肝炎肝硬化血細胞減少與骨髓病態造血及脾功能相關性研究

陸光生　景 曄　徐和福　吳少華　宋麗萍

肝炎肝硬化血細胞減少與骨髓病態造血及脾功能相關性研究

陸光生①景 曄②*徐和福②吳少華②宋麗萍③

目的：探討肝炎肝硬化血細胞減少與骨髓病態造血及脾功能亢進的相關性，以及乳酸脫氫酶活性檢查對預后判斷的臨床意義。方法：選取320例代償期及失代償期肝炎肝硬化患者，根據脾臟腫大情況將其分為脾大組及無脾大組，每組160例；另選同期健康獻血者40名作為對照組，進行外周血及血清乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測。并隨機選取失代償期肝炎肝硬化脾大組及無脾大組各30例患者，進行骨髓祖細胞體外培養及骨髓血細胞形態學觀察，其結果進行統計學分析。結果：代償期肝硬化脾大組與無脾大組的血紅蛋白、中性粒細胞、血小板及LDH活性值相比，均無差異(t=0.017，t=0.019，t=0.015，t=0.014；P＞0.05)；失代償期肝硬化脾大組的血紅蛋白、中性粒細胞、血小板及LDH活性值降低明顯高于無脾大組，其差異顯著(t=8.364，t=2.442，t=3.542，t=4.542；P＜0.05)。失代償期肝硬化脾大組與無脾大組骨髓祖細胞不良生長率及骨髓血細胞病態造血率相比均無差異(t=0.798，t=1.754，t=0.618，t=1.575，t=0.302，t=0.881，t=1.060；P＞0.05)。相關性分析結果顯示，三系血細胞減少與骨髓病態造血程度呈顯著正相關(r=0.355，P＜0.05)，而三系血細胞減少與脾功能亢進程度呈顯著負相關(r=-0.521，P＜0.05)。結論：肝炎肝硬化外周血細胞減少與骨髓病態造血及脾功能亢進具有相關性，系由血細胞生成減少、成熟障礙以及破壞增多所致，而血細胞減少可作為預后判斷的重要指標，且三系血細胞減少提示預后較差。

肝炎肝硬化；病態造血；脾功能亢進；乳酸脫氫酶

[First-author’s address] Clinical Laboratory, Tianjin Nursing Home of Beijing Military Region, Tianjin 300381, China.

肝炎肝硬化主要為乙型、丙型及丁型肝炎病毒感染，約占肝硬化總數的60%～80%，通常經過慢性肝炎階段演變而來[1]。我國肝炎肝硬化80%以上與慢性乙型肝炎感染有關，然而有關肝炎肝硬化外周血細胞減少，文獻報道均認為系脾功能亢進所致[2-4]。為探討肝炎肝硬化外周血細胞減少與骨髓病態造血及脾功能亢進的相關性，并與血清乳酸脫氫酶活性變化及骨髓病態的臨床意義，本研究經過肝炎肝硬化骨髓祖細胞體外培養及骨髓血細胞病態學觀察和分析，對肝炎肝硬化血細胞減少與骨髓病態造血及脾功能相關性以及預后進行探討[5-6]。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2014年1月至2016年1月北京軍區天津療養院收治的320例乙型肝炎肝硬化代償期及失代償期患者，其中男性279例，女性41例；年齡26～68歲。將其分為脾大組及無脾大組，每組160例；另選40名同期健康獻血者作為對照組，其中男性26例，女性14例；年齡30～49歲。采用隨機數表法選取60例失代償期肝炎肝硬化患者，將其分為脾大組及無脾大組，每組30例，進行骨髓祖細胞體外培養及骨髓血細胞形態學觀察，并作回顧性分析。所有患者均簽署知情同意書。

1.2納入與排除標準

(1)納入標準：①病毒性肝炎肝硬化(代償期及失代償期)診斷符合1999年出版的《現代傳染病學》[4]中的標準；②病毒學標志物檢驗，HBsAg陽性和(或) HBV-DNA＞500 copies/ml；③以中國醫科院血液病研究所提供的骨髓祖細胞正常值為參考，將大于正常值的紅系祖細胞(CFU-E直徑15～25 μm)，粒系祖細胞(CFU-GM 25～30 μm)，巨核系(CFU-F直徑30～45 μm)骨髓祖細胞納入。

(2)排除標準：肝癌(原發性和繼發性)、非病毒性肝炎肝硬化、特發性門脈高壓、晚期血吸蟲病以及柏-查氏綜合征。

1.3儀器設備

采用Au5800全自動生化分析儀(美國貝克曼公司)。

1.4檢測方法

患者入院后即進行外周血常規，網織紅細胞成熟指數(reticulocyte maturity index，RMI)，血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性檢測，并于髂后上嵴穿刺抽取骨髓液3 ml，肝素鈉抗凝，稀釋后鋪在淋巴細胞分離液上，比重1.075～1.079/ cm，1500 r/min離心15 min，吸取界面層有核細胞，使用IMDM培養液洗滌2次，以1000 r/min離心10 min后備用。

