頂空固相微萃取聯合氣相色譜-質譜檢測葡萄酒中2,4,6-三氯苯甲醚

趙英蓮，牟德華，李 艷

（河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018）

頂空固相微萃取聯合氣相色譜-質譜檢測葡萄酒中2,4,6-三氯苯甲醚

趙英蓮，牟德華，李 艷*

（河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018）

利用響應面法優化采用頂空固相微萃取聯合氣相色譜-質譜技術檢測葡萄酒中2,4,6-三氯苯甲醚（2,4,6-trichloroanisole，TCA）。對萃取頭進行了選擇，并優化固相微萃取參數：樣品體積、萃取溫度、平衡時間和萃取時間等對TCA萃取效果的影響。結果表明，用聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（65 μm）萃取頭進行TCA萃取的最佳條件：樣品9.8 mL、2 g NaCl、33 ℃平衡10 min、萃取90 min進行氣相色譜-質譜分析，以TCA-d5為內標物進行定量。該方法的相關系數R2為0.999 9，重復性的相對標準偏差為1.03%，加標回收率范圍在95.7%～106.1%之間，檢出限和定量限分別為0.3 ng/L和1 ng/L。檢測7 種市售葡萄酒產品的TCA含量在0～7.6 ng/L之間，干白葡萄酒中TCA含量低于干紅葡萄酒。該方法操作簡單、可靠，適用于葡萄酒中TCA的測定。

響應面法；頂空固相微萃取；氣相色譜-質譜；2,4,6-三氯苯甲醚；葡萄酒

2,4,6-三氯苯甲醚（2,4,6-trichloroanisole，TCA）是“軟木塞污染”的主要肇事者[1]。它能使葡萄酒產生霉味或者是令人不愉快的味道，降低葡萄酒的品質。據報道，每年因TCA給葡萄酒行業造成的損失達到100億 美金[2]。Prescott等[3]研究了消費者對葡萄酒中TCA的排斥閾和刺激值，結果表明，排斥閾和刺激值分別為3.1×10-12g/L和2.1×10-12g/L。在如此低質量濃度的情況下，消費者便難以接受。此外，加州大學戴維斯分校的釀酒專家Christian Butzke稱，一湯匙量的TCA就可以敗壞美國全年的葡萄酒，可見其危害之大[4]。

針對于TCA的檢測采用是氣相色譜-質譜（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）聯用法[5-8]、氣相色譜電子捕獲技術聯用法[9-11]、氣相色譜原子發射光譜聯用技術[12]、生物傳感器[13]、氣相色譜離子遷移譜[14]以及電子鼻等。但是GC-MS是首選，主要是因為它靈敏性高、定性能力強、定量分析簡單等特點。GC-MS結合頂空固相微萃取（headspace solid-phase micro-extraction，HS-SPME）方法是目前最常用的檢測葡萄酒及軟木塞中TCA含量的方法。此外還有其他的前處理方法如液液萃取[15-16]、固相萃取[17-19]、攪拌棒吸附萃取[20-21]、吹掃補集技術以及滲透汽化膜技術[22]等。由于HS-SPME無需使用有機溶劑、樣品用量少、快速靈敏、選擇性高、檢出限低、重復性好和準確度高，成為TCA萃取中最常用的方法。目前，國內雖然有關于TCA的報道，但是沒有關于以響應面優化葡萄酒中TCA的檢測方法的報道。

本實驗采用HS-SPME-GC-MS通過對萃取溫度、萃取時間和樣品體積進行響應面優化設計，建立了可靠的葡萄酒中TCA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

酒樣 石家莊市北國超市。TCA（純度99%）、內標物[2H5]TCA（TCA-d5，純度為98%） 美國Sigma公司；乙醇（色譜純，純度99.9%） 韓國德山藥業工廠；NaCl（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；酒石酸、正丙醇、異丁醇、異戊醇、乳酸乙酯（均為分析純） 天津永大化學試劑有限公司；實驗用純凈水杭州哇哈哈集團有限公司。

7890A氣相色譜-5975質譜儀、HP-5色譜柱（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市英峪予華儀器廠；20 mL頂空瓶 石家莊大晉科技有限公司；手動固相微萃取手柄、磁子及聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS，100 μm）、PDMS/二乙烯基苯（divinylbenzene，DVB，65 μm）、聚丙烯酸酯（polyacylate，PA，85 μm）涂層的萃取頭 美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

