應用cDNA-SRAP標記比較蘋果梨與延光梨果皮性狀的表達差異

崔百會，金炳奎，楊 洋，曹后男，宗成文

(延邊大學農學院，吉林 延吉 133002)

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應用cDNA-SRAP標記比較蘋果梨與延光梨果皮性狀的表達差異

崔百會，金炳奎，楊 洋，曹后男，宗成文*

(延邊大學農學院，吉林 延吉 133002)

以蘋果梨和延光梨果皮為試材，對盛花后7 周的蘋果梨和延光梨果皮cDNA進行SRAP-PCR檢測，找出2個梨品種(系)在轉錄水平的差異，共擴增出444條可被應用的條帶。2個品種間的相似性極高，僅檢測到2個差異片段，多態性為0.45%。其中，ME7-EM5引物組合擴增出的差異條帶是因為核苷酸序列包含內含子序列，為模板中存在的少量DNA擴增；ME4-EM3引物組合擴增出的差異條帶經回收測序，于Blast上比對得知其為植物凝集素基因，經半定量RT-PCR驗證多態性消失，判斷差異條帶可能是由于蘋果梨與延光梨引物結合位點存在差異而致。

蘋果梨；延光梨；芽變；cDNA-SRAP

蘋果梨引自朝鮮，為經過繁殖和栽培發展起來的一個品種[1]，是我國東北地區最受歡迎的水果之一[2]。延光梨[3]是蘋果梨的一種果皮褐色型的芽變。果實的外形和色澤均是影響其商品價值的重要指標，也是果樹育種中很重要的部分。關于果實色澤方面的研究已有諸多報道[4]。長期以來，由于雄性不育等原因，蘋果梨雜交育種比較困難。相對于雜交育種，果樹芽變選種周期短、育種進程快，是果樹創新育種的重要途徑[5]。現今，已有許多果樹的芽變經選種成為優良的栽培品種，如柑橘[6]、桃[7]、甜橙[8]、蘋果[9]、櫻桃[10]等。

芽變的發生使得突變體與原品種之間形成差異，導致植株表型的改變。大多數木本果樹童期較長，重要性狀的芽變對于果樹變異性狀發生機制的研究非常重要。分子標記技術是研究植物突變機理的有效方法[11-12]，克服了AFLP[13]技術復雜，RAPD[14]重復性差，成本昂貴的缺點，SRAP標記技術[15]以其操作簡單、重復性高、可靠性好、成本低等一系列優點得到廣泛應用。本研究應用cDNA-SRAP標記技術探索蘋果梨芽變機制，探索蘋果梨與延光梨在分子水平的差異。為蘋果梨褐色芽變機理提供理論依據，為蘋果梨的創新育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所需蘋果梨和延光梨的果實均采自延邊大學蘋果梨實驗基地，差異表達分析選取盛花后7周的果皮為材料，此時期為延光梨果皮褐變的關鍵時期[3]。

1.2 試劑及引物

rTaq酶(5 U/μL)等生化試劑均購自寶生物(大連)有限公司；引物由南京基天生物技術有限公司合成，序列信息如表1所示。

表1 SRAP引物序列信息

Table 1 Total sequences of SRAP primers

1.3 RNA的提取與cDNA-SRAP擴增

以蘋果梨與延光梨不同發育時期的果皮為材料，經改良的CTAB法[16]提取2個樣品的總RNA，以Oligo(dT)18為反轉錄引物，利用Reverse Transcriptase M-MLV反轉錄酶，合成cDNA第1鏈。對盛花后7周的蘋果梨與延光梨果皮cDNA 的Actin基因進行擴增比較，調節模板 cDNA 的體積，使Actin基因的表達量相同，保證蘋果梨與延光梨的初始模板用量一致。應用表1中14個上游引物與11個下游引物兩兩組合得到的154對引物組合對2者進行SRAP-PCR擴增，其反應條件為：95 ℃ 5 min預變性；94 ℃ 45 s ,50 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s ，30個循環;72 ℃延伸5 min。

1.4 差異片段的克隆與測序

PCR擴增后用1%的瓊脂糖凝膠檢測并找出差異條帶。按Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0說明書方法，進行目的片段的回收；將回收的片段與pMD18-T 載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，藍白斑和菌液PCR篩選帶有目的片段的克隆，送Invitrogen(上海)公司測序。根據測序序列設計引物，引物序列如下：

護士應營造一個溫馨、舒適的病房環境，避免接種兒童對陌生環境的緊張和恐懼感；同時注意保持接種室的干凈、清潔，定期消毒，避免發生交叉感染；接種室內的溫度、濕度、光線等都應控制良好，避免過冷或過熱，導致兒童不舒適；在接種室墻壁上張貼一些卡通漫畫，播放一些動畫片等，有利于提高親切感和兒童預防接種的依從性[3] 。