1.5體外培養

1.5.1骨髓晚期紅系祖細胞(CFU-E)培養

經淋巴細胞分離的有核紅細胞2×105/ml，內含小牛血清35%，青霉素、鏈霉素各100 U，L-谷氨酰胺15 μl，促紅細胞生成素1 U，2-巰基乙醇10 min/ L，0.9%甲基纖維素、IMDM培養液補足，置于小平皿中30 min，放入37 ℃、5%的CO2孵育箱內5 d后計數。5個培養皿為1個試驗點，取5個培養皿計數的平均值。

1.5.2骨髓粒-單系祖細胞(CFU-GM)培養

經淋巴細胞分離的有核細胞2×105/ml，內含小牛血清35%，青霉素、鏈霉素各100 U，L-谷氨酰胺15 μl，促紅細胞生成素1 U，2-巰基乙醇10 min/L，肌浸液10%，3%瓊脂0.07 ml，IMDM培養液補足，置于30 mm小培養皿中，放入37 ℃、5%的CO2孵育箱內9 d后計數。5個培養皿為1個試驗點，取5個培養皿計數的平均值。

1.5.3骨髓纖維祖細胞(CFU-F)培養

經淋巴細胞分離的有核紅細胞8×106/ml細胞懸液8 ml，內含小牛血清20%，青霉素、鏈霉素各100 U，L-谷氨酰胺15 μl，IMDM培養液補足，接種于50 ml容積的培養瓶中，放入37 ℃、5%的CO2飽和度的孵育箱內，每3 d換液一次，繼續在上述條件下培養12～14 d，在倒置顯微鏡下計數5個培養皿。

1.5.4集落計數

CFU-E＞8個細胞為1個集落；CFU-GM＞40個細胞為1個集落；CFU-F＞40個細胞為1個集落。紅系祖細胞集落正常范圍在68～93個，粒單系祖細胞集落正常范圍在14～29個，纖維祖細胞集落正常范圍在16～62個。三系祖細胞集落生長減少(CFU-E集落數＜68，CFU-GM集落數＜14，CFU-F集落數＜16)或無集落生長為集落生長不良。

集落生長不良率＝集落生長減少率＋無集落生長率。

1.6血常規判斷標準

血紅蛋白男性≤120 g/L，女性≤110 g/L為異常；中性粒細胞≤2.0×109/L、血小板計數≤100×109/ L、LDH＞245 u/L為異常；網織紅細胞絕對數＞45×109/L，CFU-E≤50(2×104)個有核細胞、CFU-GM≤60(1×105)個有核細胞、CFU-F≤40(1×105)個有核細胞為異常；有類巨幼變或巨大紅細胞或雙核紅細胞三者之一者為紅系病態造血；核漿發育不平衡或有異常大顆粒二者之一為粒細胞病態造血；巨核細胞減少或有無核巨核細胞二者之一者為巨核細胞病態造血；肋下未觸及脾或B超和X射線檢查未見脾腫大為無脾腫大。

1.7統計學方法

采用SPSS13.0統計軟件對所有數據進行分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用兩樣本t檢驗，計數資料采用x2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

表1　代償期肝硬化兩組外周血細胞及血清LDH測定值比較

表1　代償期肝硬化兩組外周血細胞及血清LDH測定值比較

組別例數血紅蛋白(g/L)中性粒細胞(×109/L)血小板(×109/L)LDH(×109/L)脾大組4099.32±12.132.42±0.1289.39±51.42406.46±19.54無脾大組120101.53±24.332.53±1.0194.39±16.41386.11±23.16 t值0.0170.0190.0150.014 P值0.9860.8670.9760.642

表2　失代償期肝硬化兩組外周血細胞及血清LDH測定值比較

表2　失代償期肝硬化兩組外周血細胞及血清LDH測定值比較

組別例數血紅蛋白(g/L)中性粒細胞(×109/L)血小板(×109/L)血清乳酸脫氫酶(×109/L)脾大組12091.63±31.962.13±1.0684.62±17.36466.41±81.32無脾大組4099.66±41.532.94±1.6695.31±19.15398.45±34.16 t值8.3642.4423.5424.524 P值0.0080.0160.0240.018

表3　代償期肝硬化兩組外周血細胞減少率及LDH活性升高率比較[n(%)]

表4　失代償期肝硬化兩組外周血細胞減少率及LDH活性升高率比較[n(%)]

