跑臺運動對腦缺血大鼠學習記憶能力及紋狀體BDNF表達的影響

唐 偉，王 霆

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跑臺運動對腦缺血大鼠學習記憶能力及紋狀體BDNF表達的影響

唐 偉1，王 霆2

跑臺運動可以改善腦卒中大鼠的學習記憶能力，然而機制尚不清楚。因此，通過觀察4周強迫跑臺運動對短暫大腦中動脈(MCAO，middle cerebral artery occlusion)栓塞大鼠空間學習記憶能力、血漿皮質酮(Cort)及紋狀體氨基酸水平和腦源性神經營養因子BDNF(brain-derived neurotrophic factor)表達的影響，研究跑臺運動改善MCAO大鼠學習記憶功能的可能機制。方法：45只SD大鼠隨機分為假手術組、腦缺血模型組及腦缺血運動組，腦缺血模型組及運動組大鼠制備MCAO短暫缺血模型，隨后腦缺血運動組大鼠進行4周跑臺運動。跑臺運動結束后通過水迷宮實驗測試所有大鼠學習記憶能力的變化，隨后放射免疫法測試大鼠血漿Cort含量，采用高效液相-電化學方法檢測紋狀體Glu、GABA的含量，用免疫組織化學結合圖像半定量方法對紋狀體BDNF神經元的數量及面積進行測量和分析。結論：大腦中動脈(MCAO)短暫缺血大鼠的學習記憶能力可以通過進行長期跑臺運動得到改善，其原理極有可能與長期跑臺運動上調紋狀體BDNF的表達，拮抗HPA軸功能亢進及興奮性氨基酸的毒性，抑制神經元的壞死及凋亡，促進腦缺血后損傷神經元的修復有關。

跑臺運動；大腦中動脈栓塞大鼠；學習記憶；皮質酮；氨基酸；紋狀體

腦卒中是世界上死亡率及致殘率最高的疾病之一，其中腦梗塞最為常見。大腦中動脈(MCAO)栓塞是腦卒中的常見原因，因此，大腦中動脈栓塞再灌注模型可以較好地模擬臨床腦卒中的病理過程而常被使用。研究發現[1-3]：跑臺訓練對腦缺血有保護作用，然而具體機制尚不清楚。

在中樞神經系統中，紋狀體是缺血性卒中比較敏感的核心區域之一，且紋狀體Glu(谷氨酸)、GABA神經元含量較多[4]。許多研究證實，腦缺血過程中腦內特別是缺血中心區域氨基酸類神經遞質尤其是興奮性氨基酸，例如谷氨酸(G1u)的過量釋放是缺血性腦損傷的重要因素之一，在腦缺血神經功能的損害中起著關鍵作用[5]。腦源性神經營養因子BDNF屬于神經營養因子家族成員，研究報道，BDNF不僅涉及神經發育，而且在腦卒中后損傷神經元再生修復方面發揮重要作用[6]。近年來，圍繞腦缺血急性期大腦BDNF的變化研究較多[7]；但是有關腦缺血后BDNF后期變化相關文獻較少，而且長期有氧運動改善腦缺血大鼠學習記憶能力的機制尚不清楚，因此本實驗通過復制大鼠大腦中動脈(MACO)栓塞再灌注模型，觀察長期跑臺訓練對MCAO模型大鼠空間學習記憶能力、紋狀體氨基酸水平及BDNF表達的變化，探討跑臺運動增強MCAO模型大鼠空間學習記憶能力的可能機制。

1 材料及方法

1.1 實驗動物及具體分組

健康雄性SD大鼠45只，鼠齡3個月，體質量220～230 g，室溫(25±1)℃，濕度(55±10)%，大鼠自由攝食、飲水。將45只大鼠隨機分為假手術組(SO)，腦缺血模型組(CM)及腦缺血運動組(CE)。

