加速溶劑萃取-高效液相色譜法測定方便面中梔子黃色素

陳建中，葛水蓮，楊明建，張 元

（1.邯鄲學院生命科學與工程學院，河北 邯鄲 056005；2.冀南太行山區野生資源植物研發中心，河北 邯鄲 056005；3.中國醫科大學藥學院，遼寧 沈陽 110013）

加速溶劑萃取-高效液相色譜法測定方便面中梔子黃色素

陳建中1,2，葛水蓮1，楊明建1，張 元3

（1.邯鄲學院生命科學與工程學院，河北 邯鄲 056005；2.冀南太行山區野生資源植物研發中心，河北 邯鄲 056005；3.中國醫科大學藥學院，遼寧 沈陽 110013）

建立一種檢測方便面中梔子黃色素的加速溶劑萃取-高效液相色譜方法。采用加速溶劑萃取法萃取方便面，以甲醇為萃取劑，在1 500 psi和50 ℃靜態循環提取2 次，用乙腈飽和的正己烷溶液除脂。采用XBridgeTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相，藏花素和藏花酸在二極管陣列檢測器中的檢測波長為441 nm和427 nm進行分離分析。結果表明，藏花素和藏花酸在1.0～20 μg/mL范圍內具有良好的線性關系（r＞0.999 6）；平均回收率（n=6）在83.64%～94.82%之間；相對標準偏差為0.92%～2.13%，方法的定量限和檢出限分別為0.5～1.0 μg/g和0.05～0.20 μg/g，本方法快速簡便、自動化程度高、準確可靠，是一種適合測定方便面中梔子黃色素的方法。

高效液相色譜；加速溶劑萃取；梔子黃；方便面

梔子黃色素是梔子果實或藏紅花的提取物，是一種橙紅色液體和黃色粉末的水溶性類胡蘿卜天然色素[1-2]，主要成分是藏花素和藏花酸[3-4]。該色素具有降血脂、抑制腫瘤、抗氧化、天然無毒害，營養保健等功效[5-6]。我國在1989年起就將梔子黃色素列入許可使用的食品添加劑中，廣泛應用于飲料、糕點或方便面等各類食品中[7-10]。但為避免食品中過量使用該食品著色劑而造成食品安全問題，GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》中規定了各類食品中梔子黃的最大使用量[11]，且在19 98年發布了GB/T 17335—1998《食品中梔子黃的測定》以控制其含量[12]。

梔子黃色素的檢測方法主要有薄層色譜法[13]、紫外-可見分光光度法[14]、高效液相色譜法[15]等，在提取純化方面檢測梔子黃色色素用得較廣泛的是紫外-可見分光光度法[16-20]，但高效液相色譜法測定梔子黃色素準確高效，在檢測定量方面越來越受到親睞[21-23]。各類檢測方法的重點和難點在于優化前處理方法，盡可能的提取梔子黃色素，并減少雜質對檢測結果的干擾，提高檢出限和方法的靈敏度，縮短檢出時間。目前只有糕點、飲料、酒等簡單基質有國標方法[12]與少量文獻報道應用高效液相色譜法測定[24-25]，且多以梔子苷為對照品[13,24]。而在GB 7912—2010《食品添加劑：梔子黃》中規定藏花素與藏花酸是梔子黃色素的測定成分，且其分析方法為薄層色譜法。因此以梔子苷為對照品比較不合理。目前，尚沒有專門針對面條制品中梔子黃色素以藏花素和藏花酸為對照品的高效液相色譜測定方法。而目前大多采用水浴加熱回流提取和柱層析法前處理，操作繁雜費時[21-22]，而加速溶劑萃取法具有快速簡便，使用溶劑少等優點，因此本實驗采用加速溶劑萃取法能夠快速簡便的提取面條制品中梔子黃色素，再液液萃取除去脂肪，采用高效液相色譜法測定面條制 品中梔子黃色素的含量，并以藏花素和藏花酸為對照品，以期找到適合面條制品中梔子黃色素的測定方法，為食品中梔子黃色素的測定進一步提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桶裝方便面（ 含梔子黃） 市購。藏花素和藏花酸（純度＞98%） 美國Chroma DEX公司；乙腈、甲醇、正己烷（均為色譜純） 美國Fisher Scientific公司；乙酸（純度＞99.8%，色譜純） 西隴化工有限公司；尼龍濾膜（0.22 μm） 津隆有限公司；超純水（電導率≤0.10 mS/m，25 ℃）。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀 美國Waters公司；ASE350加速溶劑萃取儀 美國Dionex公司；AB204-S電子天平瑞士Mettler Toledo公司；Milli-Q超純水處理系統 美國Millipore公司；KQ-500DE型超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司；高速臺式冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；FW-100高速萬能粉碎機 北京中興偉業儀器有限公司；渦旋混勻儀 美國OSTC公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的制備

