女性外陰尖銳濕疣組織中HPV感染型別的回顧性研究*

單慧敏，曹佩霞，耿建祥，蔡為民，施啟豐，龍秀榮，夏 林，王宏景，趙 雪

(1.江蘇省大豐市人民醫院病理科 224100；2.江蘇省常州市中醫醫院婦產科 213003；3.南京中醫藥大學第三附屬醫院病理科/江蘇省HPV協作組 210001；4.江蘇省常熟市第一人民醫院病理科 215500)

?

·論 著·

女性外陰尖銳濕疣組織中HPV感染型別的回顧性研究*

單慧敏1，曹佩霞2，耿建祥3△，蔡為民4，施啟豐3，龍秀榮3，夏 林3，王宏景3，趙 雪3

(1.江蘇省大豐市人民醫院病理科 224100；2.江蘇省常州市中醫醫院婦產科 213003；3.南京中醫藥大學第三附屬醫院病理科/江蘇省HPV協作組 210001；4.江蘇省常熟市第一人民醫院病理科 215500)

目的 探討女性外陰尖銳濕疣(外陰CA)組織中人乳頭瘤病毒(HPV)感染型別的分布狀況及臨床意義。方法 采用基因芯片結合聚合酶鏈式反應(PCR)技術對322例外陰CA組織行23種HPV基因型檢測，并分析患者的臨床病理資料。結果 322例外陰CA組織中檢出HPV陽性者279例，HPV感染率為86.65%(279/322),單一型感染率56.52%(182/322)，多型感染率30.12%(97/322)。結論 HPV感染與外陰CA的發病密切相關,HPV 11和6型是單一型感染最主流的型別，而11+18、11+16、6+11和6+16型是多型感染最常見型別?；蛐酒摵螾CR技術適用于臨床開展HPV分型診斷，敏感性好、特異性高，對女性外陰CA的臨床診斷、治療及其疫苗研究意義重大。

外陰； 組織； 尖銳濕疣； 人乳頭瘤病毒； 基因分型

外陰部濕疣性病變主要包括尖銳濕疣(CA)和扁平濕疣，兩者均由人乳頭瘤病毒(HPV)感染所致，僅在病理組織形態學上存在某些差異性[1-4]。扁平濕疣比CA更為常見，但由于其病變扁平而不顯著，沒有引起臨床醫師和患者的重視。由于HPV感染普遍，CA病變顯著，且通過性傳播引起，因此，臨床上女性外生殖器CA十分常見。目前，國內女性外生殖器CA組織中HPV感染分型研究的大樣本資料十分匱乏。本研究采用聚合酶鏈式反應(PCR)聯合基因芯片技術，以23種常見高危型和低危型HPV作為感染源，對322例女性外陰CA組織標本進行25年的回顧性基因分型研究，并對其患者外陰CA組織中HPV感染基因型及年齡分布狀況進行分析?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取1991年9月至2015年12月南京中醫藥大學第三附屬醫院和江蘇省常熟市第一人民醫院婦產科手術切除的女性外陰CA病變常規石蠟組織標本322例，年齡17～69歲，中位數30.38歲；20歲以下10例，20～29歲179例，30～39歲69例，40～49歲43例，50～59歲14例，60～69歲7例。由2位病理醫師結合臨床，依據外陰CA病變大體和顯微鏡組織形態學特征作出符合外陰CA的診斷，并復習其臨床病理資料。

1.2 儀器與試劑 HPV基因分型檢測試劑盒購自深圳亞能公司；基因擴增儀為Gene Amp PCR system 2400型，購自新加坡；分子雜交儀為FYY-3型，購自江蘇省興化分析儀器廠；高速冷凍離心機為Eppendorf 5810 R型，購自德國；生物安全柜為BHC-1300ⅡA2型，購自蘇州安泰公司；-20 ℃冰箱購自青島海爾公司。顯色液須即用即配，根據需要的水平用蒸餾水調配。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 所有外陰CA石蠟組織標本：先去除每例石蠟組織周邊多余的石蠟，將其石蠟組織切成4 μm厚的切片，切3～5例石蠟組織即可。用專用鑷子輕輕夾取，放入小離心管中，切第2例石蠟組織前，用次氯酸鈉溶液擦刀片及鑷子各3次。

