紅樹莓多酚的醇法提取工藝優化

曠 慧，遲 超，呂長山，王 萍，趙 鑫，王金玲,*

（1.東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北農業大學應用技術學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

紅樹莓多酚的醇法提取工藝優化

曠 慧1，遲 超1，呂長山2，王 萍1，趙 鑫1，王金玲1,*

（1.東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北農業大學應用技術學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

以‘菲爾杜德’、‘寶石紅’紅樹莓果實為原料，采用醇法提取紅樹莓多酚。以乙醇為提取溶劑，以乙醇體積分數、提取溫度、料液比、提取時間、提取次數為因素，以多酚提取量為指標，通過單因素試驗及L9（34）正交試驗優化醇法提取紅樹莓多酚的工藝參數，同時采用鄧肯多重范圍檢驗法檢驗不同處理間的差異顯著性。結果表明，‘菲爾杜德’紅樹莓多酚的最佳提取工藝參數為乙醇體積分數70%（pH 6）、提取溫度45 ℃、料液比1∶6（g/mL）、提取時間3.5 h、提取2 次；‘寶石紅’紅樹莓多酚的最佳提取工藝參數為乙醇體積分數65%（pH 6）、提取溫度45 ℃、料液比1∶5（g/mL）、提取時間3.5 h、提取2 次。在此條件下，兩種紅樹莓多酚提取量分別為（373.78±4.08）、（287.08±4.91）mg/100 g。該工藝可靠、穩定，具有一定的參考價值。

紅樹莓；多酚；提取；正交試驗；鄧肯多重范圍檢驗法

紅樹莓（Rubus ideaus L.）為薔薇科漿果，俗名托盤、覆盆子、馬林等，作為第三代保健型水果，它在世界上享有“黃金水果”的聲譽[1]。紅樹莓果實中不僅富含果糖、有機酸、維生素、氨基酸、礦物質等基本營養成分，同時含有大量的酚類物質，如酚酸、黃酮、花色苷、鞣花酸、樹莓酮、水楊酸等[2-3]；研究[4]表明，這些

酚類物質具有抗氧化、抗炎、抗增殖、治療心血管疾病、抑菌等生物學功能。有研究顯示，紅樹莓的抗氧化活性與多酚具有密切聯系。Maksimovic等[5]發現秋福果實的抗氧化活性（對2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基的清除能力）與總酚含量相關性極顯著（R2=0.999 9）；王睿婷等[6]研究發現紅樹莓果實對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼和2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基的清除率與多酚含量顯著相關；Wang等[7]報道黑樹莓和紅樹莓的抗氧化活性與總酚含量具有線性相關關系（r分別為0.961和0.911）。有機溶劑提取法是提取植物多酚時最常用的方法之一[8]。乙醇、甲醇、丙酮等能有效地破壞多酚與蛋白質、多糖間的分子作用力，且它們與水形成的復合體系能有效地使植物多酚溶出，但有機溶劑提取法也存在溶劑使用量大、耗時長、產品安全性低等缺點[9]。

植物多酚因其對人體健康的積極作用已成為目前研究的熱點[10]，但國內外對于紅樹莓的研究主要集中在花色苷、樹莓酮、鞣花酸等功能因子上，研究內容主要是這些因子的生理活性如抗氧化、抗腫瘤、抑菌、治療心血管疾病等，但關于紅樹莓多酚的系統研究報道較少。本研究以產量高、品質好、耐貯運性強的兩個栽培品種紅樹莓[11]（‘菲爾杜德’和‘寶石紅’）為材料，通過單因素試驗及正交試驗對醇法提取紅樹莓多酚的工藝進行了優化，并采用鄧肯多重范圍檢驗法對顯著因素進行系統分析，得到了提取紅樹莓多酚的最佳工藝參數，以期為紅樹莓多酚的開發、應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘菲爾杜德’、‘寶石紅’兩種紅樹莓采自黑龍江省尚志市，速凍處理后運回東北林業大學食品科學與工程實驗室凍藏。