1.2 動物MCAO模型制備

模型組和運動組大鼠制作MCAO動物模型[8]。水合氯醛(4%，10 mL/kg)麻醉大鼠后，大鼠頸部正中被切開，分離右側頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)。結扎右側ECA遠心端，斜剪一切口，將預先處理過的直徑0.25 mm的尼龍線圓鈍端沿切口插入近心端，將尼龍線沿右側頸內動脈走向緩慢推進18～20 mm，直至尼龍線頂端有阻塞感，以阻斷右大腦中動脈入口，造成右側大腦中動脈供血區的缺血，90 min后緩慢退出尼龍線實施再灌流。在實驗過程中，大鼠肛溫控制在(37±0.5)℃，待清醒后放回籠中。假手術組除不阻塞大腦中動脈，其他手術步驟同腦缺血模型組。

參考Longa方法評價模型是否成功的分級標準：無神經損傷癥狀(0分)，不能完全伸展左側前爪(1分)，向左側轉圈(2分)，向左側傾倒(3分)，不能自發行走，意識喪失(4分)。剔除0分、4分及死亡大鼠，1～3分的大鼠入選本次實驗。

1.3 訓練方案

MCAO模型組與假手術組大鼠置于普通籠內常規飼養，期間可自由活動，進食飲水。MCAO運動組大鼠在術后4 d予以強迫跑臺訓練，連續4周，每天30 min，跑臺坡度為0°。跑速如下：第1天4 m/min，第2天8m/min，接下來每天12 m/min[9]。

1.4 水迷宮實驗(MWM)

跑臺訓練結束后第2天，用Morris水迷宮評估大鼠的學習記憶能力。水迷宮為圓形水槽，直徑150 cm，直徑14 cm的平臺放在水池西北象限的中央，平臺低于水面l cm，水溫24 ℃，實驗程序包括5 d定位航行實驗，定位航行實驗結束后24 h測試大鼠空間探索實驗，迷宮上方安置攝像機記錄大鼠游泳軌跡[10]。

1)定位航行實驗：為了讓實驗大鼠熟悉迷宮環境，要在實驗前1天將其放進沒有平臺的水槽中讓其自由游泳2 min，隨后進行5 d的定位航行實驗，要求每天將大鼠面向池壁，從東、西、南、北4個入水點下水，共訓練4次，每只大鼠允許其在2 min內找到平臺，如果在2 min后大鼠仍未找到平臺，就將逃避潛伏期記作2 min，并協助引導其到平臺上停留15 s后用吹風機吹干大鼠放進鼠籠，10～15 min后進行下一次實驗。最后要統計4次訓練后大鼠逃避潛伏期成績的平均值來作為當日的最終成績。

3)空間探索實驗：完成定位航行實驗后的第2天，從水中撤出平臺，由4個入水點中任一入水點將實驗大鼠放入水中，并記錄每只大鼠2 min跨越原平臺的次數及在原平臺象限停留的時間。

1.5 大鼠腦組織紋狀體谷氨酸及γ-氨基丁酸含量測定

每組6只大鼠水迷宮行為測試結束后即刻斷頭取腦，首先于冰盤上迅速分離紋狀體(大腦右側)，稱重，然后在冰上制備大鼠大腦組織紋狀體的勻漿，需要加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，隨后進行15 min(3 500 r/min)的離心，接著提取出清液1 mL，最后根據在試劑盒上的具體說明測定實驗大鼠大腦組織的紋狀體組織勻漿中Glu及GABA的具體含量。

