玉米ZmREM基因的克隆與逆境脅迫后表達分析

甕巧云，趙彥敏，張 賀，宋晉輝，馬海蓮，袁進成，劉穎慧，*

(1.河北北方學院 農林科技學院，河北 張家口 075000； 2.張家口市廣播電視大學，河北 張家口 075000)

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玉米ZmREM基因的克隆與逆境脅迫后表達分析

甕巧云1，趙彥敏2，張 賀1，宋晉輝1，馬海蓮1，袁進成1，劉穎慧1，*

(1.河北北方學院 農林科技學院，河北 張家口 075000； 2.張家口市廣播電視大學，河北 張家口 075000)

B3超家族基因是植物中特有的一類轉錄因子，參與植物生長發育、形態建成及抗逆境脅迫等過程。從玉米黃早4中獲得一個含有2個B3-DNA結合域的基因，為B3超家族基因，命名為ZmREM。該基因全長1047bp，編碼含有349個氨基酸的蛋白。Blast比對結果表明，ZmREM和谷子含有B3結構域蛋白、高粱的假定蛋白相似性分別為81%和84%。ZmREM基因是組成型表達，在根中表達量最高。同時ZmREM基因的轉錄水平可以為干旱、鹽、冷和熱所誘導。因此，ZmREM可能參與玉米多種非生物脅迫應答途徑。

玉米；REM轉錄因子；基因克隆；非生物脅迫

B3超家族基因廣泛存在于擬南芥、水稻、番茄、玉米等多種植物，是植物中特有的一類轉錄因子[1-5]。該超家族基因根據蛋白結構域和功能的特征可分為5個家族，包括ABI3-VP1、ARF(生長素響應因子)、HSI (high-level expression of sugar-inducible)、RAV (related to ABI3-VP1)、REM (reproductive meristem)[6]。研究表明，B3超家族基因在植物生長發育和形態建成、逆境脅迫過程中發揮著重要的作用。如：擬南芥ARF家族基因，在鹽脅迫條件下大多數ARF基因表達量下調；ARF2參與乙烯信號傳導途徑；ARF5和ARF7調控細胞分化；ARF7和ARF9還參與生長的信號傳導途徑，影響著植物側根的形成；擬南芥過量表達ABI3基因增加了At2S3、AtCRC、AtEM1、AtSOM和AtEM6的表達量，35S∶ABI3轉基因種子對 ABA 更加敏感[6]；擬南芥abi3-5種子對脫落酸敏感，在種子萌發期表型顯著；辣椒中RAVI轉錄因子CARAV1受到病原菌、ABA等植物激素和非生物脅迫的誘導，表達量上調。過表達CARAV1后激活了轉基因擬南芥株系中PR相關基因的表達，并且提高了植株對病原菌的抗性及其對高鹽、滲透脅迫的抗性等[7-13]。

莫曉婷等[3]通過生物信息學方法已經明確了玉米中含有49個B3超家族基因。ZmRAV1是目前玉米中唯一一個明確功能的B3超家族基因，在干旱、鹽和脫落酸脅迫下，ZmRAV1基因表達量增加；同時，過量表達ZmRAV1的擬南芥經鹽和滲透脅迫后，在萌芽率、根長度、電解質透出率等方面與野生型有明顯的區別。鑒于植物B3超家族基因在逆境脅迫應答過程具有重要作用，本試驗以玉米為材料，以期克隆獲得玉米B3超家族基因。分析玉米不同組織中，各種非生物脅迫后B3超家族基因表達變化，明確其與玉米抗逆脅迫的關系，以期進一步了解玉米抗逆脅迫機制，并通過基因轉化技術獲得抗逆轉基因玉米新種質，為玉米抗逆分子育種服務。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