1.3.2 DNA的提取 將切下的石蠟組織片放入1.5 mL離心管中，加入裂解液150 μL，充分振蕩混勻，然后在金屬浴中加熱100 ℃ 10 min，立即13 000 r/min離心10 min后，取中間層DNA溶液待用。PCR擴增、雜交、孵育和顯色按說明書進行規范操作。每例標本顯色后根據雜交信號的有無判斷結果。

1.4 統計學處理 外陰CA組織中HPV感染率及各HPV型別的比例采用HPV分型統計軟件(由南京倍寧醫療器械有限公司提供)進行分析，對分析出來的相關數據，采用統計軟件包SPSS13.0對相關數據進行統計學處理，率的比較采用χ2檢驗或確切概率法，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

從322例外陰CA石蠟組織標本中檢測出HPV陽性者279例，陰性者43例，總HPV感染率86.65%(279/322)。其中單一型HPV感染者182例，占總HPV感染率56.52%(182/322)，單一型HPV感染中，HPV 11型97例,其陽性檢出率為30.12%(97/322)，是最主要感染型別；其次為HPV 6型76例,其陽性檢出率為23.60%(76/322)；HPV 16型4例,其陽性檢出率為1.24%(4/322)。多型HPV感染者97例,其HPV感染率為30.12%(97/322)，多型HPV感染中，HPV 11+18型8例、HPV 11+16型6例、HPV 6+11型5例和HPV 6+16型4例,分別占多型感染的8.25%(8/97)、6.19%(6/97)、5.16%(5/97)和4.12%(4/97),是多型感染的最主要型別。2種型感染者57例，3種型感染者25例，4種型感染者9例，5種型感染者3例，6種型感染者3例。322例外陰CA患者HPV陽性檢出不同型別出現頻率數合計440次，其中低危型HPV出現頻率313次，高危型HPV出現頻率127次。見表1、2。

表1 外陰CA HPV感染者不同型別感染出現頻率及比例[n(%)]

表2 外陰CA 不同年齡組HPV感染者感染人數及比例[n(%)]

3 討 論

生殖器部位CA是全球流行最廣的性傳播性疾病之一。在我國CA已成為僅次于淋病的性傳播性疾病。隨著我國避孕套的廣泛使用，國內女性外生殖器CA的發病率呈逐步下降趨勢。CA病原體為HPV，因此，女性在患外陰CA時，大都伴有陰道和宮頸CA。HPV是1種小分子環狀雙鏈DNA病毒，對人體皮膚和黏膜具有高度親嗜性，根據其L1基因序列的差異性，目前已經發現HPV有200多種型別、亞型和變異體，其中感染泌尿生殖道的HPV約有50種。按照HPV致瘤致癌的差異性，將其分為高危型和低危型。低危型一般為HPV 6、11、42、43、44、81型等，是誘發各種疣類病變和低度上皮內瘤變的主要病原體；高危型主要有HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68型等，是致高度上皮內瘤變和宮頸癌的重要病原體[1，5-7]?，F研究證實，高危型HPV比低危型HPV更容易導致女性的持續性感染，是引起女性宮頸瘤變和癌變的主要致病因素[8-9]。由于HPV致病性的強弱與其型別密切相關，因此，研究我國女性外陰CA組織中HPV的型別及其比例，對HPV感染相關疾病的診斷、治療、試劑及疫苗的研發都具有重要臨床意義。

CA肉眼所見常呈多部位發生或1個部位多個病灶，表現為灰紅或灰褐色細顆粒型的疣狀、乳頭狀或菜花狀突起，或呈扁平斑塊狀突起，質硬。鏡下所見典型CA病變具有以下特征：(1)鱗狀上皮呈疣狀、乳頭狀增生，常伴有上皮腳(釘突)延長、增寬，甚至呈假上皮瘤樣增生。(2)鱗狀上皮表皮角化不全，常伴有角化不全層細胞核增大及輕度異型。(3)棘細胞層及基底細胞層可見不同程度增生肥厚。(4)表皮內可見挖空細胞,此為CA的特征性病變。(5)真皮乳頭部毛細血管增生擴張，血管上移靠近表皮。(6)真皮質內有數量不等的慢性炎性細胞浸潤，可見少數中性及嗜酸性白細胞。目前，CA的病理診斷主要是依據患者病史、組織學特征和基因檢測相結合的診斷模式[5，10-11]。因此，熟悉并掌握其病變的組織學特征是明確CA診斷的重要環節。