合成酒的配制：用1 mol/L氫氧化鈉溶液將含有3.5×103mg/L的酒石酸體積分數12%乙醇溶液，調pH值為3.5；復雜合成酒的配制：用1 mol/L氫氧化鈉溶液將含有3×103mg/L的糖、3.5×103mg/L的酒石酸和一些揮發性物質（丙醇18.5 mg/L+異丁醇11.73 mg/L+異戊醇29.8 mg/L+乳酸乙酯99.32 mg/L）體積分數為12%乙醇溶液，調pH值為3.5；標準溶液的配制：稱取0.05g的TCA溶于50mL的乙醇容溶液，配制成質量濃度為1 g/L的儲備液，再用12%乙醇溶液將其配制成2×10-4、4×10-4、8×10-4、15×10-4、50×10-4mg/L的工作液，4 ℃冰箱存放；內標物溶液的配制：稱取0.01 g的TCA-d5溶于25 mL的乙醇溶液，配制質量濃度為4×10-1g/L的儲備液，再用12%乙醇溶液將其稀釋成2×10-3mg/L，4 ℃冰箱存放。

1.2.2 儀器條件

色譜條件：50 ℃保持2 min，10 ℃/min升至90 ℃保持25 min，再以25 ℃/min升至260 ℃保持3 min。傳輸線溫度280 ℃；載氣：高純氦氣；流速1 mL/min；進樣量1 μL。

質譜條件：電子電離源；電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；溶劑延遲時間20 min；采用選擇離子監測模式條件下對樣品進行分析，根據定性離子和保留時間對物質進行定性，內標法定量。TCA和TCA-d5的特征離子見表1。

表1 TCA和TCAA--dd5的特征離子和定量離子Table 1 Characteristic ions and quantitative ions for TCA and TCA-d5

1.2.3 樣品處理

稱取2 g NaCl置于頂空進樣瓶，加入9.8 mL酒樣和100 μL 2×10-3mg/L的內標物TCA-d5，用含有硅膠密封墊的鋁蓋密封，將萃取頭插入萃取瓶，置于恒溫加熱磁力攪拌器中，33 ℃平衡10 min，萃取90 min，260 ℃解吸3 min。

2 結果與分析

2.1 模擬酒樣的選擇

為了得到更精確的方法，更好地模擬葡萄酒，共選擇了3 種不同合成酒與真實的干白酒、干紅酒和桃紅酒進行比較。其中3 款模擬酒為：1）12%乙醇溶液；

2）3.5×103mg/L酒石酸+12%乙醇溶液，pH 3.5；3）3×103mg/L 糖+3.53.5×103mg/L酒石酸+12%乙醇+揮發性物質（丙醇18.5 mg/L+異丁醇11.73 mg/L+異戊醇29.8 mg/L+乳酸乙酯99.32 mg/L）pH 3.5[23]。由圖1可以看出，復雜模擬酒樣、干白、干紅和桃紅的線性方程幾乎重合，因此選擇復雜模擬酒樣作為空白基質進行下一步的實驗研究。

圖1 合成酒與真實酒樣的線性比較Fig. 1 Linear comparison between synthetic liquor and real wine sample

2.2 萃取頭的選擇

TCA是屬于小分子質量的極性物質，所以主要考察了PDMS、PDMS/DVB、PA這3 種萃取頭的萃取效果。方法為35 ℃平衡15 min，萃取25 min[11]。結果見圖2，由此可見PDMS/DVB，65 μm這種萃取頭的萃取效果最好。

圖2 不同萃取頭對TCA萃取效果的影響Fig. 2 Effect of fi ber types on the extraction effi ciency of TCA

2.3 方法的優化

2.3.1 NaCl加入量

圖3 NaCl加入量對TCA萃取效果的影響Fig. 3 Effect of sodium chloride addition to the extraction solvent on the extraction effi ciency of TCA