沒食子酸（分析純） 上海源葉生物科技有限公司；福林-酚試劑 天津市光復精細化工研究所；無水碳酸鈉、磷酸緩沖溶液、磷酸、無水乙醇、丙酮 天津市天力化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ALC-1104電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；TDL-5-W臺式低速離心機 湖南星科科學儀器有限公司；DHG-9240型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；722S可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；RE-2000A旋轉蒸發器 河南省鞏義市予華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅樹莓多酚的提取工藝

1.3.2 紅樹莓多酚提取量的測定

參考Pantelidis等[12]方法，采用福林酚法，以沒食子酸標準溶液質量濃度（mg/mL）為橫坐標，溶液吸光度為縱坐標，得到標準曲線為：y=9.917 7x+0.036 0（R2=0.998 7）。紅樹莓果實中多酚提取量以每100 g紅樹莓果實（鮮質量）中總酚的毫克數表示。

1.3.3 提取溶劑種類的確定

選擇甲醇、無水乙醇、水、丙酮、乙酸乙酯、70%丙酮溶液、70%乙醇溶液7 種溶劑作提取劑。準確稱取7 份冷凍紅樹莓果實各10 g，研磨均勻后置于燒瓶中，按1∶5（g/mL）加入提取劑，40 ℃條件下振蕩提取3 h后離心，旋轉蒸發，回收溶劑，得到多酚粗提物。平行3 組實驗。通過測定多酚提取量來確定提取紅樹莓多酚的最佳提取溶劑。

1.3.4 醇法提取紅樹莓多酚的單因素試驗

以乙醇作為提取溶劑，按照1.3.1節中的工藝提取紅樹莓多酚。通過單因素試驗進一步確定乙醇體積分數、提取溫度、料液比、提取時間、提取次數對紅樹莓多酚提取效果的影響。單因素水平設計見表1。固定條件為：乙醇體積分數70%、提取溫度40 ℃、料液比1∶5（g/mL）、提取時間3 h、溶劑pH 7、提取次數1。

表1 單因素試驗因素及水平設計Table 1 Factors and levels used in single-factor tests

1.3.5 正交試驗設計

以乙醇體積分數、提取溫度、料液比和提取時間為試驗因素，以多酚提取量為試驗指標，采用L9（34）正交表進行試驗，因素水平設計如表2所示（每組試驗重復3 次，提取2 次）。

表2 正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels used in orthogonal array tests

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 提取溶劑種類的確定

圖1 溶劑種類對紅樹莓多酚提取效果的影響Fig. 1 Effects of different solvents on the extraction effi ciency of polyphenols from red raspberry

由圖1可知，不同極性溶劑對紅樹莓多酚的提取效果不同。紅樹莓多酚在有機溶劑如甲醇、丙酮、無水乙醇等中溶解性相對較大，丙酮對紅樹莓多酚的提取效果最好，其次是無水乙醇。當用70%丙酮溶液和70%乙醇溶液提取時，它們對紅樹莓多酚的提取效果優于單一有機溶劑/水。70%乙醇溶液對‘菲爾杜德’紅樹莓多酚的提取效果更好（326.89 mg/100 g），而70%丙酮溶液對‘寶石紅’紅樹莓多酚的提取量更高（246.71 mg/100 g），但考慮到乙醇和丙酮的安全性、成本和毒性，選擇70%乙醇溶液作為提取紅樹莓多酚的溶劑。

2.2 單因素試驗結果

圖2 乙醇體積分數（A）、提取溫度（B）、料液比（C）、提取時間（D）和提取次數（E）對紅樹莓多酚提取效果的影響Fig. 2 Effects of ethanol concentration, extraction temperature, ratio of solid to solvent, extraction time and number of extraction cycles on the extraction effi ciency of polyphenols from red raspberry

