UPLC快速測定葡萄酒中酚類物質的方法

張星星，郭安鵲,2，韓富亮,2，張予林,2,*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊陵 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術中心，陜西 楊陵 712100)

UPLC快速測定葡萄酒中酚類物質的方法

張星星1，郭安鵲1,2，韓富亮1,2，張予林1,2,*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊陵 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術中心，陜西 楊陵 712100)

建立一種新型、快速測定葡萄酒中多種單體酚的超高效液色譜方法。采用Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；色譜條件：流動相A為1%乙酸溶液，流動相B為乙腈；流速為0.2 mL/min；檢測波長為210～400 nm；梯度洗脫15 min。方法精密度（n=6）實驗的17 種酚類物質的平均相對標準偏差為0.25%～0.66%，對葡萄酒進行加標回收率實驗的17 種酚類物質回收率范圍為85.10%～102.33%。該方法簡單省時、精確可靠、重復性好，非常適用于葡萄酒中酚類物質的定性與定量分析。

超高效液相色譜；葡萄酒；單體酚；測定方法

適量規律性地飲用葡萄酒有益身體健康，葡萄酒特別是紅葡萄酒中種類、含量豐富的酚類物質，具有抗癌、抗氧化及預防心血管疾病等多種功能，是葡萄酒中營養成分的主要來源[1-3]。同時，作為葡萄酒的“骨架”成分，酚類物質不僅決定著葡萄酒澀味和苦味的強弱，而且影響著葡萄酒的色澤及生物化學穩定性[4-5]，也是決定葡萄酒品質的關鍵因素。因此，建立快速、準確分析葡萄酒中酚類物質的方法對全面評價葡萄酒營養價值、進而提高葡萄酒的質量具有重要意義。

葡萄酒中酚類物質主要的測定方法有光譜法[6]、電化學法[7-8]、色譜法[9-18]，其中色譜法是目前酚類物質最常用的檢測方法。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）結合多種檢測器可實現對葡萄酒中多種酚類物質的定性與定量分析[9-13]，但該法存在分析時間長、有機溶劑消耗多等缺點。超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）柱采

用粒徑為1.7 μm的填料，柱效高，能獲得更好的線速度范圍從而提高分析速率與靈敏度，具備快速、靈敏、分離度高的技術特點[14]，國外已有將其應用于葡萄酒中酚類物質檢測的研究[15-18]。國內利用UPLC主要用于葡萄酒中食品添加劑、工業色素等物質的檢測分析[19-21]，有關酚類物質分析的較少。趙建勇等[14]建立了一種測定葡萄酒中7 種單體酚含量的UPLC檢測方法。

本研究利用離心代替傳統分液漏斗萃取，通過改進成宇峰等[22]的前處理方法，有效降低有機溶劑與酒樣的使用量。同時，采用多波長檢測，提高不同種類酚類物質定量檢測的精確性和準確性；建立UPLC測定葡萄酒中酚類物質色譜條件，提高色譜峰分離度并縮短測定時間；最終建立一種能夠快速、高效測定葡萄酒中單體酚的UPLC分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗中一共10 款供試酒樣，酒樣具體信息如表1所示。

表1 葡萄酒供試樣品Table 1 Information of wine samples

標準樣品：香草酸、阿魏酸、水楊酸 美國Fluka公司；安息香酸、反式白藜蘆醇 美國Alorich公司；綠原酸、香豆素、桑色素、蘆丁、咖啡酸、香豆酸、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、槲皮素、橘皮素、山奈酚、丁香酸 美國Sigma公司。

甲醇、乙腈（色譜級），乙酸、乙酸乙酯（分析純），均為國產試劑。

1.2 儀器與設備

UPLC I-Class儀（Empower色譜工作站、二極管陣列檢測器、自動進樣器） 美國Waters公司；BT25S 十萬分之一天平 德國Startorius公司；A.9901S真空抽濾器、AS 3120B超聲波脫氣機 奧特賽恩斯公司；watef Millipore純水機 英國Millipore公司；RE-52AA薄膜旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準樣品制備

單體酚單個標準樣品制備：用十萬分之一天平，準確稱取17 種單體酚的標準物質，分別加入10 mL容量瓶中，用色譜甲醇溶解并定容至10 mL，配成不同質量濃度不同單體酚的標準物質儲備液。

單體酚混合標準樣品制備：用十萬分之一天平，準確稱取17 種單體酚的標準物質加入10 mL容量瓶中，用色譜甲醇溶解并定容至10 mL，配成混合標準樣品母液。配制的單體酚混合標準溶液梯度質量濃度如表2所示。