分別準確稱取藏花素和藏花酸10.0 mg到10 mL容量瓶中，甲醇溶解后定容，分別制成質量濃度為1.0 mg/mL的儲備液，于-18 ℃冰箱中保存待用。分別準確移取1 mL藏花素和藏花酸儲備液到同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容制成100 μg/mL的混合標準溶液，分別移取100、200、500、1 000、2 000 μL混合標準溶液分別到10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，配成1、2、5、10、20 μg/mL藏花素和藏花酸混合標準曲線工作液。

1.3.2 樣品前處理

取適量的方便面經磨粉機處理后待用，準確稱取方便面粉末2.000 g，放到不銹鋼萃取池中10 mL，甲醇為萃取劑，萃取劑體積為10 mL，在50 ℃溫度和1500 psi條件下進行加熱和靜態循環萃取2次，氮氣吹掃50 s，加速溶劑萃取完成后，用乙腈飽和的正己烷除脂，用氮吹濃縮儀將提取液濃縮10 mL以下，并用甲醇定容至10 mL，然后經0.22 μm微孔濾膜過濾，供高效液相色譜儀測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：XBridgeTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0 min時，V（乙腈）∶V（0.1%甲酸溶液）=85∶15；梯度變化后5 min，V（乙腈）∶V（0.1%甲酸溶液）=30∶70；梯度變化后8 min，V（乙腈）∶V（0.1%甲酸溶液）=5∶95；梯度變化后9 min，V（乙腈）∶V（0.1%甲酸溶液）=85∶15；等度變化后12 min，V（乙腈）∶V（0.1%甲酸溶液）=85∶15；流速：1.2 mL/min；柱溫：常溫；二極管陣列（photodiode array，PDA）檢測器；檢測波長：441 nm（藏花素），427 nm（藏花酸）；進樣量：10 μL。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜分析條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇

以5 μg/mL的藏花素和藏花酸混合標準溶液進樣，以PDA為檢測器，所得光譜圖如圖1所示，藏花素在441 nm波長處有最大吸收；藏花酸在427 nm波長處有最大吸收，因此選擇441 nm作為藏花素的檢測波長；選擇427 nm作為藏花酸的檢測波長。

圖1 藏花素（A）和藏花酸（B）的PDA光譜圖Fig. 1 Adsorption spectra of crocin (A) and crocetion (B)

2.1.2 流動相的選擇

本實驗分別考察乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-乙酸銨溶液等作為流動相時，藏花素和藏花酸的出峰情況。結果表明，50%等度洗脫時在V（乙腈）-V（0.1%甲酸溶液）峰形較好，乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-乙酸銨溶液作為流動相時，存在峰形矮胖或拖尾嚴重或無法看到峰形等現象，這可能是因為被測組分與色譜柱上的硅醇基團相互作用，引起次級保留效應，造成樣品組分峰拖尾現象。通過在流動相中加入酸性改良劑（如甲酸），有效緩解酸性組分的次級保留效應，使藏花酸的峰形得到明顯改善。但在各種流動相的等度洗脫下，待測成分與雜質不能得到良好分離。因此通過調節流動相梯度和流速，使藏花素和藏花酸控制在12 min內出峰，且使樣品與雜質分開，分離度良好。因此實驗最終選擇的高效液相色譜條件為0 min時，V（乙腈）∶V（0.1%甲酸溶液）= 85∶15；梯度變化后5 min，V（乙腈）∶V（0.1%甲酸溶液）=30∶70；梯度變化后8 min，V（乙腈）∶V（0.1%甲酸溶液）=5∶95；梯度變化后9 min，V（乙腈）∶V（0.1%甲酸溶液）=85∶15；等度變化后12 min，V（乙腈）∶V（0.1%甲酸溶液）=85∶15；流速為1.2 mL/min；柱溫為常溫。在12 min內實現藏花素和藏花酸的分離，如圖2和圖3所示。圖4為方便 面樣品圖中藏花素的光譜圖，以驗證樣品中的色譜峰是藏花素。