由圖2A可知，乙醇體積分數在40%～70%范圍時，紅樹莓多酚的提取量隨著乙醇體積分數的增大而升高，70%乙醇溶液時兩種紅樹莓多酚提取量最高，分別為333.72、253.79 mg/100 g。乙醇體積分數繼續增大時，紅樹莓多酚提取量反而下降。原因可能是當乙醇體積分數較高時（＞70%）會增大醇溶性雜質、色素、強親脂性物質的溶解，這些物質抑制了多酚同乙醇-水分子的結合能力；過高的乙醇體積分數會使植物細胞失水而降低通透性，也會影響多酚的滲出，導致多酚提取量下降[13]。

由圖2B可知，在提取溫度為30～40 ℃范圍內時，紅樹莓多酚的提取量隨著提取溫度的升高而顯著提高，當提取溫度為40 ℃時，兩種紅樹莓多酚的提取量最高，分別為329.05、254.70 mg/100 g。當溫度繼續升高時，紅樹莓多酚的提取量反而下降。溫度適當升高時，分子運動加速，多酚與蛋白質、糖類等分子間的氫鍵更易斷裂，多酚物質的滲透和擴散速率也加快，從而使多酚類物質更易于溶出[14]。但過高的溫度也會使多酚發生氧化或者降解等一些不可逆的化學反應[15]。

由圖2C可知，料液比在1∶3～1∶5（g/mL）范圍內時，紅樹莓多酚的提取量隨著溶劑用量的升高而增大，當料液比為1∶5時，兩種紅樹莓多酚的提取量最大，分別為331.57、247.12 mg/100 g。當溶劑用量繼續增大時，紅樹莓多酚的提取量反而下降。固液之間的質量濃度梯度是提取物發生轉移的動力，通過提高溶劑用量，可以增加質量濃度梯度，有利于提取物的溶出。但當料液比達到某一極限時，再提高料液比收效不大或抑制多酚的滲出[16]。

由圖2D可知，當提取時間在1～3 h內時，紅樹莓多酚的提取量隨著時間的延長而逐漸增大，當提取時間為3 h時，兩種紅樹莓多酚的提取量最大，分別為312.43、239.01 mg/100 g。當提取時間繼續延長時，紅樹莓多酚提取量反而下降。過長的提取時間會使多酚類物質分解，降低提取量[17]。

由圖2E可知，當提取次數為2時，兩種紅樹莓多酚的提取量分別為358.73、261.30 mg/100 g，與提取1次相比，分別提高了10.18%、8.94%。當提取次數為3時，兩種紅樹莓多酚的提取量幾乎不再增大，因此提取次數為2 次。

2.3 正交試驗結果

根據單因素試驗結果，選取乙醇體積分數、提取溫度、料液比、提取時間為試驗因素，以多酚提取量為試驗指標，利用L9（34）正交試驗進一步優化醇法提取紅樹莓多酚的工藝條件。正交試驗設計與結果見表3。

表3 正交試驗設計與結果Table 3 Orthogonal array design with experimental results

2.3.1 ‘菲爾杜德’紅樹莓多酚最優提取條件的選擇

表4 正交試驗結果的方差分析（‘菲爾杜德’）Table 4 Analysis of variance for the extraction yield of polyphenols from ‘Fertod Zamatos’ red raspberry

由表3、4可知，4 個因素的主次順序為提取溫度＞乙醇體積分數＞提取時間＞料液比，乙醇體積分數、提取溫度、料液比和提取時間對‘菲爾杜德’紅樹莓多酚提取效果都具有極顯著的影響[18]。在本正交試驗設計中，對于B因素，‘菲爾杜德’紅樹莓多酚的提取量在B3和B1水平間具有極顯著差異，在B1和B2水平間的差異不顯著，其中以B3為最好。對于A因素，‘菲爾杜德’紅樹莓多酚提取量在各個水平間具有極顯著差異，實踐中選取A2為最佳水平。對于C因素和D因素，‘菲爾杜德’紅樹莓多酚提取量在D3和D2、C3和C2水平間具有極顯著差異，但在D2和D1、C2和C1水平間差異不顯著；實踐中可以選取D3和C3為最佳水平。綜合比較得出：提取‘菲爾杜德’紅樹莓多酚的最優條件為B3A2D3C3，即提取溫度45 ℃、乙醇體積分數70%、提取時間3.5 h、料液比