表2 混合標準樣品不同濃度梯度Table 2 Different levels of mixed standard solutions

1.3.2 前處理

實驗改進成宇峰等[22]單體酚提取方法；取10 mL酒樣加入等體積的乙酸乙酯旋渦振蕩后離心，取上層清液于100 mL圓底燒瓶，重復萃取3 次合并上清液于減壓蒸餾旋干（35 ℃），甲醇溶解殘渣，-20 ℃冰箱保存，留作色譜分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：BEH C18反相色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流速0.2 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長210～400 nm；流動相：A相為體積分數為1%乙酸，B相為乙腈；梯度洗脫。

梯度洗脫程序：0～3 min，B相3%～6%，3～7 min，B相為6%～15%，7～11 min，B相為15%～30%，11～13 min，B相為30%，13～15 min，B相為30%～3%。

2 結果與分析

2.1 UPLC測定葡萄酒酚類物質色譜條件的確定

2.1.1 流動相與洗脫梯度的確定

圖1 不同乙酸體積分數條件下混合標準樣品色譜圖（λ=280 nm）0 nmFig. 1 Chromatogram of mixed standard in acetic acid solutions of different concentrations (λ = 280 nm)

根據張予林等[23]測定單體酚HPLC色譜條件，利用HPLC-UPLC方法器轉換得到初級洗脫梯度：0～3 min，B相為3%～6%；3～7 min，B相為6%～15%；7～11 min，B相為15%～30%；11～13 min，B相為30%；13～16 min，B相為30%～3%。采用2%乙酸-乙腈流動相體系，為使峰分離效果更好，實驗調整乙酸溶液的質量濃度，將流動相A調整為體積分數3%、2%、1%、0.5%乙酸溶液，對混合標準樣品進行色譜分析。由圖1可知，流動相乙酸體積分數為1%時，17 種單體酚均達到基線峰分離，分離效果最佳。因此選擇A（1%乙酸）-B（乙腈）作為流動相。在原有的洗脫梯度上調整，得到最終流動相及洗脫梯度如表3所示。

表3 流動相與洗脫梯度Table 3 Mobile phase composition for gradient elution

2.1.2 色譜柱檢測溫度

圖2 不同柱溫條件下混合標準樣品色譜圖（ =280 nm）Fig. 2 Chromatograms of mixed standard at different column temperatures (λ = 280 nm)

UPLC柱檢測溫度一般設定為高于室溫5 ℃，過高溫度對酚類物質結構會有影響，因此本實驗設定2 個柱溫：35 ℃與30℃，測定結果如圖2所示。當色譜柱檢測溫度為35 ℃，較高的柱溫導致物質分配系數減小，17 種單體酚標樣色譜峰未達到基線分離；當柱溫為30 ℃時，17 種單體酚色譜峰均達到基線分離。因而最終選擇30 ℃作為色譜柱檢測溫度。

2.1.3 UPLC測定酚類物質色譜條件

最終確定的UPLC條件如表4所示，在此色譜條件下分別對17 種單體酚單個標準樣品進樣，確定每種物質最大吸收波長與保留時間，如表5所示。根據單個標準樣品的最大吸收波長與保留時間對混合標準樣品中17 種單體酚進行定性，測定結果如圖3所示。

表4 測定17 種單體酚最終UPLC色譜條件Table 4 Optimal UPLC chromatographic conditions for 17 monophenols

表5 17 種單體酚最大吸收波長、保留時間與相對分子質量Table 5 Maximum absorbance wavelengths, retention times, and molecular weights of 17 mono-phenols

圖3 17 種單體酚測定色譜圖（λ=2800 nnmm）Fig. 3 Chromatogram of a mixture of 17 standards (λ = 280 nm)

2.2 UPLC測定葡萄酒中酚類物質方法評價結果

2.2.1 標準樣品及標準曲線方程

按照表2配制7 種不同質量濃度梯度的混合標準樣品，按照表4色譜條件，分別進樣測定。以質量濃度（mg/L）為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到17 種單體酚的標準曲線方程，如表6所示。由標準曲線方程可知，17 種單體酚線性關系決定系數均在0.999 8～1.000 0，說明單體酚在質量濃度范圍內線性關系良好。

表6 17 種單體酚最大吸收波長、保留時間與標準曲線Table 6 Maximum absorbance wavelengths, retention times, and regression equations for 17 monophenols

2.2.2 方法精密度

表7 17 種單體酚精密度實驗結果Table 7 Results of precision for 17 monophenols (n = 6)

