VCA+EA多肽片段聯合包被ELISA對血液EBV IgA檢測效果的研究

陳明星，廖秀梅，劉萬里

(1.廣東省龍川縣人民醫院 517300；2.中山大學附屬腫瘤醫院，廣東廣州 510060)

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·論 著·

VCA+EA多肽片段聯合包被ELISA對血液EBV IgA檢測效果的研究

陳明星1，廖秀梅1，劉萬里2△

(1.廣東省龍川縣人民醫院 517300；2.中山大學附屬腫瘤醫院，廣東廣州 510060)

目的 探討中山大學附屬腫瘤醫院研制的病毒殼抗原(VCA)+早期抗原(EA) 多肽片段聯合包被聚苯乙烯微孔板酶聯免疫吸附測定(ELISA)方法對血液中Epstein-Barr病毒(EBV) 免疫球蛋白A(IgA)的檢測效果，并將其與進口篩選試劑盒進行比較，最終對VCA+EA多肽片段聯合包被ELISA試劑盒性能進行評價。方法 收集鼻咽癌患者血清86例，健康人群血清100例，用ELISA檢測血清中IgA的OD值，觀察該方法的最低檢測限、線性范圍、精密度、回收率，同時采用進口的Epstein-Barr病毒持續表達核抗原(EBNA1)+VCA-p18抗原包被ELISA方法進行檢測，觀察其臨床性能。結果 VCA+EA多肽片段聯合包被ELISA方法最低檢測限為(0.003 4±0.002 6)，血清稀釋100倍數(及以上)，其水平與吸光度呈線性關系，陰性標本、弱陽性標本、陽性標本IgA水平的日內變異系數為3.97%、9.76%、9.23%，日間變異變異系數分別為7.56%、10.20%、7.67%。VCA+EA多肽片段聯合包被試劑盒與EBNA1+VCA-p18抗原包被試劑盒比較，相關系數為0.926 6；檢測鼻咽癌敏感性為88.90%，特異性為77.80%，陽性預測值為80.00%，陰性預測值為87.50%。結論 VCA+EA多肽片段聯合檢測鼻咽癌有較高敏感性，重復性較好，陰性結果預測較可靠，可作為臨床篩查鼻咽癌的新方法。

鼻咽癌； Epstein-Barr病毒； 免疫球蛋白A

鼻咽癌是我國南方常見惡性腫瘤，廣東為高發區。其發生、發展與Epstein-Barr病毒(EBV)感染密切相關[1]。檢測血清中EBV的某些抗體水平已成為早期診斷鼻咽癌的1種有效手段。目前用于檢測鼻咽癌的血清抗體有多種，包括有EBV持續表達核抗原(EBNA1)產生的EBNA1-免疫球蛋白A(IgA)、EBNAl-免疫球蛋白G(IgG)，BamH1Z轉錄因子Zta產生的Zta-IgA、Zta-IgG和病毒殼抗原(VCA)產生的VCA-IgA、VCA-p18-IgA、 VCA-p18-IgG、gp125-IgA，早期抗原(EA)-IgA[2]，EBV特異性DNA酶(EBV-DNase)抗體，ZEBRA-IgG及近年來新發現的胸苷激酶(TK)抗體等。而檢測血清中抗體方法則包括Western Blot、高效液相色譜(HPLC)，酶聯免疫吸附測定(ELISA)，免疫酶染色法(IEA)，光化學發光法等。臨床常用ELISA檢測患者血清抗體水平。早期診斷鼻咽癌，除檢測血清抗體水平外，還可檢測血清潛伏蛋白LMP-1、小分子RNA[3]。不過，早期診斷方法雖多，但大多準確度、特異性不高，其他則方法復雜、操作繁瑣、進口試劑昂貴，不利于臨床實際運用，尤其是衛生設施條件較差的社區衛生醫療機構。因此，需要尋求1種成熟簡單、價格低廉的方法?，F就中山大學附屬腫瘤醫院研究的VCA+EA多肽片段聯合包被ELISA方法報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 健康人群血液標本100例，收集廣東省龍川縣人民醫院血庫獻血者；陽性血液標本86例，收集自中山大學附屬腫瘤醫院經由鼻咽鏡和(或)病理診斷為鼻咽癌患者。收集后分裝，-20 ℃下保存，避免反復凍融。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 采用Thermo Labsystems MK3酶標儀和鄭州博賽生物工程有限責任公司生產的Biocell-AW1洗板機，上海躍進醫療器械廠生產的XMT-152A 型37 ℃溫育箱。

1.2.2 試劑 由中山大學附屬腫瘤醫院中心實驗室提供磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)、血清和兔抗人抗體稀釋液(1%的PBS-Tween 20，0.1%的牛血清清蛋白，聚乙二醇辛基苯基醚)，辣根過氧化物酶(HRP)標記兔抗人IgA及VCA+EA 多肽片段聯合包被酶標板。北京現代高達生物技術有限公司生產的TMB(3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺)顯色液A、B和0.3 mol/L H2SO4終止液(批號為200902001)。EBNA1+VCA-p18進口IgA檢測試劑盒購自愛爾蘭 Vrije Universiteit Medical Center。