1.6 紋狀體BDNF取材與切片

每組剩余5只大鼠行為測試結束后即刻，經腹腔注射戊巴比妥鈉(100 mg/kg)麻醉，開胸，用4%多聚甲醛常規灌注，去除大腦，蔗糖溶液后固定。在固定后使用石蠟包埋，然后將腦組織進行冠狀位切片，片厚5 μm，接著對BDNF免疫組織進行化學染色。將石蠟切片置于65 ℃烤箱中烘烤1 h，二甲苯脫蠟2次，加入3%的雙氧水-甲醇液在室溫下孵育10 min，隨后再滴加腦源性神經營養因子兔抗鼠血清第1抗體(配比1∶50，37 ℃孵育1 h)，PBS液洗3次，每次5 min，隨后加入生物素標記的羊抗兔第2抗體50 μL，37 ℃孵育1 h；接著DAB室溫顯色15 min，再進行蘇木素復染并裱片，然后梯度酒精脫水、透明，最后封片。

1.7 大鼠血漿皮質酮含量測試

在行為測試即刻結束后，腹腔注射戊巴比妥鈉(100 mg/kg)麻醉，在進行灌注和斷頭取腦時，從每只大鼠的左心室取血2 mL，4 ℃下進行3 500 r/min的離心10 min，吸棄掉上清液并分離血漿后，置于-70 ℃的低溫冰箱中冷凍保存，嚴格按照操作說明書來測定實驗大鼠血漿皮質酮的含量。

1.8 實驗圖像分析及統計學處理

采用數碼高倍生物顯微鏡拍攝并借助形態學顯微圖像分析系統進行分析，參照大鼠腦立體定位圖譜隨機選取紋狀體相同區域的5個視野，對大鼠缺血側紋狀體區BDNF(400倍)的陽性細胞進行計數及面積的測定，如圖1、2所示。

圖 1 冠狀位下紋狀體截面，箭頭所示(→)

圖 2 紋狀體BDNF陽性神經元分布(10×10，10×40)

2 研究結果

2.1 術后大鼠觀察

MCAO術后多數大鼠于1～2 h內清醒，對照組清醒后進

食及活動很好，未見明顯神經功能缺損癥狀，術后24 h所有MCAO大鼠均可自由飲水及攝食，術后48 h MCAO大鼠神經功能下降有所恢復，72 h后大部分大鼠神經功能缺失表現不明顯，術中及術后2 d腦缺血模型組及運動組大鼠各死亡2只。

2.2 跑臺運動對MCAO大鼠水迷宮實驗測試指標的結果

2.2.1 跑臺運動對MCAO大鼠定位航行實驗逃避潛伏期的影響

如圖3所示，由表1可知，各組大鼠5 d內尋找平臺的時間越來越短，表明大鼠在5 d的游泳訓練中對尋找隱藏在水中的平臺均有一定的記憶能力。假手術組大鼠平均逃避潛伏期很快下降，而腦缺血模型組及運動組大鼠平均逃避潛伏期緩慢下降，且波動很大。每組大鼠縱向數據表明：從水迷宮訓練的第l天起，腦缺血模型組大鼠比假手術組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)。腦缺血運動組大鼠水迷宮訓練的第l～3天逃避潛伏期顯著高于假手術組(P<0.01)，第4～5天開始差異較穩定，但仍具有顯著性(P<0.05)；腦缺血模型組大鼠從水迷宮訓練的第4～5天逃避潛伏期明顯短于模型組大鼠(P<0.05)。

表 1 大鼠Morris水迷宮定位航行實驗結果 s

注：與腦缺血模型組比較，*為P<0.05，**P<0.01；與假手術組比較，#為P<0.05，##為P<0.01。下同。

注：免疫組織化學結果顯示腦缺血模型組大鼠紋狀體BDNF陽性神經元表達(→)與假手術組比較無統計學意義；跑臺運動4周后運動組大鼠紋狀體BDNF免疫陽性神經元表達與模型組比較顯著增強(→)。

bar=50 μm (2AC)。

圖 3 缺血側紋狀體BDNF陽性神經元分布

2.2.2 跑臺運動對MCAO大鼠空間探索實驗指標的影響

由表2可知：2 min內，與假手術組大鼠比較，腦缺血模型組大鼠初次找到原平臺的時間延長(P<0.01)，延長幅度為105%，穿越站臺次數較假手術組均明顯減少(P<0.01)，減少幅度為65%；與模型組比較，腦缺血運動組大鼠初次找到原平臺的時間顯著縮短(P<0.05)，縮短幅度為30%，穿越站臺次數顯著增多(P<0.01)，增加幅度為74%。