在確定的UPLC條件下測定高中低3 個質量濃度的混合標準樣品，重復測定6 次，計算測定結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），如表7所示。17 種單體酚在高中低3 個質量濃度梯度峰面積的平均RSD范圍為0.25%～0.66%，說明方法精密度良好。

2.2.3 方法回收率

加標葡萄酒與原葡萄酒利用改進前處理方法提取單體酚，利用UPLC測定17 種單體酚含量，計算每種單體酚的回收率，如表8所示。UPLC測定葡萄酒中17 種單體酚加標回收率范圍為85.10%～102.33%，說明方法的準確度高。

表8 17 種單體酚回收率實驗結果（n==33）Table 8 Results of recovery for 17 monophenols (n == 33))

2.2.4 方法重復性

表9 17 種單體酚重復性實驗結果（n =3)Table 9 Results of repeatability for 17 monophenols (n =3)

同一葡萄酒酒樣利用改進的前處理方法提取單體酚，重復處理3 次，UPLC測定得到17 種單體酚含量，計算3 次測定結果RSD，如表9所示。UPLC測定葡萄酒中17 種單體酚，結果表明含量RSD為0.394%～10.367%，說明方法的重復性較好。

2.3 UPLC測定葡萄酒中酚類物質含量結果

圖4 葡萄酒樣2色譜圖（λ=2800 nnmm）Fig. 4 Chromatogram of wine sample (λ = 280 nm)

表10 10 種葡萄酒樣單體酚含量（n==33）Table 10 Contents of 17 monophenols in 10 different wine samples (n == 33)) mg/L

利用改進的前處理方法提取葡萄酒中單體酚，重復處理3 次，利用確定的UPLC條件測定葡萄酒中17 種單體酚含量，計算3 次處理單體酚含量的RSD。如圖4、表10所示，10 種葡萄酒中17 種單體酚總含量在13.82～253.56 mg/L，其中酒樣7為威代爾白葡萄酒單體酚總含量較低為13.82 mg/L；紅葡萄酒單體酚總含量較高在131.93～253.56 mg/L。供試酒樣中桑色素均未檢測出。

3 討 論

前處理方法是UPLC法測定葡萄酒中酚類物質的關鍵步驟[1]，實驗利用離心代替分液漏斗萃取。分液漏斗萃取過程單體酚與空氣接觸時間長易與氧氣反應，造成損失[24]。實驗采用離心降低單體酚在前處理過程中的損失，提高了測定方法的準確性。

利用色譜法對多組分體系進行測定時，由于各組分的最大吸收波長不盡相同，利用恒定波長很難準確測定組分的真實含量[25]。實驗選擇二極管陣列檢測器，在波長210～400 nm處對17 種待測單體酚進行全波長掃描，根據測定結果在每種單體酚的最大吸收波長處對其定性與定量分析，提高了測定方法的準確度與靈敏度。

本實驗利用建立的UPLC條件對10 種供試葡萄酒單體酚進行測定，桑色素均未檢出。桑色素化學名為3,5,7,2’,4’-五羥基黃酮，屬黃酮醇類物質，空氣中易氧化為黃色。目前測定葡萄酒中桑色素結果大都表明未檢出[26-27]。分析原因主要是酒樣中桑色素含量很少，可通過擴大樣品數量，進一步研究葡萄酒中桑色素的含量。

4 結 論

本實驗建立了分析葡萄酒中單體酚的UPLC條件，對葡萄酒中17 種單體酚進行分析檢測，主要研究結果如下：

確定了UPLC分析葡萄酒中17 種單體酚的方法。前處理方法：取10 mL酒樣加入等體積的乙酸乙酯旋渦振蕩后離心，重復萃取3 次合并上清液于減壓蒸餾旋干（35 ℃），甲醇溶解殘渣，0.22 μm膜過濾，-20 ℃保存。色譜條件：BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）反相色譜柱；流動相A為體積分數1%乙酸溶液，流動相B為乙腈；洗脫梯度為B相0～3 min為3%～6%，3～7 min為6%～15%，7～11 min，為15%～30%，11～13 min為30%，13～15 min為30%～3%；進樣量0.5 μL；流速0.2 mL/min；色譜柱檢測溫度30 ℃；色譜柱平衡時間2.1 min；梯度洗脫時間15 min。

建立的UPLC測定葡萄酒中酚類物質方法，精密度實驗結果表明，17 種單體酚含量的RSD在0.25%～0.66%；加標回收率實驗表明，加標回收率在85.10%～102.33%之間；方法重復性實驗結果，單體酚含量的相對標準偏差在0.394%～10.367%，說明方法的精密度、重復性好、準確度高。

通過對10 種供試葡萄酒單體酚測定，實驗結果表明，葡萄酒中單體酚含量豐富，不同單體酚質量濃度差異較大；供試葡萄酒酒樣中桑色素均未檢出。

[1] LORRAIN B, KY I, PECHAMAT L, et al. Evolution of analysis of polyhenols from grapes, wines, and extracts[J]. Molecules, 2013, 18(1): 1076-1100. DOI:10.3390/molecules18011076.