本研究顯示：(1)322例外陰CA患者中，HPV陽性者279例，陰性者43例，總HPV感染率86.65%(279/322)，其中單一型HPV感染者182例，占總HPV感染率的56.52%(182/322)。單一型HPV感染中，HPV 11型97例，其陽性檢出率為30.12%(97/322)，是最主要感染型別；其次為HPV 6型76例,其陽性檢出率為23.60%(76/322)；HPV 16型4例，其陽性檢出率為1.24%(4/322)。多型HPV感染者97例,其HPV感染率為30.12%(97/322)，多型HPV感染中，HPV 11+18型8例、HPV 11+16型6例、HPV 6+11型5例和HPV 6+16型4例,分別占多型感染的8.25%(8/97)、6.19%(6/97)、5.16%(5/97)和4.12%(4/97)，是多型感染的最主要型別。(2)322例外陰CA組織中單一型HPV感染者182例，多型HPV感染者97例。外陰CA組織中單一型和多型感染之比為1.88∶1.00；與蔡為民等[5]報道的宮頸CA組織中單一型和多型感染比相(2.83∶1.00)比較，宮頸CA組織的單一型HPV感染比例顯著升高，此結果是否與女性生殖道內外環境作用相關，仍需要大樣本研究加以證明。(3)從外陰CA組織HPV感染分類來看，322例外陰CA患者中，低危型HPV感染者192例，高低危型HPV感染者80例，高危型HPV感染者7例，表明外陰CA組織中HPV感染呈低危型感染、高低危型、高危型感染人數逐步降低，提示外陰CA組織是以低危型感染為主，高低危型感染為次，高危型感染為末的感染模式。外陰CA伴高危型HPV感染者占HPV總感染的31.18%(87/279)，值得關注。(4)自2006年，西方國家開始使用預防性HPV疫苗[1,12-13]。目前中國大陸地區尚未使用預防性HPV疫苗。如我國使用第1代預防性HPV疫苗(HPV 6、11、16、18型預防性四價疫苗)可保護本研究中72.40%(202/279，單一型感染者177例，多型感染者25例)外陰CA女性。HPV感染者因HPV感染而誘發外陰CA，過半女性外陰CA感染者可從中受益。(5)CA是由HPV感染所致，通過性接觸或其他方式交叉感染而發病。其發病高峰年齡為20～30歲。70%為30歲以下患者，但老年及兒童亦可染病[14-15]。本研究中，小于20歲組患者比例為3.11%，20～29歲組為55.59%，30～39歲組為21.43%，40～49歲組為13.35%，50～59歲組為4.35%，60～69歲組為2.17%，提示20～29歲組單一型、多型和總感染都處于感染高峰值。6組年齡段比較，小于20歲組、50～59歲組、60～69歲組組間比較差異無統計學意義(χ2分別為0.69、0.54、2.41，P>0.05)，其他各組之間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。這可能與20～49歲女性處于性活躍期有關，其中20～29歲組HPV感染率最高。隨著女性年齡增加，性活動減少，HPV感染率降低，致外陰CA患者比例下降。30歲以下CA患者占58.70%，40歲以下CA患者占80.13%，表明外陰CA患者主要人群可推至39歲。(6)322例外陰CA HPV感染者中，低危型出現頻率314次，高危型出現頻率127次，低高危型感染頻率比為2.47∶1.00。雖然外陰CA以低危型HPV感染為主，但高危型HPV感染出現頻率超過1/4。由于外陰CA與性活動有關，HPV在感染外陰的同時，也伴有女性陰道和宮頸HPV感染。對伴有高危型HPV感染的外陰CA患者，特別是30～49歲年齡段女性而言，高危型HPV感染是致高級別鱗狀上皮內瘤變和鱗狀細胞癌的重要因素。因此，應對外陰CA行HPV分型檢測，如發現有高危型HPV感染，即對患者行宮頸HPV分型檢測，了解其感染情況，可濃縮高風險人群，有利于婦產科醫師縮小隨訪HPV感染的外陰CA患者范圍，便于醫師對外陰CA病變發展趨勢做出正確預判。(7)本研究外陰CA組織中HPV感染率為86.65%，并未達到90.00%，有以下影響因素：本研究使用的部分石蠟組織標本保存時間超過20年，可能導致其石蠟組織中的HPV DNA碎片化，無法正確檢測；制作包埋的病變石蠟組織標本需要經過脫水、浸蠟和包埋等高溫處理過程，可能會引起部分石蠟組織內的HPV DNA降解；由于外陰CA發生在外陰皮膚，容易發現，某些石蠟組織小，可能導致HPV DNA拷貝數達不到檢測最低拷貝數；本研究檢測試劑只包含23種高低危型HPV，可能存在23種以外的HPV型別；目前，HPV檢測大量用于宮頸細胞檢測，而石蠟組織只作為科研研究，使得各種組織HPV DNA的提取方法間存在一定差異性，影響HPV檢出率；本研究檢測試劑的敏感性約為95.00%，存在少量HPV感染者漏檢。