適當增加溶液中的離子濃度可以減少被分析物在溶液中的可溶性，能使更多的揮發性物質揮發至溶液的頂空，吸附到纖維頭上，從而提高方法的靈敏性。離子強度的影響通過加入NaCl的量進行研究。本實驗以PDMS/ DVB，65 μm為萃取頭，35 ℃平衡15 min，萃取25 min，分別研究了0、2、3、4 g NaCl對萃取效果的影響。從圖3可以看出，NaCl加入量為2 g時，萃取效果最好，所以NaCl的加入量為2 g。

2.3.2 攪拌對萃取的影響

攪拌也是影響萃取的一個因素，主要是因為它能加速待測物從基質中分離到頂部，吸附到萃取頭中。在PDMS/DVB，65 μm為萃取頭，35 ℃平衡15 min，萃取25 min，2 g NaCl的前提下，考察了攪拌速率對其影響。結果發現，隨著攪拌速率加大，萃取峰面積越大。所以在以后的實驗中，攪拌速率均調至最大。

2.3.3 萃取溫度的考察

溫度是影響萃取的重要因素，它能促進待測物從液體基質中分離，增強頂部空間的壓力，進而加速待測物擴散至萃取涂層。由圖4可見，隨著溫度的升高，TCA的響應值先增加后降低，溫度為30 ℃時，峰面積最大。溫度越高，峰面積降低，可能是由于TCA屬于低沸點、弱極性物質，吸附在PDMS/DVB極性萃取頭的TCA隨著溫度的升高，又發生了解吸現象，因此峰面積降低。

圖4 萃取溫度對TCA萃取效果的影響Fig. 4 Infl uence of extraction temperature on the extraction effi ciency of TCA

2.3.4 平衡時間的影響

圖5 平衡時間對TCA萃取效果的影響Fig. 5 Infl uence of equilibration time on the extraction effi ciency of TCA

頂空萃取模式主要包括2 個步驟：第一待測物從液相中擴散到氣相中，即平衡過程；第二待測物從氣相吸附到萃取的固定相中，即吸附過程。本實驗以PDMS/ DVB，65 μm為萃取頭，2 g NaCl，30 ℃萃取25 min，

分別研究了平衡時間為5、10、15、20 min對萃取效果的影響。從圖5可以看出，平衡時間為10 min時，TCA的響應值最大。平衡時間的延長，TCA的響應值先增加后降低，可能是由于一開始隨著時間的延長，TCA從基質中擴散到氣相中，使氣相中TCA的質量濃度增加，但是當氣相中TCA的質量濃度大于基質中的，造成TCA重新擴散到液相基質中，從而造成TCA的響應值降低。

2.3.5 萃取時間的影響

萃取時間是判定待測物在基質和固定相之間達到平衡的重要的因素。因此，本研究以PDMS/DVB，65 μm為萃取頭，2 g NaCl，30 ℃平衡10 min，考察了萃取時間為30、40、50、60、70、80、90、100、120 min，對萃取效果的影響。由圖6可看出，隨著萃取時間的延長，TCA的響應值不斷增加。由于，當萃取條件保持不變，在非平衡狀態下對SPME的定量是不會造成影響的[24]。此外，60 min后，TCA響應值仍然增加，但是趨于平緩。

圖6 萃取時間對TCA萃取效果的影響Fig. 6 Infl uence of extraction time on the extraction effi ciency of TCA

2.3.6 樣品體積對萃取的影響

圖7 樣品體積對TCA萃取效果的影響Fig. 7 Infl uence of sample volume on the extraction effi ciency of TCA

對于HS-SPME方法來說，樣品體積也是影響待測物萃取的一個直接因素。因為降低樣品體積，可以增大頂空體積，使TCA在兩相間的分配平衡偏向頂空氣相，更多TCA揮發至頂空。以PDMS/DVB，65 μm為萃取頭，35 ℃平衡15 min，萃取25 min，2 g NaCl為條件，對樣品體積進行考察，以求找到最適樣品體積。由圖7可以看出，隨著樣品體積的增加，TCA的峰面積先增加后降低。這主要是因為樣品體積過低，頂空體積過大，會造成TCA質量濃度的稀釋，使TCA的峰面積下降。本實驗取8 mL為取樣量。

2.3.7 響應面的優化試驗

為了得到更加精確的方法，在單因素試驗的基礎上，以樣品體積、萃取溫度和萃取時間為影響因素，TCA峰面積為響應值，運用Box-Behnken試驗設計原理進行響應面分析。確定HS-SPME法萃取葡萄酒中的TCA的最佳萃取條件。其中萃取溫度（20～40 ℃）、萃取時間（30～90 min）和樣品體積（6～10 mL）為自變量，分別由A、B、C表示。試驗設計及結果見表2。

