PM2.5對HTR8-SVneo細胞的毒性作用

秦喆，侯海燕，徐忠偉，張利文，韓斌，吳思雨，陳亞瓊

·論著·

PM2.5對HTR8-SVneo細胞的毒性作用

秦喆，侯海燕，徐忠偉，張利文，韓斌，吳思雨，陳亞瓊

目的：探討大氣中的PM2.5對HTR8-SVneo細胞的毒性作用。方法：采用0，30，60，120和200 μg/mL 5個濃度的PM2.5對HTR8-SVneo細胞染毒24 h，以0 μg/mL濃度為對照組，其余濃度為不同劑量PM2.5染毒組，通過CCK-8細胞增殖毒性檢測試劑盒測定細胞存活率；激光全息細胞分析及成像系統觀察細胞3D形態及動態監測24 h內各組細胞數量變化；流式細胞儀檢測細胞生長周期；彗星試驗檢測細胞DNA損傷水平；活性氧簇（ROS）檢測試劑盒測定細胞內ROS水平。結果：60，120和200 μg/mL濃度組細胞存活率及增殖能力低于對照組（P＜0.05或P＜0.01）；PM2.5可使HTR8-SVneo細胞的生長周期阻滯在G2/M期（P＜0.05或P＜0.01）；不同濃度PM2.5染毒組彗尾DNA百分比均高于對照組（P＜0.01），且呈劑量依賴性。各濃度染毒組細胞中ROS的產生均高于對照組（P＜0.05或P＜0.01）。結論：PM2.5對HTR8-SVneo細胞有一定毒性作用，造成DNA的損傷，阻礙細胞生長周期，這種毒性作用可能與氧自由基的產生增多有關。

空氣污染物；滋養細胞；細胞毒性

（J Int Reprod Health/Fam Plan，2016，35：449-453）

PM2.5（particulate matter 2.5）是空氣動力學直徑≤2.5 μm的大氣固態與液態顆粒物質的總稱，粒徑小，比表面積大，彌散距離遠，可攜帶多種有毒物質進入人體肺泡沉積，并穿過肺泡氣血屏障進入血液。PM2.5與多種疾病發病機制有關，危害人類健康，成為目前醫學領域的研究熱點。許多學者通過體內、體外實驗聚焦于PM2.5對呼吸系統、心血管系統的損傷作用及其相關機制，其對生殖系統的影響卻大多集中于流行病學調查層面。流行病學研究發現，PM2.5與不良妊娠結局有關，如造成胚胎停育、胎盤早剝、低出生體質量兒等[1-4]，其具體機制卻鮮有提及。HTR8-SVneo細胞是永生化的人類早孕胎盤絨毛膜外滋養細胞，HTR8-SVneo細胞的正常增殖與分化是胎盤形成及發揮生理功能的重要保證，由于其無限傳代的特性常被用于藥物或毒物與妊娠關系的研究。本文以HTR8-SVneo細胞為研究對象，探討PM2.5對其細胞毒性作用，以探討PM2.5致不良妊娠結局的具體機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞人絨毛膜外滋養細胞HTR8-SVneo細胞系由加拿大Graham教授惠贈。

1.1.2試劑與儀器①試劑：胎牛血清、RPMI 1640培養基（美國Gibco公司），胰蛋白酶（美國Hyclone公司），CCK-8（Cell Counting Kit-8）檢測試劑盒（日本同仁化學研究所），流式細胞周期試劑盒（美國Biolegend公司），活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。②儀器：TH-1000C型空氣采樣器（天虹儀器有限責任公司，武漢），CO2恒溫三氣細胞培養箱（美國Thermo Fisher公司），超凈工作臺（新加坡藝思高科技有限公司），倒置顯微鏡（日本Nikon公司），激光全息細胞分析及成像系統（瑞典Phiab公司），高速冷凍離心機（美國Beckman公司），全波長酶標儀（美國Molecular Devices公司），流式細胞儀（美國Beckman公司）。