總之，女性外陰CA是1種性傳播性疾病，病原體為HPV，以低危型HPV感染為主，高低危型HPV感染為輔，伴有少量高危型HPV感染。HPV感染與鱗狀上皮內瘤變的發生發展有著密切關聯。鱗狀上皮內病變可單獨發生，也可在CA病變中發生。外陰CA可合并外陰上皮內瘤變、宮頸上皮內瘤變(CIN)，常見外陰CA合并CINⅠ～Ⅱ級。本研究HPV感染者中有31.18%伴有高危型HPV感染，應引起臨床婦產科醫師高度關注。女性外陰CA治療后，周圍皮膚中仍存在HPV抗原和HPV DNA，可能為外陰CA復發根源。另有部分外陰CA患者可繼發鱗狀上皮細胞癌變，主要由高危型HPV感染所致，常見HPV 16、HPV 18型等型別[16-17]。因此，婦產科醫師需對外陰CA患者行外陰CA病變活組織檢查，明確診斷，及時發現有無伴有癌情況，對HPV 16和HPV 18型感染患者，即使其活組織檢查正常，也要給予定期隨訪。這有利于臨床婦產科醫師對女性外陰CA患者疾病發展趨勢作出正確預判，了解外陰CA患者宮頸HPV感染狀態，以便追蹤和隨訪[18-20]。臨床上患者如用鬼臼脂治療CA，可引起病變組織細胞異型性和非典型增生，易誤判為鱗狀細胞癌，故醫師需了解患者病史便于做出正確病理診斷。

[1]耿建祥,王旭波.人乳頭瘤病毒檢測及其臨床應用[M].北京:人民衛生出版社,2009:381-427.

[2]周偉,耿建祥,韓惦梅,等.原位雜交HPV DNA檢測技術應用及體會[J].臨床與實驗病理學雜志,2009,25(4):446-447.

[3]張金浩,耿建祥,樊志敏,等.肛管及肛門區尖銳濕疣組織中人乳頭瘤病毒基因類型的研究[J].醫學研究生學報,2011,24(11):1129-1132.

[4]張金浩,耿建祥,樊志敏,等.257例肛門及肛管尖銳濕疣組織中HPV感染的基因分析[J].臨床與實驗病理學雜志,2013,29(5):520-523.

[5]蔡為民,闞延靜,耿建祥,等.宮頸尖銳濕疣組織中HPV感染基因型別分布的研究[J].臨床與實驗病理學雜志,2015,31(4):395-399.

[6]朱小玨,耿建祥.308例宮頸瘤組織中HPV感染基因型分布的對比研究[J].國際檢驗醫學雜志,2014,35(23):3180-3182.

[7]梁曉東,蔡為民,耿建祥,等.宮頸正常細胞與ASC-US中HPV感染型別的對比研究[J].國際檢驗醫學雜志,2014,35(13):1699-1701.

[8]魏謹,耿建祥,樸正愛,等.已婚女性宮頸細胞中人乳頭狀瘤病毒感染的基因分型研究[J].中華醫院感染學雜志,2012,22(23):5202-5205.

[9]施啟豐,韓春榮,耿建祥,等.女性宮頸人乳頭瘤病毒多重感染的基因型對比研究[J].中華醫院感染學雜志,2014,24(19):4708-4710.

[10]唐永發,耿建祥,張金浩,等.196例肛門及肛管尖銳濕疣病變中HPV感染的研究[J].國際檢驗醫學雜志,2012,33(11):1303-1304.

[11]曹嬿,邵馨,耿建祥,等.287例肛門及肛管尖銳濕疣組織HPV感染基因型的研究[J].國際檢驗醫學雜志,2014,35(8):969-970.