表2 響應面分析試驗設計及結果Table 2 The experimental design and results for respond surface analysis

通過利用Design Expert 7.0軟件對表2中實驗數據進行回歸分析，得到二次多元回歸模型為R1=-337 649+ 12 577A+1 905.91B+41 873.4C-22.2085AB+217.563AC+ 137.531BC-192.309A2-10.300 5B2-3 122.29C2。該模型的方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for response surface quadratic mooddeell

由表3可知，模型P值＜0.000 1，小于0.01，模型回歸極顯著；失擬項P值0.126 7，大于0.05，失擬項不顯著，因此模型選擇正確。A、B、C、A2、C2項P值均小于0.01，為極顯著；AB、BC和B2項P值均大于0.01而小于0.05，為顯著；AC項P值均大于0.05，為不顯著。這說明線性項、二次項都有顯著影響，各個試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，它們之間有交互作用。圖8表示AB、BC和AC交互作用的立體圖。從圖8也可以可直觀反映出3 個變量之間交互作用的顯著程度（圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩因素交互作用顯著）。

圖8 萃取時間和溫度（a）、萃取時間和樣品體積（b）、萃取溫度和樣品體積（c）的響應面Fig. 8 Response surface plots showing the effect of extraction time and extraction temperature (a), extraction time and sample volume (b), and extraction temperature and sample volume (c) on TCA extraction

因此，可以利用回歸模型來分析和預測HS-SPME萃取葡萄酒中TCA的最佳條件。其中該模型的復相關系數的平方R2=0.986 0，校正復相關系數為0.968 0，說明該模型可以解釋96.80%實驗所得色譜峰面積的變化，表明方程擬合較好。Y的變異系數（coefficient of variation，CV）表示實驗的精確度，CV值越低，實驗的可靠性越高，本實驗中CV=4.03%＜10%，說明實驗方法可靠。

運用Design Expert 7.0軟件對回歸模型進行分析，尋求最大出峰面積穩定點及對應的因素水平。當因素A、B、C取值分別為33.072 ℃、90 min、9.842 mL時，響應值Y達到最大值192 267，即TCA峰面積最大。考慮到實際應用過程中的可操作性，A、B、C的取值分別取整為：萃取溫度33 ℃、萃取時間90 min、樣品體積9.8 mL。經驗證實驗證實，實際出峰面積為192 962，是預測值的100.4%，說明該模型優化的結果能夠很好地反映出TCA的萃取面積。

2.4 方法的驗證

按照優化的結果再結合GC-MS對方法參數（如 相關系數、相對標準偏差、檢出限、定量限和回收率）進行考察，結果見表4。線性關系是以不含TCA污染的葡萄酒為空白基質，往其加入TCA-d5和TCA，最終TCA-d5的質量濃度為2×10-8g/L，TCA質量濃度分別為2×10-9、4×10-9、8×10-9、15×10-9g/L和50×10-9g/L。按照優化的結果進行萃取，結合GC-MS進行分析，以TCA的質量濃度為橫坐標，TCA和TCA-d5的峰面積之比為縱坐標進行相關性分析。準確度和精密度實驗通過加標回收率和相對標準偏差來評價。檢出限為信噪比3時，對應的TCA質量濃度，定量限為信噪比時，對應的TCA質量濃度。

表4 優化后方法的相關系數、重復性、檢出限、定量限和回收率Table 4 Correlation coeffi cient, reproducibility (RSD), detection limit, quantitation limit and recovery of the optimized method

由表4可以看出，該方法的相關系數為0.999 9，表明線性關系良好，能夠用于方法的定量。重復性的相對標準偏差為1.03%，回收率在95.7%～106.1%之間，說明該方法準確、可靠。檢出限為0.3 ng/L低于TCA在葡萄酒中的閾值。所以該方法能用于葡萄酒TCA的檢測。

2.5 樣品的檢測

采用優化后的檢測方法，對選購的7 種市售山東煙臺產區的干紅葡萄酒和干白葡萄酒進行了檢測，檢測結果見表5。其中不含TCA的貴人香干白葡萄酒和含TCA污染蛇龍珠干白的葡萄酒的色譜圖見圖9。