2.3 各組大鼠血漿皮質酮及紋狀體Glu及GABA測試結果

表3結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠紋狀體Glu含量顯著增加2.09倍(P<0.01)，GABA含量顯著下降(P<0.01)，下降幅度為40%；腦缺血運動組大鼠Glu含量與模型組相比顯著下降(P<0.01)，下降幅度為41%，GABA含量比模型組顯著增高(P<0.05)，增加幅度為31%。腦缺血模型組大鼠與假手術組比較血漿Cort含量顯著增加(P<0.05)，上升幅度為42%；腦缺血運動組大鼠血漿Cort含量與假手術組比較，無統計學意義(P>0.05)；經過4周跑臺運動，與腦缺血模型組比較，腦缺血運動組大鼠血漿Cort含量顯著下降(P<0.05)，下降幅度為28%。

表 2 大鼠Morris水迷宮空間探索實驗結果

表 3 各組大鼠血漿Cort及紋狀體谷氨酸及

2.4 各組大鼠缺血側紋狀體BDNF表達結果

圖2所示，光鏡下可見紋狀體內分布有大量的BDNF，低倍鏡下為褐色小圓點(如圖2A所示)，高倍鏡下BDNF神經元大小不一，胞核淡染，胞漿染色為深褐色，胞體形態多種多樣呈橢圓形或圓形(如圖2B所示)。

圖像分析結果顯示(見表4，并如圖3所示)：腦缺血模型組大鼠缺血側紋狀體BDNF陽性細胞表達與假手術組比較，無統計學意義(P>0.05)；與假手術組比較，腦缺血運動組大鼠紋狀體BDNF數量及面積均顯著增多(P<0.01，P<0.01)，增加幅度分別為75%及72%；與腦缺血模型組大鼠比較，腦缺血運動組大鼠紋狀體BDNF陽性細胞數量及面積均顯著增加(P<0.01，P<0.01)，增加幅度分別為45%及47%。

表 4 各組大鼠右側紋狀體BDNF陽性細胞數和

3 討論

本研究通過水迷宮實驗證實：短暫大腦中動脈栓塞嚴重削弱了大鼠學習記憶能力，而4周跑臺運動顯著增強了腦缺血大鼠的學習記憶能力，具體表現為水迷宮實驗中腦缺血運動組大鼠逃避潛伏期縮短，平臺停留時間延長，穿越站臺次數增加，與前期學者研究結果一致[11]。皮質酮是HPA軸的重要激素，Milot等[12]采用結扎雙側頸總動脈和造成大鼠腦缺血再灌注模型，皮質酮過度分泌一直延續到缺血后1個星期，說明腦缺血再灌注后伴發HPA軸功能紊亂，導致皮質酮含量增高對腦功能造成一定損害，與腦缺血引起的學習記憶能力下降有關。我們的實驗發現，大鼠單側(右側)大腦中動脈栓塞28 d大鼠Cort水平顯著高于假手術組，學習記憶能力下降，可能與應激激素Cort 的過度分泌有關。研究認為，25～30 m/min的跑臺運動可提高腦缺血大鼠的血清皮質酮水平[11]，并且Kim等研究認為，9 m/min的跑臺運動可以恢復應激障礙等疾病引起的HPA軸失調[13]；因此，為了避免跑臺運動對腦缺血大鼠的應激刺激本實驗大鼠的跑臺速度為4、8、12 m/min。結果發現腦缺血運動組大鼠血漿皮質酮水平顯著低于腦缺血組大鼠，因此，可以認為4周跑臺運動改善腦缺血大鼠學習記憶能力與血漿皮質酮水平下降有關。