[2] GARRIDO J, BORGES F. Wine and grape polyphenols-a chemical perspective[J]. Food Research International, 2011, 44(10): 3134-3148. DOI:10.1016/j.foodres.2011.11.001.

[3] ROUSSIS I G, LAMBROPOULOS I, TZIMAS P, et al. Antioxidant activities of some greek wines and wine phenolic extracts[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2008, 21(8): 614-621. DOI:10.1016/ j.jfca.2008.02.011.

[4] 劉一健, 孫劍鋒, 王頡. 葡萄酒酚類物質的研究進展[J]. 中國釀造, 2009, 28(8): 5-9. DOI:10.3969/j.issn.0254-5071.2009.08.002.

[5] JENSEN J S, DEMIRAY S, EGEBO M, et al. Prediction of wine color attributes from the phenolic profi les of red grapes (Vitis vinifera)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(3): 1105-1115. DOI:10.1021/jf072541e.

[6] 趙芳, 郝亞楠, 戰吉宬. 光譜技術在葡萄酒原產地識別中的應用進展[J]. 中國釀造, 2014, 33(8): 1-5. DOI:10.11882/ j.issn.0254-5071.2014.08.001.

[7] 劉芳華, 彭友元, 葉建農. 毛細管電泳-電化學檢測法測定葡萄和葡萄酒中的白藜蘆醇[J]. 分析測試學報, 2005, 24(3): 125-127. DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2005.03.035.

[8] ARRIBAS A S, MARTíNEZ-FERNáNDEZ M, CHICHARRO M. The role of electroanalytical techniques in analysis of polyphenols in wine[J]. TrAc Trends in Analytical Chemistry, 2012, 34: 78-96. DOI:10.1016/j.trac.2011.10.015.

[9] BURIN V M, ARCARI S G, BORDIGNON-LUIZ M T, et al. Determination of some phenolic compounds in red wine by RP-HPLC: method development and validation[J]. Journal of Chromatographic Science, 2011, 49(8): 647-651. DOI:10.1093/chrsci/49.8.647.

[10] 于貞, 李記明. 用HPLC法測定干紅葡萄酒中的酚類物質[J]. 釀酒, 2002, 29(2): 88-89. DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2002.02.036.

[11] 成宇峰, 張振文, 岳泰新, 等. HPLC同時檢測葡萄酒中10 種單體酚的方法[J]. 食品科學, 2008, 29(4): 287-290. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2008.04.060.

[12] 陳建業, 溫鵬飛, 戰吉成, 等. 葡萄酒中11 種酚酸的反相高效液相色譜測定方法研究[J]. 中國食品學報, 2007, 6(6): 133-138. DOI:10.3969/j.issn.1009-7848.2006.06.027.

[13] 陳曦, 周小平, 韓舜愈, 等. HPLC測定葡萄和葡萄酒中花色苷[J]. 光譜實驗室, 2013, 30(4): 1704-1709. DOI:10.3969/ j.issn.1004-8138.2013.04.044.

[14] 趙建勇, 任水英. UPLC法同時檢測新疆葡萄酒中的7 種單體酚[J]. 中國釀造, 2015, 34(2): 139-141. DOI:10.11882/ j.issn.0254-5071.2015.02.031.

[15] SCHWARZ M, RODRíGUEZ M C, GUILLéN D A, et al. Development and validation of UPLC for the determination of phenolic compounds and furanic derivatives in Brandy de Jerez[J]. Journal of Separation Science, 2009, 32(11): 1782-1790. DOI:10.1002/ jssc.200800706.

[16] SILVA C L, PEREIRA J, WOUTER V G, et al. A fast method using a new hydrophilic-lipophilic balanced sorbent in combination with ultra-high performance liquid chromatography for quantification of signifi cant bioactive metabolites in wines[J]. Talanta, 2011, 86: 82-90. DOI:10.1016/j.talanta.2011.08.007.

[17] FRACASSETTI D, LAWRENCE N, TREDOUX A G J, et al. Quantification of glutathione, catechin and caffeic acid in grape juice and wine by a novel ultra-performance liquid chromatography method[J]. Food Chemistry, 2011, 128(4): 1136-1142. DOI:10.1016/ j.foodchem.2011.04.001.