圖2 梔子黃色素標準品色譜分離圖Fig. 2 Chromatograpm of gardenia yellow standard

圖3 方便面樣品色譜圖Fig. 3 Chromatogram of gardenia yellow in instant noodle

圖4 樣品中藏花素的光譜圖Fig. 4 Absorption spectrum of crocin in sample

2.2 樣品前處理條件優化

2.2.1 萃取劑的選擇

圖5 5 種溶劑的回收率Fig. 5 Recoveries of gardenia yellow extracted with fi ve solvents

表1 萃取劑的提取效率（n==66）Table 1 Extraction effi ciency of different extraction solvents (n == 66))

梔子黃色素是一種溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑，不溶于苯、正己烷等非極性溶劑的混合物。實驗選擇水、堿性溶液、甲醇、乙腈、乙酸乙酯的溶劑進行預實驗，對比了5 種提取溶劑的萃取率，如圖5所示，結果顯示甲醇和溶液的提取率相對理想，因此實驗選擇考察甲醇溶液提取梔子黃色素。在固定溫度為50 ℃，靜態時

間為10 min，循環2 次；氮氣吹掃50 s。分別考察甲醇、90%甲醇溶液、50%甲醇溶液、10%甲醇溶液、水對樣品中梔子黃色素的萃取率，結果如表1所示，甲醇萃取效率整體效果最好；甲醇溶液次之；水對藏花酸的萃取率偏低，對藏花素萃取率較高，總體不理想；因此選擇甲醇作為萃取劑。

2.2.2 加速溶劑萃取方法的優化選擇

加速溶劑萃取過程中萃取劑的用量較少，且萃取劑的體積有一定的限制，故不考慮萃取體積的影響。實驗考察了萃取溫度、萃取時間，結果如圖6所示，萃取溫度50 ℃的萃取效率比40 ℃的高，60～120 ℃萃取率隨溫度升高有所提高，但重復性和穩定性逐漸變差，說明提高溫度可能減弱梔子黃色素與面條制品的吸附力，加快梔子黃色素進入溶劑中，同時溫度過高影響梔子黃色素的穩定性，溫度盡量控制在60 ℃以下，因此選擇50 ℃作為萃取溫度。靜態萃取時間在10 min后變化不大，為縮短前處理時間，靜態萃取時間選擇10 min。與傳統的水浴加熱回流法相比較[21]，萃取時間明顯縮短，萃取溶劑體積明顯減少。

圖6 萃取溫度（A）和萃取時間（B）對梔子黃色素萃取率的影響Fig. 6 Infl uence of extraction temperature and time on the recovery of gardenia yellow

2.3 方法評價

2.3.1 方法的分離效果和線性關系

從圖2可知，藏花素和藏花酸在1.3.3節色譜條件下，梔子黃色素混合標準溶液的分離效果良好。以峰面積（Y）對質量濃度（X）繪制標準曲線，得到的藏花素和藏花酸的標準曲線方程、線性范圍和相關系數，將標準溶液稀釋至響應值是噪音的3 倍（即信噪比RSN=3）為檢出限，加標樣品稀釋至響應值是噪音的10 倍（即信噪比RSN=10）為定量限，結果見表2。結果表明，藏花素和藏花酸的標準曲線線性關系良好。方法的定量限和檢出限分別為0.5～1.0 μg/g和0.05～0.20 μg/g。

表2 梔子黃色素的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限和定量限Table 2 Standard curve equations with correlation coeffi cients and limits of detection for gardenia yellow

2.3.2 加標回收率和精密度實驗結果

準確稱取樣品2.00 g，加入混合標準品，加標量分別為2、5、10 μg/mL的混合標準溶液1 mL，按照1.3.2節處理樣品，平行處理6 份。結果表明，藏花素和藏花酸的平均回收率（n=6）為83.64%～94.82%；相對標準偏差為0.92%～2.13%，結果如表3所示。