1.2方法

1.2.1PM2.5懸濁液的配置中國環境科學院提供儀器和技術支持，利用玻璃纖維濾膜，使用TH-1000C型空氣采樣器采集2015年11月天津醫科大學周圍大氣中的PM2.5顆粒物，吸氣流量約為1.2 m3/min，一次連續采樣24 h。將吸附有PM2.5的石英濾膜剪成1 cm×1 cm的方塊，置于250 mL的廣口玻璃瓶中，加入100 mL超純水，將盛有剪好的濾膜和超純水的廣口瓶置于超聲波清洗儀中，4℃恒溫，超聲清洗60 min后用8層紗布過濾，將濾液4℃，12 000 r/min，30 min離心棄上清，沉淀真空冷凍干燥24 h，凍干后PM2.5呈灰黑色絮狀物，紫外線照射0.5 h后用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）配置成20 mg/mL的染毒母液。

1.2.2細胞培養HTR8-SVneo細胞用含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），1%谷氨酰胺，1%丙酮酸鈉，1%青-鏈霉素，1%4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）的RPMI（Roswell Park Memorial Institute）1640培養基，37℃，10%O2，5%CO2的培養箱中培養。

1.2.3CCK-8細胞增殖毒性檢測常規培養消化細胞，以3×103/孔密度接種細胞于96孔板中常規培養24 h后，1 500 r/min，5 min離心，棄上清，實驗組每孔加入不同濃度染毒溶液（10，20，40，60，80，100，120，160和200 μg/mL PM2.5）培養24 h，實驗設立陰性對照組（含有培養基加細胞，無PM2.5染毒液）和空白對照組（僅有培養基），每孔加入20 μL CCK-8，孵育3 h后，酶標儀讀取A450吸光度值。存活率=（實驗組－空白對照）/（陰性對照－空白對照）×100%。

1.2.4全息細胞儀觀察細胞3D形態及動態監測HTR8-SVneo細胞數的變化常規培養消化細胞，以2×105/孔密度接種細胞于六孔板常規培養24 h后，每孔加入不同濃度染毒溶液（0，30，60，120和200 μg/mL PM2.5）后，用激光全息細胞分析及成像系統每隔20 min進行一次細胞計數，監測24 h內的細胞增殖情況。

1.2.5流式細胞儀檢測PM2.5對HTR8-SVneo細胞周期的影響常規培養消化細胞，以105/孔密度接種細胞于六孔板常規培養24 h后收集各孔細胞至1.5 mL環氧樹脂（Epoxy epoxide，EP）管中，吸凈管中PBS后逐滴加入預先配制好的預冷的75%乙醇，滴加的同時輕柔震蕩，-20℃固定。PBS洗固定后的細胞2次，各管加入500 μL含0.2%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X 100），100 μg/mL核糖核酸酶A、50 μg/mL碘化丙啶的PBS，避光孵育0.5 h后上機。實驗獨立重復3次。

1.2.6單細胞凝膠電泳實驗（彗星實驗）檢測PM2.5對HTR8-SVneo細胞的DNA損傷作用常規消化細胞，制備單細胞懸液。取100 μL于45℃水浴中保溫的0.5%正常熔點瓊脂糖，鋪于磨沙載玻片上，形成底膠，蓋玻片推勻，不能有氣泡，4℃凝固5～8 min。水平取下蓋片，取100 μL于37℃水浴中保溫的1%低熔點瓊脂糖與100 μL細胞懸液（約400個細胞）混勻，立即鋪片，加上蓋玻片，4℃凝固5～8 min。將制備好的膠板去掉蓋玻片后，浸于4℃預冷的細胞裂解液中，在4℃下裂解1～3 h。取出膠板，用雙蒸水浸沒漂洗后放入電泳槽中，浸泡在4℃預冷的電泳液中解旋30 min～1 h。玻片水平放置陽極端附近，4℃電泳20～25 min（25 V，300 mA）。可在電泳槽周圍加冰塊以保持低溫。電泳結束后將膠板浸泡于中和液中，每次10min，中和3次，每次要更換中和液。最后晾干。取出膠板，碘化丙啶（5 mg/mL）染色，暗處染色5～10 min。蒸餾水漂洗2次，每次5 min。稍晾干，濾紙吸去多余水分，盡快在熒光顯微鏡下觀察，利用彗星分析軟件（CometAssaySoftwareProject，CASP）分析圖像。實驗獨立重復3次。

1.2.7HTR8-SVneo細胞氧化指標的檢測各組細胞ROS含量的檢測嚴格按照試劑盒說明書進行。按照1∶1 000用無血清培養液稀釋熒光探針2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFHDA），使終濃度為10 μmol/L。收集消化后的細胞，懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細胞濃度為106個/mL，37℃細胞培養箱內孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。使用熒光酶標儀檢測。實驗獨立重復3次。