[12]徐妍婷,蔡為民,耿建祥,等.健康婦女及宮頸癌瘤患者HPV感染基因型分布的研究[J].國際檢驗醫學雜志,2014,35(22):3022-3024.

[13]夏林,龔培堯,耿建祥,等.徐州地區女性宮頸細胞中HPV感染基因型分析[J].國際檢驗醫學雜志,2015,36(7):882-884.

[14]徐建妹,張金浩,耿建祥,等.女性肛門尖銳濕疣組織中HPV感染的回顧性研究[J].中國婦幼保健,2015,30(31):5329-5331.

[15]張金浩,蔡為民,耿建祥,等.女性肛門及肛管尖銳濕疣組織HPV感染基因型譜的分析[J].國際檢驗醫學雜志,2015,36(1):30-32.

[16]趙敏,董漢生,陳雷,等.尖銳濕疣組織HPV基因芯片分型及型別分析[J].中國皮膚性病學雜志,2006,20(8):490-491.

[17]蔡為民,王宏景,耿建祥,等.宮頸正常細胞和宮頸鱗狀細胞癌及腺癌組織中HPV感染基因型的分布[J].臨床與實驗病理學雜志,2014,30(8):854-857.

[18]龍秀榮,王志蕙,耿建祥,等.健康婦女及宮頸上皮癌瘤患者HPV感染基因型分布特征研究[J].國際檢驗醫學雜志,2012,33(24):2958-2959.

[19]Bruni L,Diaz M,Castellsague X,et al.Cervical human papillomavirus prevalence in 5 continents:meta-analysis of 1 million women with normal cytological findings[J].J Infect Dis,2010,202:1789-1799.

[20]Li H,Wang XB,Geng JX,et al.Clinical study of styping detection of human papillomavirus(HPV) infection with microarray from paraffinembedded specimens of cervical cancer and precursor lesions[J].J Nanosci Nanotechnol,2015,15(9):6423-6428.

HPV infection types in female vulva condyloma acuminate:a retrospective study*

SHANHuimin1,CAOPeixia2,GENGJianxiang3△,CAIWiemin3,SHIQifeng3,LONGXiurong3,XIALin3,WANGHongjing3,ZHAOXue3

(1.DepartmentofPathology,People′sHospitalofDafengCity,Dafeng,Jiangsu224100,China;2.DepartmentofObstetricsandGynecology,TraditionalChineseMedicineHospitalofChangzhou,Changzhou,Jiangsu213003,China;3.DepartmentofPathology,theThirdAffiliatedHospitalofNanjingTraditionalChineseMedicalUniversity/HPVCollaborationofJiangsuProvince,Nanjing,Jiangsu210001,China;4.DepartmentofPathology,theFirstPeople′sHospitalofChangshuCity,Changshu,Jiangsu215500,China)

Objective To discuss the distribution of human papillomavirus(HPV) genotypes in tissues of condyloma acuminate(CA) of vulva and its clinical significance.Methods Gene chips and polymerase chain reaction(PCR) technology were utilized for the detection of 23 kinds of HPV genotypes in vulva CA tissue specimens from 322 cases.And pathological data of all subjects were analyzed.Results In 322 women with vulva CA,the infection rate of HPV was 86.65%(279/322).Single genotype infection rate of HPV was 56.52%(182/322) and multiple genotypes infection rate of HPV was 30.12%(97/322).Conclusion HPV infection is intimately related to aetiological agent of vulva CA.HPV11 and HPV 6 genotype are main single type infection.Moreover,HPV 11+18,HPV 11+16,HPV 6+11 and HPV 6+16 are the most common types in multiple types′ infection.Gene-chips combined polymerase chain reaction(PCR) technology are the method which is applicable to HPV typing diagnosis for clinical application,and the method has high sensitivity and specificity.Detection of HPV genotypes could be used to clinical diagnosis and treatment of vulva CA,which can also be used to supply reference for the research and development of HPV vaccine in women.

vulva; tissue; condyloma acuminate; human papillomavirus; genotype

江蘇省南京市衛生和計劃生育委員會中醫專項資助項目(2009-92)。

單慧敏，女，副主任醫師，主要從事HPV感染相關性疾病的研究。

△通訊作者，E-mail：dyc720@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.21.008

A

1673-4130(2016)21-2970-04

2016-05-04

2016-06-24)