流式細胞術能快速高通量分析大量細胞，并獲得細胞群體的各種統計數據，但細胞在散點圖上只表示為1個點，而不是真實的細胞圖像，因此無法進行基于圖像信息的統計學分析。采用熒光顯微鏡能夠觀察基于圖像分析的試驗，記錄圖像，然后采用圖像分析軟件對數據進行分析，但顯微鏡能夠觀察的細胞數量非常有限，很難提供細胞群體的量化與統計數據；手動分析數據耗費大量人力和時間；受試驗人員的主觀因素影響，試驗結果的穩定性較差。量化成像分析流式細胞儀是近年來發展應用的新型流式細胞儀[10]。它將流式細胞術的高通量分析與熒光顯微成像的形態學分析相結合，對通過流動室的細胞逐個采集圖像，并采用圖像分析軟件對每個細胞圖像的形態學參數進行量化分析，不僅可提供基于流式分析的細胞群統計數據，還可獲得各種細胞形態學、細胞結構和亞細胞信號分布的量化成像信息。

目前，國際上已有多個關于采用新型流式細胞儀對自噬進行檢測的報道[11-13]，筆者在本研究中采用成像流式細胞儀對細胞自噬活性進行檢測。GFP-LC3質粒轉染Huh7和H1299細胞效率基本一致，但2種細胞發生自噬的水平有較大差別。H1299細胞有更多自噬斑點產生，這與細胞系背景不同有關。成像流式細胞術獲得的結果與熒光顯微鏡觀察結果、蛋白免疫印跡結果基本一致，但前者檢測自噬的方法明顯優于后兩者。高通量的數據處理能力優于熒光顯微鏡；每個細胞能獲得相應的熒光圖像，可直觀看到自噬斑點的存在，在此方面成像流式細胞術優于蛋白免疫印跡法。國內目前對于成像流式細胞儀的使用還處于起步階段，筆者希望通過本試驗建立細胞自噬檢測新方法，并加以推廣應用，助力科研工作。

[1]Rautou PE,Mansouri A,Lebrec D,et al.Autophagy in liver diseases[J].J Hepatol,2010,53(6):1123-1134.

[2]Levine B,Mizushima N,Virgin HW.Autophagy in immunity and inflammation[J].Nature,2011,469(7330):323-335.

[3]Huang R,Liu W.Identifying an essential role of nuclear LC3 for autophagy[J].Autophagy,2015,11(5):852-853.

[4]Klionsky DJ,Abdalla FC,Abeliovich H,et al.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy[J].Autophagy,2012,8(4):445-544.

[5]Yang Z,Klionsky DJ.Eaten alive:a history of macroautophagy[J].Nat Cell Biol,2010,12(9):814-822.

[6]Romao S,Munz C.LC3-associated phagocytosis[J].Autophagy,2014,10(3):526-528.

[7]Mizushima N,Yoshimori T,Levine B.Methods in mammalian autophagy research[J].Cell,2010,140(3):313-326.

[8]Hosokawa N,Hara T,Kaizuka T,et al.Nutrient-dependent mTORC1 association with the ULK1-Atg13-FIP200 complex required for autophagy[J].Mol Biol Cell,2009,20(7):1981-1991.

[9]Hara T,Takamura A,Kishi C,et al.FIP200,a ULK-interacting protein,is required for autophagosome formation in mammalian cells[J].J Cell Biol,2008,181(3):497-510.

[10]Zuba-Surma EK,Ratajczak MZ.Analytical capabilities of the ImageStream cytometer[J].Methods Cell Biol,2011,102:207-230.

[11]Calle C,Joubert PE,Law HK,et al.Simultaneous assessment of autophagy and apoptosis using multispectral imaging cytometry[J].Autophagy,2011,7(9):1045-1051.

[12]Altman BJ,Jacobs SR,Mason EF,et al.Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis[J].Oncogene,2011,30(16):1855-1867.

[13]Phadwal K,Alegre-Abarrategui J,Watson AS,et al.A novel method for autophagy detection in primary cells:impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells[J].Autophagy,2012,8(4):677-689.

Disscution of autophagy detection by imaging flow cytometer*

SHIJingren,GUOXianghua,WANGShanshan,LIUKai,QIAOLuxin,ZHANGYulin,CHENDexi△

(BeijingYouanHospitalAffiliatedofCapitalMedicalUniversity/BeijingInstituteofHepatology,Beijing100069,China)

Objective To detect autophagy levels in the cells by a novel imaging flow cytometer,and to improve the detection methods of autophagy.Methods GFP-LC3 plasmid was transfected into Huh7 or H1299 cells,respectively,followed by starvation for 24 hours in order to induce autophagy.Autophagy levels in the cells were detected by three ways:fluorescence microscopy,western blotting and imaging flow cytometry.Quantified analysis of cellular autophagy data from the imaging flow cytometer was performed by IDEAS software.Results Fluorescence microscopy showed that the numbers of autophagy spot in Huh7 cells were less than that in H1299 cells.The results of western blotting also indicated that compared with H1299 cells,the ratio of LC3-Ⅱ and LC3-Ⅰ in Huh7 cells were lower distinctly.Whereas both of two methods couldn′t obtain quantitative data.The imaging flow cytometer not only displayed the autophagic cellular images,but also demonstrated that only 9.0% of Huh7 cells exhibited over 6 LC3 spots(high autophagic levels),markedly less than the same population of H1299 cells(26.2%).While GFP-LC3 plasmid transfection rates of the two kind of cells were similar(25.2% and 27.6%).Conclusion The novel imaging flow cytometer has the advantages of combination of quantitative data analysis and fluorescent imaging as well as could compensate the shortcomings of fluorescence microscopy and western blotting.It is more excellent to detect autophagy by imaging flow cytometer.

autophagy; imaging flow cytometer; microtubule associated protein light chain 3

國家自然科學基金資助項目(81361120401,81371399，81272266)；首都衛生發展科研專項項目(首發2014-1-1151)；腫瘤侵襲和轉移機制研究北京市重點實驗室開放課題(2015ZLQX05)；北京市肝病研究所科研課題(BJIH-01602)。

時景仁，女，主治醫師，主要從事肝病與自噬相關性方面的研究。

△通訊作者，E-mail：dexichen@ccmu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.21.001

A

1673-4130(2016)21-2949-04

2016-02-28

2016-05-05)