關于腦缺血導致學習記憶能力下降的機制目前還在研究階段，腦內Glu/GABA 調節系統是近年研究的熱點[14]。在中樞神經系統中氨基酸遞質可分為興奮性(主要是Glu)和抑制性(主要是GABA)2類。Glu在學習記憶、尤其在誘導LTP的過程中起關鍵作用，并且成為成人大腦損傷的重要機制[15]。Campos等[16]研究發現腦缺血時Glu釋放量與缺血時間呈正相關，即缺血時間愈長，神經細胞和膠質細胞谷氨酸釋放量愈多。GABA是抑制性氨基酸的重要成員之一，是腦內主要的抑制性神經遞質，可拮抗Glu的毒性，對腦缺血神經元損傷有保護作用。研究認為：在慢性腦缺血損傷早期，Glu升高的同時，突觸前谷氨酸受體可以增加GABA的釋放，可通過突觸前抑制作用，減少Glu的釋放，減輕其興奮性毒性作用[17]；但在腦缺血持續的病理損傷過程中，GABA的合成會被關閉，繼之GABA逐漸耗竭[18]。本研究發現，大鼠短暫大腦中動脈栓塞28 d后，紋狀體Glu含量顯著增加，同時GABA水平顯著下降。臨床及動物實驗證實，體育鍛煉具有神經保護作用，動物實驗顯示長期運動可以通過減弱腦缺血大鼠的氧化應激、改善腦血流量、維護神經與血管的完整性增強大鼠學習記憶能力[19]，而Zhang等[20]認為跑臺運動預干預可以防止腦缺血引起的腦細胞后續損害，減輕炎癥反應，抑制谷氨酸過多釋放，保護血腦屏障，抑制細胞凋亡。本實驗結果發現經過4周跑臺運動，腦缺血運動組大鼠紋狀體Glu水平減少，GABA水平增加，并且腦缺血運動組大鼠學習記憶能力顯著增強，可能是因為升高的GABA抑制性的影響谷氨酸調節的神經活動，降低其神經毒性，從而增強腦缺血大鼠的學習記憶能力。

紋狀體是小腦基底神經節中的一個核團，在學習和記憶等高級神經活動中起關鍵作用，紋狀體神經元對大腦中動脈栓塞引起的腦缺血非常敏感，是腦卒中的易發部位之一[21]。腦源性神經營養因子BDNF由海馬和紋狀體等區域的神經細胞分泌，通過作用于受體激酶促進神經組織的生存和分化，并且在參與腦缺血損傷的再生修復等方面發揮重要作用。大量研究表明，腦缺血會導致大腦BDNF的表達，并且BDNF的表達與腦缺血后梗死面積及腦缺血后損傷的神經功能恢復有關，并且有時間依賴性[22]。國內徐正東等研究發現，即MCAO后6 h在大腦皮質表達增強，l d 達高峰，在以后的時間點逐漸下降，7 d之后仍有表達，但低于對照組，證明了大鼠腦缺血后早期可誘發BDNF的大腦皮質表達增加，對受損神經元修復起一定作用[23]。在本研究中，我們通過免疫組織化學染色法測試了大鼠紋狀體BDNF的表達，發現大鼠單側(右側)大腦中動脈栓塞28 d模型組大鼠紋狀體缺血側BDNF表達與假手術組比較無統計學意義，提示腦缺血狀態下紋狀體BDNF的應激性高表達難以維持較長時間，隨著腦缺血-再灌注時間的延長紋狀體在腦缺血損傷過程中組織自我修復能力低下有關，這可能是腦缺血大鼠學習記憶能力下降的機制之一。