1∶6（g/mL）、提取2 次。

2.3.2 ‘寶石紅’紅樹莓多酚最優提取條件的選擇

表5 正交試驗結果的方差分析（‘寶石紅’）Table 5 Analysis of variance for the extraction yield of polyphenols ffrroomm ‘U.S. Raspberry’

由表3、5可知，4 個因素的主次順序為提取溫度＞料液比＞提取時間＞乙醇體積分數，乙醇體積分數、提取溫度、料液比和提取時間對‘寶石紅’紅樹莓多酚提取效果都具有極顯著的影響。在正交試驗設計中，對于B因素，‘寶石紅’紅樹莓多酚的提取量在B3和B1水平間具有極顯著差異，在B1和B2間差異不顯著，其中以B3為最好。對于C因素，‘寶石紅’紅樹莓多酚的提取量在各水平上具有極顯著差異，實踐中選取C2為最佳。對于

D因素，‘寶石紅’紅樹莓多酚提取量在D3和D1差異極顯著，而在D2和D1水平上無顯著差異，選擇D3為最佳水平。對于A因素，‘寶石紅’紅樹莓多酚提取量在A2和A1水平上差異不顯著，而在A1與A3水平上差異極顯著，實際中選取A1為最佳水平。綜合比較得出：提取‘寶石紅’紅樹莓多酚的最優條件B3C2D3A1，即提取溫度45 ℃、料液比1∶5（g/mL）、提取時間3.5 h、乙醇體積分數65%、提取2 次。

2.3.3 驗證實驗結果

在正交試驗結果的基礎上進行了驗證實驗，在最佳條件下提取紅樹莓多酚，‘菲爾杜德’和‘寶石紅’兩個品種紅樹莓多酚的提取量分別達到（373.78±4.08）、（287.08±4.91）mg/100 g，都大于正交試驗中的最大值，進一步驗證了該條件的可行性。

3 討 論

在實驗中發現，溶劑pH值變化對紅樹莓多酚提取效果的影響呈現不規律變化（數據未列出）。當溶劑pH值在2～4范圍內時，紅樹莓多酚的提取量隨著pH值升高反而下降，在溶劑pH值在4～6范圍內時，紅樹莓多酚的提取量隨著pH值的升高而增大，在溶劑pH值為6時，兩種紅樹莓多酚的提取量最大，分別為（336.88±6.66） mg/100 g和（237.35±4.72） mg/100 g。當溶劑pH值為2時，兩種紅樹莓多酚的提取量分別為（317.57±2.25） mg/100 g和（232.97±2.52） mg/100 g，與溶劑pH 6時兩種紅樹莓多酚的提取量接近，可能原因是強酸性條件（pH值小于2）破壞了多酚物質與糖類、蛋白質、酯類等之間的化學鍵，使結合力強的多酚被提取出來[19]；或破壞了低聚/多聚酚類物質間的結合力，使單體多酚游離出來；或增強了反應體系的酸性環境，使福林-酚試劑與樣液間的顯色反應更劇烈，導致吸光度的增大[20]。同時發現堿性條件會顯著降低紅樹莓多酚的提取量，這與馮進等[21]對藍莓葉多酚的研究結果一致；堿性條件中的OH－與多酚結構中苯環上的多羥基取代基互相排斥，干擾多酚物質與乙醇-水分子的結合，導致多酚提取量下降[22]。