1.3 方法 將1∶100稀釋血清100 μL加入VCA+EA多肽片段聯合包被ELISA酶標板反應孔內，37 ℃溫育1 h，洗滌后加酶標兔抗人IgA 100 μL，37 ℃溫育1 h，洗滌后加顯色液TMB A、B液后暗室顯色10 min，加終止液，在450 nm主波長和630 nm副波長測定OD值。

2 結 果

2.2 線性試驗和線性范圍 取混合血清標本，分別做5點倍比稀釋(未稀釋、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16)。測得平均OD值分別為1.176、0.723、0.587、0.316、0.254，樣品稀釋度與測定值呈線性關系，得其直線回歸方程Y=0.954 5X+0.241 8，r=0.970 9，見圖1。通過對血清和稀釋液比依次為0∶1、1∶250、1∶200、1∶150、1∶100、10∶90、30∶70、60∶40、80∶10、1∶0等不同水平的系列標準品進行測定，每點各測2次，算得平均OD值分別為：0.463、0.456、0.514、1.194、0.734、0.666 5、0.488 5、0.366、0.499 5、0.011，將吸光度與稀釋度繪制成標準曲線，見圖2。數據采用最小二乘法原理，采用SPSS13.0統計軟件處理，得到在血清稀釋100倍(及以上)時血清IgA水平與吸光度呈線性關系。

圖1 線性試驗水平-吸光度曲線

圖2 線性范圍試驗水平-吸光度曲線

2.3 精密度試驗 選取陰性、弱陽性、陽性3例血清標本分別在1 d內重復測試20次，得到日內變異系數分別為3.97%、9.76%、9.23%，見表1。將這3例標本分裝在(-20)℃冰箱保存，每天1次，連續5 d檢測這3例標本，得到日間變異系數為7.56%、10.20%、7.67%，見表2[5]。

表1 日內變異系數測試結果

表2 日間變異變異系數測試結果

2.4 回收試驗 取高OD值和低OD值標本各一例制成混合血清標本，測得混合血清IgA的OD值為0.392[5]，而 IgA標準溶液的OD值為1.02，作4點回收：第1點，混合血清+等體積稀釋液；第2點，混合血清+等體積原倍標準液；第3點，混合血清+(1∶2)倍稀釋等體積標準液；第4點，混合血清+(1∶4)倍稀釋等體積標準液。使其理論OD值分別為0.196，0.706，0.451，0.323 5。測定值分別為0.198，0.71，0.46，0.305，得到IgA回收率分別為100.78%，103.52%，85.49%，平均為96.6%。

2.5 對比試驗 隨機選取正常和異常血清標本各72例(共144例)，分別采用EBNA1+EB-VCA-p18聯合包被ELISA微孔板和VCA+EA 多肽片段聯合包被ELISA微孔板，檢測標本血清中IgA水平的OD值，并將2種方法的測定結果進行比較，得到線性方程Y=0.914 2X，和r=0.959 6。2種方法測定的OD值經統計軟件SPSS13.0計算整理、比較結果[6]，見表3。將數據分為NPC患者和健康人群2組制作箱圖，結果表明，2種方法中鼻咽癌患者和健康人群的中位數差距比較顯著，陰、陽性判斷可靠性較好；2組中位數上下25%不相交，可認為VCA+EA 多肽片段聯合包被ELISA方法可用于疾病診斷。

表3 2種方法OD值比較

2.6 2種方法臨床性能比較 隨機選取正常和異常血清標本各72例(共144例)，分別采用EBNA1+EB-VCA-p18聯合包被ELISA微孔板和VCA+EA 多肽片段聯合包被ELISA微孔板檢測。結果采用SPSS13.0軟件分析。繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)，通過曲線下面積(AUC)計算Cut-off值及2種方法的敏感性、特異性。VCA+EA多肽片段聯合包被ELISA方法Cut-off值為0.242，敏感性為88.90%，特異性為77.80%。EBNA1+EB-VCA-p18聯合包被ELISA方法Cut-off值為0.215，敏感性為88.90%，特異性為80.60%[7]。EBN1+EB-VCA-p18聯合包被ELISA方法的陽性預測值(PPV)為83.12%，陰性預測值(NPV)為88.60%。 VCA+EA 多肽片段聯合包被ELISA方法的PPV為80.00%，NPV為87.50%。見表4。

表4 2種方法臨床性能比較(%)

3 討 論

EBV是1種嗜B細胞的人類皰疹病毒，主要侵犯B細胞，對人體B淋巴細胞親和力高。人類受EBV感染十分普遍，但僅有極少數個體發生惡性腫瘤，且EBV感染個體不論有否發生惡性腫瘤均可產生一系列抗體[8]。EBV與鼻咽癌關系密切，目前常規采用的EBV血清學檢查項目VCA-IgA和EA-IgA仍是鼻咽癌患者臨床篩查、輔助診斷及療效判斷的觀察指標。而血漿中的DNA測定在臨床分型和鼻咽癌療效檢測方面比VCA-IgA和EA-IgA更有價值，特異性和敏感性更高[9]。但是，單純定性地測定血漿中的DNA意義不大，半定量測定DNA需要昂貴的儀器和試劑，對實驗室要求高。所以，需要在免疫學上尋找EBV特異性抗原及其抗體的不同檢測方法，降低成本，提高臨床性能。