2　結果

2.1代償期肝硬化兩組外周血細胞及血清LDH測定值比較

(1)代償期肝炎肝硬化脾大組與無脾大組比較，三系血細胞減少及LDH升高，差異均無統計學意義(t=0.017，t=0.019，t=0.015，t=0.014；P＞0.05)，見表1。

(2)失代償期肝炎肝硬化脾大組與無脾大組比較，三系血細胞減少及LDH升高，差異有統計學意義(t=8.364，t=2.442，t=3.542，t=4.542；P＜0.05)，見表2。

2.2脾腫大外周血細胞減少率及LDH活性升高率比較

(1)代償期肝炎肝硬化脾大組與無脾大組一系血細胞減少率二系和三系減少率比較，差異均無統計學意義(x2=0.986，x2=0.857；P＞0.05)，見表3。

(2)失代償期肝炎肝硬化脾大組與無脾大組比較，三系血細胞減少率及LDH升高率，差異有統計學意義(x2=4.267，x2=5.216；P＜0.05)。在脾大組與無脾大組RMI降低中比較，差異無統計學意義(x2=0.924，P＞0.05)，見表4。

2.3失代償期肝硬化兩組骨髓祖細胞不良生長率及骨髓血細胞病態造血率比較

失代償期肝硬化脾大組與無脾大組骨髓祖細胞不良生長率及骨髓血細胞病態造血率相比，差異均無統計學意義(x2=0.798，x2=1.754，x2=0.618，x2=1.575，x2=0.302，x2=0.881，x2=1.060；P＞0.05)，見表5。

表5　失代償期肝硬化兩組骨髓祖細胞生長不良率及骨髓血細胞病態造血率比較[例(%)]

骨髓血細胞形態學顯示出骨髓祖細胞病態造血形態和骨髓粒系病態造血，如圖1、圖2所示。

圖1　顯微鏡下骨髓粒系病態造血形態圖(×1000)

圖2　顯微鏡下骨髓紅系病態造血形態圖(×1000)

2.4相關性分析

對骨髓病態造血及脾功能分級進行賦值(C級=1，B級=2，A級=3，正常=4)，外周三系血細胞水平與骨髓病態造血分級進行spearman相關分析的結果顯示，三系血細胞與骨髓病態造血分級呈顯著正相關(r=0.355，P＜0.05)，而三系血細胞與脾功能分級呈顯著負相關(r=-0.521，P＜0.05)。

3　討論

脾臟由3～7支脾動脈供血，靜止時的脾臟每100 g組織的血流為40～100 ml/min，占心臟博出量的1%～10%。由脾靜脈支引流入門靜脈，脾靜脈血液占門靜脈血流的20%～40%，而肝硬化時門靜脈高壓，脾靜脈回流阻力升高，從而發生淤血性脾腫大[7-9]。脾功能亢進是脾臟腫大，伴隨一系或多系血細胞減少，而減少的血細胞須伴隨相應的骨髓造血的代償性增強，但血細胞形態學通常是正常的[6]。脾臟具有重要的免疫和血液過濾作用，由于脾臟腫大，過濾床也必然增大，首先是白細胞和血小板在脾臟內阻留，長期脾竇淤血，脾內纖維組織和脾髓細胞(主要是單核-巨噬細胞)增生，使脾臟破壞血細胞的功能增強，主要表現為白細胞和血小板減少，有些病例紅細胞也減少，血紅蛋白降低[10-13]。

多年來，國內外學者一致認為，肝硬化患者外周血一系或多系血細胞減少，即為脾功能亢進的金標準[1～4]。報道稱少數病例雖有脾功能亢進但并無脾腫大，脾腫大與脾亢進時伴有血細胞減少[14-16]。本研究所見代償期肝炎肝硬化脾大組與無脾大組，外周血三系血細胞減少程度及LDH活性升高程度比較，差異無統計學意義，提示外周血一系或多系血細胞減少并非都是脾功能亢進所致。而失代償期肝炎肝硬化脾大組與無脾大組，外周血任何一系血細胞減少率比較，差異有統計學意義。脾功能亢進早期主要是中性粒細胞和血小板減少，故本研究提示，代償期肝炎肝硬化首先是血紅蛋白降低，網織紅細胞絕對數大多降低，血清LDH升高，表明骨髓紅系統出現無效造血并非完全脾功能亢進所致[17]。