1.3統計學方法采用SPSS21.0軟件分析數據，定量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組細胞3D形態HTR8-SVneo細胞正常形態為梭形，且輪廓清晰。隨著PM2.5染毒劑量的增加，細胞形態發生改變，輪廓逐漸模糊。見圖1（見封三）。

2.2CCK-8細胞增殖毒性檢測結果不同濃度染毒組的細胞存活率比較，差異有統計學意義（F=21.74，P＜0.05）；與對照組（0 μg/mL）相比，120 μg/mL和200 μg/mL PM2.5染毒組的細胞存活率降低，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見圖2。

圖2　各組HTR8-SVneo細胞存活率比較

2.324h內細胞增殖情況各組細胞增殖力比較差異有統計學意義（F=108.8，P＜0.01），其中與對照組（0 μg/mL）相比，30 μg/mL PM2.5染毒組細胞增殖能力變化差異無統計學意義（P＞0.05），隨著染毒濃度的增加，60、120和200 μg/mL PM2.5染毒組的細胞增殖能力逐漸減弱，差異有統計學意義（均P＜0.01）。見圖3（見封三）。

2.4PM2.5對HTR8-SVneo細胞周期的影響隨著PM2.5濃度增加，G2/M期細胞數逐漸增多，各組G2/ M期細胞數分別為（20.84±2.61）個、（49.10±6.14）個、（53.72±6.72）個、（61.37±7.67）個和（61.96±7.75）個，差異有統計學意義（F=20.42，P＜0.01）。與對照組（0 μg/mL）相比，不同濃度PM2.5染毒組的G2/M期細胞數均升高（P＜0.05或P＜0.01）。見圖4（見封三）。

2.5PM2.5對HTR8-SVneo細胞DNA的損傷作用不同濃度組的細胞彗尾DNA百分比比較，差異有統計學意義（F=156.5，P＜0.01），其中60，120和200 μg/mL PM2.5染毒組的細胞彗尾DNA百分比大于對照組，且呈劑量依賴性，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖5（見封三）。

2.6HTR8-SVneo細胞內ROS含量的測定不同濃度組細胞內ROS含量比較，差異有統計學意義（F= 39.87，P＜0.01）。60，120和200 μg/mL PM2.5染毒組細胞內ROS含量高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見圖6。

圖6　PM2.5對HTR8-SVneo細胞內ROS含量的影響

3　討論

滋養細胞來源于胚胎外胚層，是構成胎盤的主要細胞，在妊娠早期適度侵入子宮蛻膜和血管，促進胎盤著床及子宮螺旋動脈的重塑，確保胚胎正常植入以及胎兒足夠的血液供應。因此，滋養細胞正常的增殖能力與生物學功能是妊娠成功的先決條件。以HTR8-SVneo細胞為研究對象，探討PM2.5對滋養細胞的毒性作用對于了解PM2.5致不良妊娠結局的具體機制具有重大意義。

3.1PM2.5降低HTR8-SVneo細胞的增殖能力

HTR8-SVneo是永生化的人絨毛膜外滋養細胞，具有和原代滋養細胞相同的生物性狀。本研究發現，不同濃度PM2.5對HTR8-SVneo細胞增殖均有一定影響，CCK-8細胞毒性檢測與激光全息細胞分析及成像系統均顯示PM2.5影響細胞的正常增殖且存在劑量依賴效應。研究已證實PM2.5對細胞增殖的抑制作用，例如，人類肺成纖維細胞經100～200 μg/mL的PM2.5染毒24 h后存活率降為81%～91%[5]。烹調油煙中的細顆粒物PM2.5對胎鼠AECⅡ細胞增殖具有明顯的抑制作用，且呈時間-反應關系和劑量-反應關系，其中200 μg/mL PM2.5造成AECⅡ細胞存活率約為50%[6]。本研究通過全息細胞儀觀察染毒24 h后各組細胞形態發現，隨著染毒濃度增加，細胞輪廓逐漸模糊，說明HTR8-SVneo細胞經PM2.5染毒后細胞膜完整性受損，與同類研究結果類似[7]。