國外學者研究認為，自愿運動及強迫跑臺運動均可通過上調海馬BDNF表達增強大鼠認知能力[24]，且研究表明低強度跑臺運動可改善大腦中動脈栓塞大鼠的學習記憶能力[25]；而Kima等[26]發現2周的跑臺運動增加了腦缺血大鼠海馬BDNF mRNA的水平，但對大鼠的運動功能及空間學習記憶能力沒有改善。因此，本實驗設計的跑臺運動為4周，結果發現，MCAO模型大鼠經過4周中等強度跑臺運動缺血側紋狀體BDNF表達明顯增強，提示腦缺血大鼠經過長期跑臺運動認知能力改善可能與紋狀體BDNF表達增強，促進缺血后損傷神經元的修復有關。最近研究報道腦缺血后高表達的BDNF可以通過下調NMDA受體功能，減少谷氨酸的分泌從而削弱谷氨酸的神經毒性，參與腦缺血損傷保護過程[27]；因此，本實驗中跑臺訓練在大鼠腦缺血神經元損傷后學習記憶能力增強的機制之一，可能是通過上調紋狀體BDNF的表達，拮抗HPA軸功能亢進及興奮性氨基酸的毒性，抑制腦缺血神經元的壞死及凋亡，促進損傷神經元的修復而起到腦保護作用，具體原理需進一步研究。

4 結論

4周跑臺鍛煉可以增強MCAO大鼠的學習記憶能力，可能與此運動上調腦缺血大鼠紋狀體BDNF的表達，拮抗HPA軸功能亢進及興奮性氨基酸的毒性，抑制缺血神經元的壞死及凋亡，促進腦缺血后損傷神經元的修復有關，提示紋狀體可能是運動增強腦缺血大鼠學習記憶能力的作用腦區之一，且這一作用可能是由跑臺運動調節腦缺血大鼠紋狀體Glu、GABA水平使其保持興奮-抑制平衡及上調紋狀體BDNF共同介導的。

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Effects of Treadmill Training on Learning and Memory and BDNF Expression within Striatum after Cerebral Ischemia Rats

TANG Wei1,WANG Ting2

Treadmill exercise may enhance the recovery of impaired memory function in stroke rats.However,the mechanisms underlying these beneficial effects are not yet known.Therefore,the purpose of this study was to investigate the effects of the 4-week forced treadmill exercise on the learning and memory,the blood plasma cort content,amino acid levels and BDNF expression within striatum of brain after MCAO(transient middle cerebral artery occlusion) rats,inquiring into the possible mechanism of treadmill exercise improving learning and memory of MCAO rats.Methods:45 male SD rats were randomly allocated to 3 groups,sham operation group(SO),cerebral ischemia model group(CM) and cerebral ischemia exercise group(CE).The rats of CM and CE group rats were submitted to the transient middle cerebral artery occlusion,and then the CE group rats received 4-week forced treadmill exercise.Then all rats were submitted to behavioral testing for spatial memory by the Morris water maze;then the blood plasma cort content was detected by radioimmunoassay.Subsequently the concentration of Glu and GABA were examined by high performance liquid- electrochemical detection and BDNF expression within striatum was detected and analysised by using immuneohistochemical method.Conclusion:Treadmill exercise may improve the learning and memory ability after MCAO rats,its mechanism might be that treadmill exercise upregulate BDNF expression,overactive HPA axis antagonism and decrease Glu neurotoxicity within striatum,inhibit neuronal necrosis and apoptosis and promote the repair of damage neurons.

treadmill exercise;MCAO model rats;learning and memory;Cort;amino acid;BDNF

2015-09-16

中北大學科學基金(2015—2016)。

唐偉(1980-)，男，山東萊州市人，碩士，講師，研究方向為運動人體科學。

1.中北大學體育學院，山西 太原 030051；2.山西大學體育學院，山西 太原 030006

1.School of Sport and Physical Education,North University of China,Taiyuan 030051,China;2.School of Physical Education,Shanxi University,Taiyuan 030006,China.

G 804.2

1009-783X(2016)06-0572-05

A