以玉米自交系黃早4為供試材料，種植于河北北方學院農場，采用正常田間管理模式。分別取3棵植株的根、莖、葉、花絲、籽粒，液氮速凍后于-80℃保存備用。

取三葉期的玉米植株用于非生物脅迫處理，在光照培養箱中培養，培養條件為25℃，14h光照/10h黑暗。非生物脅迫處理包括NaCl處理(濃度為250mmol·L-1)、干旱處理(20%聚乙二醇PEG溶液)、低溫(4℃)和高溫(42℃)處理。處理后分別于0、1、3、6、12和24h取樣，液氮速凍-80℃保存備用。以未處理玉米植株為對照，每個處理重復3次。

1.2 總RNA提取和反轉錄

按照植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)說明提取玉米植株總RNA。根據FastQuant RT Kit(With gDNase)說明反轉錄合成第一鏈cDNA(天根生化科技(北京)有限公司)。

1.3 基因的克隆

根據TAIR(TheArabidopsisInformation Resource)網站上提供的擬南芥AtREM基因(AT4G31610)，設計擴增ZmREM基因的引物。引物序列為F:5′-ATGGCTACGGTGTCCTC-3′，R:5′-CTAAAACTGCTCCCTGCGAA TG-3′ 。以合成的第一鏈 cDNA 為模板，利用 pfuTaqmix(天根生化科技(北京)有限公司)擴增目的基因。擴增體系包括 20μL pfuTaqmix，2μL cDNA，正向引物和反向引物各 1μL(10μmol·L-1)，補水至50μL。擴增條件為94℃，10min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，35個循環；72℃，10min；4℃保存。利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。將目的條帶進行回收，由華大基因進行測序。

1.4 生物信息學分析

利用NCBI網站的BLAST工具與GenBank已知物種基因進行比對分析；利用Conserved Domain Search Service(CD Search)軟件搜索基因的保守結構域；利用在線軟件Prot Scale (http://web.expasy.org/protscale)預測目的蛋白氨基酸序列的疏水性/親水性；利用SWISS-MODEL在線工具(http://swissmodel.expasy.org/interactive)進行三維結構預測，并利用可視化工具Swiss-PdbViewer進行查看。

1.5 ZmREM基因實時熒光定量PCR分析

利用實時熒光定量PCR技術，分析各種非生物脅迫后基因表達變化情況。設計引物為：正義：5′-TGTATCAATAATGCGGAGGG-3′和反義：5′-CAAAGTCTAACCACTCTCCC-3′。利用 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits及Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司)試劑于熒光定量 PCR儀(Agilent 3000P)上進行PCR擴增。20μL反應體系中包括 10μL 2×SYBR Green 1，1μL cDNA(稀釋后)，正向引物和反向引物各 0.5μL (10μmol·L-1)，8μL ddH2O。擴增程序為 95℃ 5min預變性，30個擴增循環(95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min)；72℃，10min，每個樣品設 3次重復。利用MxPro-Mx3000P軟件和Excel軟件分析、處理數據。

2 結果與分析

2.1 ZmREM基因的克隆和特性分析

本研究根據擬南芥AtREM基因(AT4G31610)設計引物，以玉米反轉錄合成第一鏈cDNA為模板，擴增獲得一條單一條帶。獲得的玉米cDNA序列經與Maize GDB數據庫比對，結果顯示該基因為一個新基因，目前還沒有研究報道。CD Search分析發現該序列含有2個B3-DNA結合域，屬于REM基因，故將該基因命名為ZmREM(圖1)。ZmREM基因全長 1047bp，編碼含有349個氨基酸的蛋白(圖2-A)。該蛋白富含甘氨酸、纈氨酸和精氨酸等，其分子量和等電點分別為 38.86ku和8.64。將ZmREM與GenBank中已知基因進行BLAST比對。結果表明，該基因與高粱假定蛋白同源性為84%；與谷子含有B3結構域蛋白同源性為81%。