[18] GRUZ J, NOVáK O, STRNAD M. Rapid analysis of phenolic acids in beverages by UPLC-MS/MS[J]. Food Chemistry, 2008, 111(3): 789-794. DOI:10.1016/j.foodchem.2008.05.014.

[19] 陳欣欣, 謝婭黎, 肖漢, 等. 超高效液相色譜快速檢測葡萄酒中5 種合成著色劑[J]. 現代食品科技, 2009, 25(9): 1098-1100. DOI:10.3969/j.issn.1673-9078.2009.09.030.

[20] 趙珊, 張晶, 楊奕, 等. 超高效液相色譜-電噴霧串聯四極桿質譜法檢測果汁和葡萄酒中的27 種工業染料[J]. 色譜, 2010, 28(4): 356-362. DOI:10.3724/SP.J.1123.2010.00356.

[21] 王麗娟, 柯潤輝, 王冰, 等. 超高效液相色譜-電噴霧串聯質譜法直接測定黃酒和葡萄酒中氨基甲酸乙酯[J]. 色譜, 2012, 30(9): 903-907. DOI:10.3724/SP.J.1123.2012.05007.

[22] 成宇峰, 張振文, 岳泰新. HPLC測定葡萄酒中單體酚樣品預處理方法的優化[J]. 釀酒科技, 2008(2): 116-118.

[23] 張予林, 王威, 郭安鵲. HPLC同時測定葡萄酒中18 種單體酚方法的研究[C]//第八屆國際葡萄與葡萄酒學術研討會論文集. 西安: 陜西人民出版社, 2013: 251-258.

[24] DIAS D A, SMITH T A, GHIGGINO K P, et al. The role of light, temperature and wine bottle colour on pigment enhancement in white wine[J]. Food Chemistry, 2012, 135(4): 2934-2941. DOI:10.1016/ j.foodchem.2012.07.068.

[25] 張昂, 房玉林, 王華, 等.高效液相色譜切換波長法同時測定葡萄組織中單體酚[J]. 分析化學, 2007, 35(11): 1614-1618. DOI:10.3321/ j.issn:0253-3820.2007.11.014.

[26] TANG K, MA L, HAN Y H, et al. Comparison and chemometric analysis of the phenolic compounds and organic acids composition of Chinese wines[J]. Journal of Food Science, 2015, 80(1): C20-C28. DOI:10.1111/1750-3841.12691.

[27] FANG F, LI J M, ZHANG P, et al. Effects of grape variety, harvest date, fermentation vessel and wine ageing on fl avonoid concentration in red wines[J]. Food Research International, 2008, 41(1): 53-60. DOI:10.1016/j.foodres.2007.09.004.

Fast Determination of Phenolics and Polyphenolics in Wine by Ultra Performance Liquid Chromatography

ZHANG Xingxing1, GUO Anque1,2, HAN Fuliang1,2, ZHANG Yulin1,2,*
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, China)

The aim of study was to develop a novel method using ultra-performance liquid chromatography (UPLC) to rapidly determine monophenols in wine. The UPLC system equipped with C18BEH analytical column (2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm) was kept at 30 ℃ by column oven, utilizing A 1% acetic acid and B acetonitrile mobile phase in the gradient elution mode within 15 min. The fl ow rate was 0.2 mL/min. A diode array detector (DAD) was used to monitor signals at 210□400 nm. The method precision (n = 6) for 17 compounds expressed as RSD was 0.25%□0.66% and average recovery rates of spiked wine samples were 85.10%□102.33%. The new method was simple, time-saving, accurate, reliable and prefect reproducible. Therefore, it is a promising method for the identifi cation and quantitation of phenolic compounds in wine.

ultra performance liquid chromatography (UPLC); wine; monophenols; assay

10.7506/spkx1002-6630-201610022

O657.7

A

1002-6630（2016）10-0128-06

張星星, 郭安鵲, 韓富亮, 等. UPLC快速測定葡萄酒中酚類物質的方法[J]. 食品科學, 2016, 37(10): 128-133. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610022. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Xingxing, GUO Anque, HAN Fuliang, et al. Fast determination of phenolics and polyphenolics in wine by ultra performance liquid chromatography[J]. Food Science, 2016, 37(10): 128-133. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610022. http://www.spkx.net.cn

2015-09-27

國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-30-zp-9）；中央高校基本科研業務費專項（QN2011098）

張星星（1992—），女，碩士研究生，研究方向為發酵工程專業。E-mail：18740351864@163.com

*通信作者：張予林（1975—），男，講師，碩士，研究方向為葡萄酒分析與檢驗。E-mail：zhangyl@nwsuaf.edu.cn