在這2 個紅樹莓品種中，‘菲爾杜德’比‘寶石紅’含有更多的多酚物質（約1.37 倍），更適合作為開發功能活性成分營養品的原料。根據單因素試驗結果發現，在相同條件下，與‘菲爾杜德’相比，高體積分數乙醇、高溫、較大溶劑用量、過長的提取時間等因素對‘寶石紅’中多酚提取效果的影響更顯著，使其多酚提取量下降得更快。如當乙醇體積分數從70%增大到80%、溫度從40 ℃升高到70 ℃、料液比從1∶5變化到1∶12時，‘菲爾杜德’和‘寶石紅’兩種紅樹莓多酚的提取量分別降低了21.54%和34.11%、13.17%和27.80%、21.79%和33.85%。表明這兩個紅樹莓品種中的多酚物質成分可能有一定差異，‘菲爾杜德’中多酚物質的穩定性高于‘寶石紅’[23]。

4 結 論

通過方差分析（F檢驗）只能推論出各處理間在總體上有無顯著性差異，而通過鄧肯多重范圍檢驗法對顯著因素的各水平間均值進行兩兩比較，能客觀地分析某顯著因素在某水平間是否具有顯著差異性，從而幫助研究人員根據試驗設計要求推斷出更可靠、更具有實際意義的結果。

實驗結果表明，溫度對醇法提取紅樹莓多酚具有顯著的影響，實踐生產過程中需選擇合適的溫度來提高紅樹莓多酚產量及避免多酚降解。‘菲爾杜德’紅樹莓果實比‘寶石紅’中含有更多多酚物質，是人體攝取天然保健食品的良好來源，也是開發功能食品的重要資源。

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Optimization of Ethanol Extraction Process for Polyphenols from Red Raspberry

KUANG Hui1, CHI Chao1, Lü Changshan2, WANG Ping1, ZHAO Xin1, WANG Jinling1,*
(1. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2. School of Applied Technology, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Fruits from two different cultivars of red raspberry, ‘Fertod Zamatos’ and ‘U.S. Raspberry’, were selected for extracting polyphenols using ethanol as the solvent. Optimization of extraction parameters was carried out using onefactor-at-a-time method and an orthogonal array design L9(34). Ethanol concentration, extraction temperature, solid-tosolvent ratio, extraction time and number of extraction cycles were chosen as the independent variables. The response was the extraction yield of polyphenols. Duncan’s Mutiple-Range test was adopted to examine the signifi cance of differences among various treatments. The optimal extraction conditions for polyphenols were established as follows： 70% (V/V) ethanol (pH 6), 45 ℃, solid-to-solvent ratio of 1：6 (g/mL), 2 extraction cycles, and 3.5 h each cycle for ‘Fertod Zamatos’; and 65% (V/V) ethanol (pH 6), 45 ℃, solid-to-solvent ratio of 1：5 (g/mL), 2 extraction cycles, and 3.5 h each cycle for ‘U.S. Raspberry’. The corresponding yields of polyphenols from these two cultivars were (373.78 ± 4.08) mg/100 g and (287.08 ± 4.91) mg/100 g, respectively. These results indicated that the extraction procedure was reliable, stable and practical.

red raspberry; polyphenols; extraction; orthogonal array test; Duncan’s mutiple-range test

10.7506/spkx1002-6630-201610015

S663.2；TS255.1

A

1002-6630（2016）10-0088-06

曠慧, 遲超, 呂長山, 等. 紅樹莓多酚的醇法提取工藝優化[J]. 食品科學, 2016, 37(10): 88-93. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20161015. http://www.spkx.net.cn

KUANG Hui, CHI Chao, Lü Changshan, et al. Optimization of ethanol extraction process for polyphenols from red raspberry[J]. Food Science, 2016, 37(10): 88-93. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610015. http://www.spkx.net.cn

2015-08-24

卓越農林人才教育培養計劃改革試點項目（41110211）；中央高校基本科研業務費專項（2572014CA14）

曠慧（1992—），女，碩士研究生，研究方向為植物源活性物質。E-mail：belonghui2010@163.com

*通信作者：王金玲（1975—），女，副教授，博士，研究方向為植物源活性物質。E-mail：wangjinling08@163.com