表5 不同類型葡萄酒酒精度和TCA含量Table 5 Alcohol content and TCA content of different types of wines

圖9 貴人香葡萄酒樣品（A）和蛇龍珠葡萄酒樣品（B）離子圖Fig. 9 Ion chromatograms of TCA in Italian Riesling wine (A) and Cabernet Gernischt wine (B)

由表5可見，干白葡萄酒中未檢出TCA，4 種干紅葡萄酒中均檢出了TCA，其含量在2.44～7.60 ng/L之間。而葡萄酒中的TCA來源可能有4 方面：第1，與葡萄原料有關。葡萄在篩選時，可能帶入一些腐爛葡萄；第2，釀造過程中。一些生產設備上清洗不徹底，滋生霉菌，與含氯的水或清洗劑接觸產生TCA，從而使酒含有TCA；第3，葡萄酒陳釀過程中，一些橡木桶發霉產生了TCA，導致葡萄酒含有TCA；第4，葡萄酒在封裝時，使用了TCA含量較高的軟木塞，使軟木塞中的TCA轉移到了葡萄酒中。

3 結 論

本實驗采用響應面優化設計結合HS-SPME-GC-MS建立了一種簡單和可靠的檢測葡萄酒中TCA的方法，且應用此方法檢測7 種不同類型的葡萄酒中TCA的檢測，其TCA含量在0～7.6 ng/L之間，其中干白葡萄酒中TCA含量低于干紅葡萄酒。該方法簡單、靈敏度高、準確性好以及線性關系良好，適用于葡萄酒中TCA的測定。

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Optimization of Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry for the Determination of 2,4,6-Trichloroanisole in Wine

ZHAO Yinglian, MOU Dehua, LI Yan*
(College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China)

The objective of this study was to develop an analytical method for the determination of 2,4,6-trichloroanisole (TCA) in wine by headspace solid-phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry (HSSPME-GC-MS). Important extraction parameters such as fi ber type, sample volume, extraction temperature, equilibration time and extraction time were optimize using response surface method with the software Design Expert 7.0. The results indicated that when polydimethylsiloxane/divinylbenzene (PDMS/DVB, 65 μm) was selected as the extraction fi ber, and optimised parameters for SPME were 9.8 mL of wine, 2 g of NaCl, temperature 33 ℃, equilibration time 10 min and extraction time 90 min, followed by analysis by GC-MS and quantifi cation using TCA-d5as internal standard. The presented method was shown to be adequate for the purpose, with a correlation coeffi cient R2of 0.999 9, RSD of 1.03%, and recovery rates between 95.7% and 106.1%. The limit of detection (LOD) and the limit of quantifi cation (LOQ) were 0.3 and 1 ng/L, respectively. This method was applied to analyze 7 commercial wine samples and the results revealed that the content of TCA varied between 0 and 7.6 ng/L, lower in dry white red than in dry red wine. This method is simple and reliable, a nd can be applied to the determination of TCA in wine.

response surface method; headspace solid-phase microextraction; GC-MS; 2,4,6-trichloroanisole; wine

10.7506/spkx1002-6630-201610038

TS262.6

A

1002-6630（2016）10-0219-07

趙英蓮, 牟德華, 李艷. 頂空固相微萃取聯合氣相色譜-質譜檢測葡萄酒中2,4,6-三氯苯甲醚[J]. 食品科學, 2016, 37(10): 219-225. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610038. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Yinglian, MOU Dehua, LI Yan. Optimization of headspace solid-phase microextraction coupled to gas chromatography-mass spectrometry for the determination of 2,4,6-trichloroanisole in wine[J]. Food Science, 2016, 37(10): 219-225. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610038. http://www.spkx.net.cn

2015-07-27

河北省科技支撐計劃課題（13397107D）；河北科技大學2015年研究生創新資助項目（2015-12）

趙英蓮（1989—），女，碩士研究生，主要從事食品成分分析檢測研究。E-mail：1363149012@qq.com

*通信作者：李艷（1958—），女，教授，學士，主要從事傳統發酵工程創新技術研究。E-mail：lymdh5885@163.com