本研究失代償期肝炎肝硬化無脾大組也表現出外周血一系或多系血細胞減少，可能并非完全脾功能亢進所致。表3顯示，骨髓CFU-F、CFU-E及CFUGM生長不良率，脾腫大組與無脾腫大組比較差異無統計學意義；骨髓血細胞病態改變率，血清LDH活性，差異無統計學意義。CFU-F被認為代表骨髓造血微環境，CFU-F生長不良率提示骨髓造血微環境損害，導致造血干細胞在造血微環境中定居、存活、增殖與分化以及成熟障礙[7]。本研究結果顯示，骨髓CFU-E、CFU-GM體外培養，無集落生長或生長不良，進一步表明骨髓祖細胞生成減少[8]。骨髓三系血細胞也出現病態造血，紅系出現類巨幼變、巨大紅細胞、雙核紅細胞以及粒細胞核漿發育不平衡，有粗大異常顆粒[5，16]；巨核細胞減少，血小板減少等改變。由于肝功能障礙及內毒素血病使骨髓造血微環境損害→造血干細胞受損→骨髓祖細胞生成減少→骨髓血細胞無效造血在骨髓和血管內破壞，大量不成熟、病態和畸形三系血細胞進入脾臟，使脾臟破壞血細胞功能增強。

綜上所述，肝炎肝硬化外周血一系或多系減少的原因是：骨髓造血微環境損害→干細胞受損→祖細胞生成減少→骨髓血細胞破壞→成熟血細胞在脾內破壞→部分成熟病態血細胞在血循環內破壞。病態造血加速加重脾功能亢進，而脾功能亢進又加重血細胞破壞，形成惡性循環。脾功能亢進使脾靜脈超負荷，又加重門脈高壓，門脈高壓又使脾再增大，功能再增強，形成第二個惡性循環。外周血細胞減少不僅反映了脾功能亢進、肝功能失代償以及門脈高壓，也反映了骨髓病態造血，將導致心、腎、腦并發癥及出血、感染及貧血加重。肝炎肝硬化血清LDH活性升高，可作為骨髓病態造血，血細胞破壞增加的標志。肝炎肝硬化外周血細胞減少，可作為預后判斷的重要指標，三系血細胞減少預后較差，且補鐵及維生素B12不易糾正。

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Study on the correlation between the blood cell reduction of hepatitis cirrhosis, the pathological hematopoiesis of bone marrow and spleen function

LU Guang-sheng, JING Ye, XU He-fu, et al// China Medical Equipment,2016,13(11):93-97.

Objective: To investigate the correlation between the blood cell reduction of hepatitis cirrhosis and the relationship between the pathological hematopoiesis of bone marrow and spleen function, and the clinical significance of the activity of lactate dehydrogenase in the prognosis of the patients. Methods: 320 cases with compensated and decompensated cirrhosis splenomegaly were selected and divided into splenomegaly group and non splenomegaly group with 160 patients in each group. At the same time, 40 cases of healthy blood donors were taken as the control group, detected LDH activity in peripheral blood and serum. And 30 patients were randomly selected in decompensated liver cirrhosis splenomegaly group and without splenomegaly, treated with in vitro culture of bone marrow progenitor cells and morphological observation of bone marrow blood cells. And the results were statistically analyzed. Results: The difference was not statistically significant about hemoglobin, neutrophil and platelet activity and LDH value in compensated cirrhosis splenomegaly group and non splenomegaly group (t=0.017, t=0.019, t=0.015, t=0.014; P＞0.05). The hemoglobin, neutrophil, platelet count and LDH activity in decompensated cirrhosis splenomegaly group significantly higher than those in non splenomegaly group. The difference was statistically significant(t=8.364, t=2.442, t=3.542, t=4.542; P＜0.05). The difference was not statistically significant about adverse growth rate of bone marrow progenitor cells and abnormal hematopoietic rate of bone marrow hematopoietic cells in the two groups(t=0.798, t=1.754, t=0.618, t=1.575, t=0.302, t=0.881, t=1.060; P＞0.05). Correlation analysis showed that the reduction of the three series of blood cells was positively correlated with the degree of pathological hematopoietic(r=0.355, P＜0.05), and the three series of blood cells decreased with the degree of spleen function is significantly negatively related to the degree of hyperthyroidism(r=-0.521, P＜0.05). Conclusion: The decrease of peripheral blood cells in patients with hepatitis cirrhosis is related to the pathological hematopoiesis of bone marrow and spleen. The blood cell formation is reduced, and mature disorders, damage caused by increased blood cells can be used as an important indicator of prognosis. The three series of blood cells reducing shows that prognosis is poor.

Hepatitis cirrhosis; Dyshamatopoiesis; Spleen function hyperthyroidism; Lactate dehydrogenase

陸光生,男,(1960- ),本科學歷，主任醫師。北京軍區天津療養院普通外科，從事普通外科臨床、教學及科研工作。

1672-8270(2016)11-0093-05

R575.2

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.11.028

①北京軍區天津療養院普通外科 天津 300381

②北京軍區天津療養院檢驗科 天津 300381

③北京軍區天津療養院護理部 天津 300381

xiaotian7211@sina.com

2016-06-29