Prot Scale預測ZmREM蛋白氨基酸序列的疏水性/親水性如圖2-C所示。根據氨基酸分值越低親水性越強，分值越高疏水性越強的規律，可以看出，多肽鏈第25位具有最高的分值2.111和最強的疏水性; 第99位具有最低的分值-2.567和最強的親水性。ZmREM大部分氨基酸具有疏水性，推測該蛋白屬于疏水性蛋白。利用SWISS-MODLE蛋白質數據庫對獲得的ZmREM蛋白進行保守位點和蛋白質結構預測。結果表明，該蛋白含有7個折疊和4個螺旋，其三維結構顯示ZmREM主要為螺旋—折疊—螺旋的結構(圖2-B)。

2.2 玉米不同組織中ZmREM基因表達分析

以孕穗期玉米植株的根、莖、葉、花絲、籽粒為材料，利用實時熒光定量PCR技術分析ZmREM基因在不同組織中的表達情況。結果表明，ZmREM基因是組成型表達，在各組織中均檢測到ZmREM基因的表達。其中根的表達量最高，其次依次是葉、籽粒、莖、花絲(圖3)。ZmREM在玉米不同組織中的差異表達，可能和其功能不同相關。

圖1 玉米ZmREM蛋白功能域預測Fig.1 Domains prediction of ZmREM protein

A, PCR擴增結果; B, 蛋白的三維結構圖;C, 蛋白疏水性/親水性預測A, PCR result; B, The three-dimensional structures of ZmREM; C, Predication of hydrophobicity/hydropholicity

圖3 玉米不同組織中ZmREM基因表達分析Fig.3 Expression analysis of ZmREM in different tissues of maize

2.3 非生物脅迫后ZmREM基因的表達分析

對三葉期玉米植株分別進行PEG、NaCl、4℃和42℃脅迫處理，利用實時熒光PCR技術分析了不同非生物脅迫后ZmREM基因的表達情況。結果表明，ZmREM基因的表達受PEG、NaCl、4℃和42℃脅迫后誘導上調表達，且不同處理后基因的表達變化趨勢不同(圖4)。PEG和42℃處理后ZmREM表達量變化均表現為隨著處理時間的延長表達量逐漸升高的趨勢，于24h時表達量最高。冷脅迫處理后ZmREM表達量變化表現為先升高后降低。處理后0～12h隨著處理時間的延長，ZmREM表達量持續上升并于12h達到最高值，12h后表達量開始下降。NaCl脅迫處理后，ZmREM表達量呈現下降的趨勢。由此可見，ZmREM基因受PEG、NaCl、4℃和42℃脅迫后誘導表達，在玉米應答脅迫反應中可能起重要作用。

A，PEG處理；B，42℃處理；C，4℃處理；D，NaCl處理A，PEG; B，42℃;C，4℃; D，NaCl

3 討論

REM家族基因是一類含有B3功能域轉錄因子，該家族不同成員之間含有 B3功能域的數量存在較大差異。花椰菜BoREM1是植物中最先分離獲得的REM基因，該基因在生殖分生組織表達[14]。AtREM1是BoREM1同源基因，含有3個B3功能域。AtREM1在擬南芥生殖分生組織中表達，參與花的發育過程[15-16]。擬南芥VRN1(Reduced Vernalization Response 1)，含有2個B3功能域。該基因在各個組織中大量表達，通過與DNA進行結合來維持植物的春化作用[17-19]。Matias-Hernandez等[20]明確了擬南芥VDD(Verdandi/REM20)基因影響種子發育過程中的胚囊分化；Otho等[21]發現REM22、REM23、REM24和REM25在擬南芥花發育各階段表達。目前，關于其他物種REM基因尤其是玉米REM基因還沒有進行深入研究，它們在植物逆境脅迫過程中的作用還有待研究。本研究從玉米中獲得了一個含有2個B3功能域，屬于REM家族基因。通過實時熒光定量PCR技術，明確了該基因為組成型表達。同時該基因的轉錄水平受到干旱、鹽、冷和熱脅迫等的誘導表達。因此，我們推測ZmREM可能參與玉米多種脅迫應答途徑。然而關于ZmREM基因功能以及對脅迫信號如何精確應答，還需要繼續深入研究。