3.2PM2.5使HTR8-SVneo細胞周期發生阻滯一個完整的細胞周期包括4個階段，分別為G1期、S期、G2期和M期，G1期是從有絲分裂到DNA復制前的一段時期，主要是RNA和蛋白質的合成，為S期細胞質和DNA的合成與復制做準備。S期為DNA合成期，在此期除了合成DNA外，同時還要合成組蛋白。G2期DNA合成結束，M期即細胞進入有絲分裂。細胞停留在G1或G2期過久則說明發生了阻滯，細胞周期阻滯受到一系列分子機制的調控，使得細胞DNA在S期復制或M期分裂時免受損害，避免錯誤的遺傳信息進入子代細胞，保持細胞遺傳特性的穩定性。細胞周期阻滯是細胞對外界刺激的一種保護效應，G1期阻滯可以提供充足的時間誘導受損DNA的修復。細胞經過G2/M這一調控點即進入有絲分裂階段，G2/M期則確保細胞精準地完成有絲分裂過程。若一些損傷的DNA未經修復直接進入下一個細胞周期階段，這種損傷將會導致遺傳的不穩定性[8]。研究表明，PM2.5可影響多種細胞的生長周期。Deng等[9]用源于沙塵暴的PM2.5以及正常來源PM2.5處理人類肺纖維細胞，發現G2/M期細胞數顯著增多。另有研究發現PM2.5在抑制原發性胎兒肺泡Ⅱ型上皮細胞ACEⅡ增殖的同時使ACEⅡ細胞生長周期阻滯在sub-G1與G1期，并且由細胞周期蛋白/細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin/CDK）復合物嚴格調控，驗證了PM2.5對細胞增殖的抑制作用與細胞周期進程有關的猜想[8]。本研究發現，隨著PM2.5染毒劑量的增加，G2/M期細胞數量逐漸增加，PM2.5可以影響多種細胞的有絲分裂周期，例如PM2.5通過氧化應激ROS增多激活c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）和胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路，造成大鼠胚胎細胞G1/S期阻滯[10]。Longhin等[11]發現PM2.5激活了P53-Chk2通路造成BEAS-2B細胞G2/M期阻滯。Abbas等[12]發現PM2.5通過TP53-RB通路造成L132細胞G2期阻滯。由此可見，PM2.5對細胞周期的影響依賴于細胞種類的不同，并且涉及不同的通路，筆者認為PM2.5對細胞增殖能力的抑制作用與其對細胞周期進程的影響關系密切，PM2.5使HTR8-SVneo細胞發生G2/M期阻滯，而具體分子機制有待探討。有學者發現殺蟲劑苯菌靈降低HTR8-SVneo細胞在G0/G1期的比例，使細胞停留在G2/M期，因為苯菌靈可以結合紡錘體微管蛋白破壞其裝配，在有絲分裂期間影響細胞周期進程[13]，因此筆者推測，PM2.5可能同樣影響HTR8-SVneo細胞內紡錘體的裝配從而改變細胞生長進程。

3.3PM2.5通過氧化應激造成HTR8-SVneo細胞DNA損傷已知PM2.5誘導細胞發生氧化應激是其細胞毒性的主要分子機制[14]。本課題組前期研究發現，多環芳烴類污染物苯并芘（BaP）可以刺激HTR8-SVneo細胞發生氧化應激，而BaP又是PM2.5的組成成分[15]。本研究發現，HTR8-SVneo細胞經不同濃度PM2.5染毒后ROS產生量亦增多，驗證了本課題組對PM2.5誘發HTR8-SVneo細胞氧化應激的猜想。既往研究表明，PM2.5誘導ROS的產生與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員，以及缺氧誘導因子1α（HIF-1α）、核因子κB（NF-κB）等轉錄因子的激活關系密切，同時ROS作為一個信號分子開啟Nrf-2防御機制，通過磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路的激活抵御氧化應激[14]。有研究發現肺泡上皮細胞A549經PM2.5染毒后，在G2/M期產生的ROS最多，考慮為G2/M期的細胞中線粒體含量高所致[16-17]。結合本研究結果，筆者認為PM2.5造成HTR8-SVneo細胞產生ROS增多與其造成細胞G2/M期阻滯有關，但是否涉及其他通路有待進一步研究。