表3 梔子黃色素加標回收率和精密度（n==66）Table 3 Recoveries and precision (relative standard deviation) of gardenia yellow in spiked samples (n == 66))

2.3.3 方法重復性和穩定性

準確稱取樣品2.000 g，加入1 mL 5 μg/mL混合標準溶液，按照1.3.2節方法處理樣品，平行處理6份，相對標準偏差在0.72%～1.82%之間，可見該方法重復性較好。將其中一個樣品分別放置0、2、4、8、12 h后，測定藏花素和藏花酸的峰面積的相對標準偏差分別為1.89%和1.73%，可見梔子黃色素在12 h內穩定性良好。

2.4 實際樣品的測定結果

表4 6 個批次方便面樣品的測定（n==66）Table 4 Results of determination of gardenia yellow in 6 batches of instant noodles (n == 66))

應用本方法對6 個批次的桶裝方便面進行了測定，結果見表4。GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》中規定了面條制品中梔子黃的最大使用量不能超過1.5 g/kg，樣品中多含藏花素，不含藏花酸，藏花素的含量不超過國標中對梔子黃含量的規定。

3 結 論

本實驗采用加速溶劑萃取法，在一定溫度和壓力條件下減少梔子黃色素對面條制品的吸附，提高梔子黃色素的萃取率，結果表明，在50 ℃溫度和1500 psi條件下進行以甲醇溶液為萃取劑，萃取劑體積為10 mL，加熱和靜態循環萃取2 次，用乙腈飽和的正己烷除脂，藏花素和藏花酸的回收率可達83.64%～94.82%間，且無雜質干擾，為方便面中梔子黃色素的檢測方法的建立提供依據。

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Determination of Gardenia Yellow in Instant Noodle by Accelerated Solvent Extraction and High Performance Liquid Chromatography

CHEN Jianzhong1,2, GE Shuilian1, YANG Mingjian1, ZHANG Yuan3
(1. College of Life Science and Engineering, Handan College, Handan 056005, China; 2. Wild Resources Plant Research Center of South Hebei Mt. Taihang, Handan 056005, China; 3. School of Pharmacy of China Medical University, Shenyang 110013, China)

A method was developed for the determination of gardenia yellow in instant noodle by accelerated solvent extraction (ASE) and high performance liquid chromatography (HPLC). The crushed samples were extracted twice using ASE with methanol at 50 ℃ and 1 500 psi, followed by defatting using n-hexane saturated with acetonitrile. Then the gardenia yellow were eluted on XBridgeTMC18with a mobile phase composed of acetonitrile and 0.1% formic acid solution, and detected by photo-diode array (PDA) detector at 441 nm for crocin and 427 nm for crocetion. The developed method had a linear range of 1.0□20 μg/mL for the two analytes with good correlation coeffi cients (r ＞ 0.999 6). The mean re coveries were 83.64%□94.82%, with relative standard deviation (RSD) of 0.92%□2.13% (n = 6). The limit of quantitation (LOQ) and the limit of detection (LOD) of this method for gardenia yellow were 0.5□1.0 μg/g and 0.05□0.2 μg/g, respectively. The method proved to be quick, simple, automated, reliable, accurate, and suitable to detect gardenia yellow in instant noodle.

high performance liquid chromatography (HPLC); accelerated solvent extraction (ASE); gardenia yellow; instant noodle

10.7506/spkx1002-6630-201610036

TS202.3

A

1002-6630（2016）10-0208-05

陳建中, 葛水蓮, 楊明建, 等. 加速溶劑萃取-高效液相色譜法測定方便面中梔子黃色素[J]. 食品科學, 2016, 37(10): 208-212. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610036. http://www.spkx.net.cn

CHEN Jianzhong, GE Shuilian, YANG Mingjian, et al. Determination of gardenia yellow in instant noodle by accelerated solvent extraction and high performance liquid chromatography[J]. Food Science, 2016, 37(10): 208-212. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610036. http://www.spkx.net.cn

2015-08-05

河北省科技計劃項目（13222907；12272502）；邯鄲市科學技術研究與發展計劃項目（1422104057-2；1323108093-9）；邯鄲學院校級項目（15202）

陳建中（1978—），男，副教授，碩士，研究方向為天然食藥植物活性物質研發。E-mail：cjzhong@126.com