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(責任編輯 張 韻)

國家重點研發計劃“長江中下游水稻化學肥料和農藥減施增效綜合技術集成研究與示范”項目正式立項

該項目由浙江省農科院牽頭，聯合中國水稻所、全國農技中心、長江中下游六省一市農科院、涉農高校、農技推廣部門以及有關企業等24家單位共同承擔。根據項目目標和區域內不同生態和種植制度特點下設9個課題。

項目主要通過水稻品種的篩選與合理布局、化肥減量減損增效和養分替代、病蟲害非化學防治、精準高效農藥使用、肥藥協同增效等技術的突破，結合現有成熟技術，集成創新不同種植制度下的綜合技術模式，并應用效果評價來調整和完善技術。通過管理機制創新，集成科研、推廣、農資生產經銷者、農業經營主體和政府多元協同的示范推廣體系,同時建設信息化平臺和扶持商業化專業服務組織，實現新技術的快速傳播與應用、提升技術推廣應用效果。與農業部已經設立的示范區緊密結合，建立核心示范區，開展更大范圍的技術示范和輻射帶動。

通過研究將形成適合長江中下游稻區不同生態區水稻化肥農藥減施增效技術模式，并建立相應技術規程。通過基地示范、新型經營主體和現代職業農民培訓，可減少化肥農藥不合理施用帶來的農產品質量安全和環境污染風險，為保障生態環境安全和農產品質量安全，推動“供給側”改革和農業發展“轉方式、調結構”，促進農業可持續發展提供強有力的科技支撐。

經過五年努力，在本稻區示范推廣1000萬畝，實現示范區內的肥料利用率提高8個百分點、化肥減量施用17%，化學農藥利用率提高11個百分點、農藥減量施用30%。

Cloning of ZmREM and its expression analysis in maize under stress

WENG Qiao-yun1，ZHAO Yan-min2，ZHANG He1，SONG Jin-hui1，MA Hai-lian1，YUAN Jin-cheng1，LIU Ying-hui1，*

(1.CollegeofAgricultureandForestry，HebeiNorthUniversity，Zhangjiakou075000，China; 2.ZhangjiakouRadio&TVUniversity，Zhangjiakou075000，China)

The plant-specific B3superfamily constituted a large transcription factor superfamily.They play central roles in plant development，morphogenesis and stress-resistance.Taking total RNA of maize as template，REM gene was cloned by use the method of reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).Length of 1047bp cDNA sequence that encoding 349amino acids was obtained.CD search result showed that it contained two B3-DNA domains and was named asZmREM.Blast result indicated thatZmREMhad 84% and 81% homology withSorghumbicolorhypothetical protein andSetariaitalicaB3domain-containing protein.In various tissues，gene expression in root was the highest.The expression ofZmREMin maize was induced by heat，high-salt，cold and PEG treatment.These results suggested thatZmREMmight be a stress related gene of maize.

maize (ZeamaysL.); REM transcription factor; gene cloning; abiotic stress

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.11.03

2016-03-31

國家自然科學基金(31101155)；河北北方學院重大項目(ZD201407，ZD201305)；河北省科技廳項目(13226326)

甕巧云(1979—)，女，河北定州人，博士，副教授，從事植物抗逆機制研究。E-mail: nkxwqy@163.com

*通信作者，劉穎慧，E-mail: leely519@126.com

S513

A

1004-1524(2016)11-1822-06

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis，2016，28(11): 1822-1827

http://www.zjnyxb.cn

甕巧云，趙彥敏，張賀，等.玉米ZmREM基因的克隆與逆境脅迫后表達分析[J].浙江農業學報，2016，28(11)： 1822-1827.