氧化應激造成的DNA損傷包括8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）的形成和DNA鏈斷裂。彗星實驗是一種通過檢測DNA鏈損傷來判別遺傳毒性的技術，當各種內源性和外源性DNA損傷因子誘發細胞DNA鏈斷裂時，在堿性電解質的作用下，DNA發生解螺旋，損傷的DNA斷鏈及片段被釋放出來。由于這些DNA的分子質量小且堿變性為單鏈，所以在電泳過程中帶負電荷的DNA會離開核DNA向正極遷移形成“彗星”狀圖像，而未受損傷的DNA部分保持球形。DNA受損越嚴重，產生的斷鏈和斷片越多，長度也越大，在相同的電泳條件下遷移的DNA量就愈多，遷移的距離就愈長。本研究發現，隨著PM2.5濃度的增加，彗尾DNA含量增多，即證實了PM2.5對HTR8-SVneo細胞DNA的損傷作用，與許多同類研究結果類似[18-20]。因此可以確定的是，PM2.5誘導HTR8-SVneo細胞發生氧化應激后進一步損傷細胞DNA造成遺傳毒性。

綜上所述，PM2.5可以影響HTR8-SVneo細胞的生長周期從而抑制其增殖過程，同時誘導細胞發生氧化應激造成DNA的損傷。PM2.5對于HTR8-SVneo細胞的毒性作用可能是其造成不良妊娠結局的潛在機制。

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[本文編輯秦娟]

Cytotoxicity of PM2.5 on HTR8-SVneo Cells

QIN Zhe,HOU Hai-yan，XU Zhong-wei，ZHANG Li-wen，HAN Bin，WU Si-yu,CHEN Ya-qiong.
Department of Obstetrics and Gynecology，Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese People′s Armed Police Forces，Tianjin 300162，China（QIN Zhe，HOU Hai-yan，WU Siyu，CHEN Ya-qiong）；Central Laboratory，Logistics University of Chinese People′s Armed Police Forces，Tianjin 300162，China（QIN Zhe,XU Zhong-wei）；Peking Union Medical College Hospital，China Academy of Sciences，Beijing 100730，China（HOU Hai-yan）；School of Public Health，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China（ZHANG Li-wen）；State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment，Chinese Research Academy of Environmental Sciences，Beijing 100012，China（HAN Bin）

CHEN Ya-qiong，E-mail:chenyq82@hotmail.com

Objective:To investigate the cytotoxicity of atmospheric PM2.5 on HTR8-SVneo cells. Methods:The in vitro cultured HTR8-SVneo cells were exposed to PM2.5 at the concentrations of 0,30,60,120 and 200 μg/mL for 24 h.The cells treated with 0 μg/mL PM 2.5 were used as the control group.The cell survival rate was analyzed by the CCK-8 cell proliferation and cytotoxicity test kits.The 3D morphology was observed by the Laser holographic cell analysis and imaging system.The change in the number of cells was also dynamically monitored.The cell cycle was detected by flow cytometry.The level of DNA damage was detected by comet assay. The level of intracellular reactive oxygen species（ROS）was measured by the ROS kits.Results:The survival rate and proliferation ability in three groups treated with 60,120 and 200 μg/mL PM2.5 were significantly lower than those in the control group（P＜0.05 or P＜0.01）.PM2.5 treatment made the growth cycle arrest in G2/M phase（P＜0.05 or P＜0.01）.The percentage of tail DNA in the PM2.5 exposure groups was higher than that in the control group（P＜0.01）,with a dose-dependent manner.The level of ROS in the PM2.5 exposed groups was higher than that in the control group（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusions:PM2.5 has a certain cytotoxicity on HTR8-SVneo cells via the DNA damage and the cell cycle arrest which is related to the increased oxygen free radicals.

Air pollutants；Trophoblast cell；Cytotoxicity

國家自然科學基金（81402691）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃重點項目（15JCZDJC36000）

300162天津，中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫院婦產科（秦喆，侯海燕，吳思雨，陳亞瓊）；中國人民武裝警察部隊后勤學院中心實驗室（秦喆，徐忠偉）；中國醫學科學院北京協和醫學院（侯海燕）；天津醫科大學公共衛生學院（張利文）；環境基準與風險評估國家重點實驗室，中國環境科學研究院（韓斌）

陳亞瓊，E-mail：chenyq82@hotmail.com

（2016-09-10）