通過對VCA+EA多肽片段聯合包被ELISA方法的研究試驗，發現該方法最低檢測限與檢測系統有關，如包括微孔板孔差、酶標儀穩定性、電壓低噪音等。血清IgA水平與吸光度線性相關高度相關，線性相關系數達0.970 9，血清測定線性范圍在稀釋100倍(及以上)時有較好線性，表明該方法臨床采用可行，所需標本量不大。精密度試驗顯示，VCA+EA多肽片段聯合包被ELISA方法的日內變異系數雖在可接受范圍內，但日間變異系數存在大于10%的情況，表明其穩定性還需進一步改進及論證?；厥赵囼灲Y果表明，VCA+EA多肽片段聯合包被ELISA方法準確度可靠，平均回收率達96.6%。

分別采用EBNA1+EB-VCA-p18聯合包被ELISA微孔板和VCA+EA 多肽片段聯合包被ELISA微孔板檢測140例標本，結果相關系數為0.926 6，t檢驗顯示2種方法差異無統計學意義(P>0.05)，具有可替代性。箱圖表明，2種方法中鼻咽癌患者和健康人群的中位數差距比較顯著，陰、陽性判斷可靠性較好；2組中位數上下25%不相交，可認為VCA+EA 多肽片段聯合包被ELISA方法可用于疾病診斷。

從臨床效能ROC曲線分析，EBNA1+EB-VCA-p18聯合包被ELISA方法Cut-off值(0.215)小于VCA+EA 多肽片段聯合包被ELISA方法(0.242)，2種方法的敏感性均為88.90%，表明2種方法診斷能力相當；特異性方面，VCA+EA 多肽片段聯合包被ELISA方法(77.80%)小于EBNA1+EB-VCA-p18聯合包被ELISA方法(80.60%)，提示前者鑒別未患NPC能力稍弱。VCA+EA 多肽片段聯合包被ELISA方法PPV、NPV都高于80%，表明其鑒別能力較好。VCA+EA 多肽片段聯合包被ELISA方法的4個指標均小于EBNA1+EB-VCA-p18聯合包被ELISA方法，表明前者與后者存在一定差距；且其低于Fachiroh等[10]報道的數據，表明其還有改進的空間。從探索新方法檢測血清中IgA水平上看，VCA+EA多肽片段聯合包被ELISA方法的敏感性和NPV已經可以滿足臨床疾病篩查。

ELISA發展已久，已成為一項成熟檢測工藝，其檢測血液中的抗原(抗體)相對比較開放，只要包被不同抗原(抗體)和提供酶標二抗，就可檢測標本中相應抗體(抗原)，并可嘗試用不同的抗原檢測病毒血清抗體[11]，以尋求臨床早期診斷和疾病療效監測的最佳監測條件。VCA+EA多肽片段聯合包被ELISA方法作為一種改進方法，可稱為提高醫療技術水平的1種新途徑。

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Evaluation of double peptides of VCA and EA coated ELISA test in detection of serum EBV IgA

CHENMingxing1,LIAOXiumei1,LIUWanli2△

(1.People′sHospitalofLongchuanCounty,Longchuan,Guangdong517300,China;2.CancerCenterofSunYat-SenUnivercity,Guangzhou,Guangdong510060,China)

Objective To study the value of double peptides of VCA and EA coated ELISA test(EBNA1+ EB-VCA-p18) in serological diagnosis of IgA of Epstein-Barr Viruses(EBV)and to compare the effect with import screening kit.Methods By synthetic peptides EBNA1 and EB-VCA-P18 to establish ELISA assay,serum samples from 86 cases with nasopharyngeal carcinoma and 100 healthy people were collected.And the OD value of IgA was detected.The lowest detectable limit,linearity,precision and recovery were observed.The import ELISA kit of EBV VCA-p18/IgA was used as comparison.Results The lowest detectable limit of this mothed was (0.003 4±0.002 6) after the serum was diluted above 100 times.The level of IgA and absorbance had linear correlation.Daily variation coefficients of the level of IgA in negative samples,weakly positive samples and positive samples were 3.97%,9.76% and 9.23% respectively.Between-day variation coefficients were 7.56%,10.20% and 7.67% respectively.The double peptides of VCA+EA coated ELISA test was positively correlated with EBNA1+EB-VCA-p18 coated ELISA test(r=0.926).The sensitivity,specificity,positive predictive value,negative predictive value of the test were 88.90%,77.80%,80.00% and 87.50% respectively.Conclusion The double peptides of VCA+EA coated ELISA test has good sensitivity and repeatability,and negative predictive results are reliable,which could be used as a new way to screen nasopharyngeal carcinoma.

nasopharyngeal carcinoma; Epstein-Barr viruses; IgA

陳明星，男，主管技師，主要從事化學發光免疫學檢測和病原微生物方面的研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.21.028

A

1673-4130(2016)21-3024-03

2016-02-03

2016-04-23)