應用上述引物對盛花期后的7個不同時期對蘋果梨與延光梨進行RT-PCR擴增。

2 結果與分析

2.1 蘋果梨與延光梨總RNA提取

蘋果梨與延光梨果皮的總RNA電泳檢測如圖1所示，所提取的RNA無其它雜質殘留，質量可用于后續試驗。

圖1 蘋果梨(P1,P2)與延光梨(Y1,Y2)總RNA

2.2 蘋果梨與延光梨果皮cDNA-SRAP擴增分析

對盛花后7周的蘋果梨與延光梨的果皮進行cDNA-SRAP的擴增，結果如圖2所示。

圖2 蘋果梨與延光梨cDNA-SRAP擴增

Fig.2 cDNA-SRAP amplification of Pingguoli and Yanguangli

M：Marker；a-b：MEa-EMb，為1對引物組合。每對引物組合對應的2條泳道左側為蘋果梨，右側為延光梨。

續圖2 蘋果梨與延光梨cDNA-SRAP擴增

Continue to fig.2 cDNA-SRAP amplification of Pingguoli and Yanguangli

應用154對引物對蘋果梨和延光梨進行擴增，其中，有3對引物組合(ME6-EM2、ME6-EM11、ME9-EM11)沒有擴增出條帶，剩余的151對引物均擴增出條帶。統計各組引物擴增所產生的帶數，除2對引物組合(ME4-EM3、ME7-EM5)擴增出差異條帶，其余149對引物組合均擴增出相同的條帶。每對引物組合擴增出的條帶數為2～6條，2個樣本均擴增出443條條帶，品種間的差異條帶為2條，多態性為0.45%。

經測序分析，ME7-EM5擴增出差異條帶是因為1條核苷酸序列包含內含子序列，為模板中存在的少量DNA擴增；對ME4-EM3擴增出的差異片段進行序列分析及多序列比對，并做進一步分析。

2.3 差異片段的序列分析

將ME4-EM3擴增出的差異條帶進行測序后，根據測序序列設計引物，對盛花期后的7個不同時期對蘋果梨與延光梨進行RT-PCR擴增。經Blast[17]比對并通過CluctalX 1.83軟件進行多序列比對，應用Gene Doc軟件輸出比對結果。

ME4-EM3擴增出的差異基因長936 bp，編碼311個氨基酸(圖3)。

圖3 差異基因序列及所編碼的氨基酸序列

多序列比對結果如圖4所示，此基因的氨基酸序列與梅花(Prunusmume，XP_008226191)、蘋果(Malusdomestica，XP_008383184)、大豆(Glycinemax，XP_006597996)、綠豆(Vignaradiatavar.radiata，XP_014492351)的凝集素基因同源性分別為74%、69%、40%和39%。據此基本可以判定此基因片段可能為植物凝集素基因，梁峰等[18]人研究表明，此基因與植物防御系統有很大的相關性。

圖4 蘋果梨植物凝集素基因其他植物的氨基酸序列對比

根據測序得到的數據設計引物并對蘋果梨和延光梨各個時期果皮進行PCR擴增，在蘋果梨與延光梨果皮中均可擴增出條帶(圖5)，其原因可能是用ME4-EM3這對引物組合進行PCR擴增時，引物結合位點突變而產生多態性，根據測序結果重新設計引物時，由于位點發生變化而導致多態性消失。

1.盛花后2周；2.盛花后4周；3.盛花后6周；4. 盛花后8周；5.盛花后10周；6.盛花后12周；7.采收前1周

3 討論與結論

王月志等[19]對梨已育成的芽變品種(品系)進行整理分析得出，果實皮色芽變由木栓等合成途徑中的基因變異引起；曾繼吾等[20]對“春甜橘”及其突變體的果皮差異分析推測，可能是由參與類黃酮生物合成過程的基因的差異表達導致的二者表型差異；張俊苗等[21]對紅富士蘋果芽變的一些生物學性狀進行分析,得出其芽變是在果品、果型等綜合性方面均優良的變異材料。

本試驗擬探索蘋果梨褐色芽變品種——延光梨的變異機理及其果皮褐色性狀的形成機制。利用cDNA-SRAP標記技術篩選出2個品種間存在的差異基因片段，測序分析后得知其為植物凝集素基因[22]。根據測序結果重新設計引物利用半定量RT-PCR檢測后多態性消失，判定延光梨與蘋果梨的引物結合位點可能不同，從而擴增出差異片段。而二者間不同的引物結合位點是否是導致果皮結構甚至功能間差異的根本原因，需進一步深入研究。

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Analysis of gene expression difference of peel characters between Pingguoli and Yanguangli by cDNA-SRAP markerss

CUI Baihui, JIN Bingkui, YANG Yang, CAO Hounan，ZONG Chengwen*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

Make the peel of Pingguoli and Yanguangli at 7 weeks after full bloom as materials, the difference between the two pear cultivar’s (lines) was determined by using cDNA-SRAP technology at the level of transcription. As the result, 444 bands were amplified from cDNAs of the peels of Pingguoli and Yanguangli with only 2 different bands. The two cultivars were highly related with low polymorphism of 0.45%. The 2 polymorphic bands were amplified with primer combinations of ME7-EM5 and ME4-EM3. The polymorphic bands amplified with ME7-EM5 primer combination resulted from the introns involved, whereas the polymorphic band amplified with ME4-EM3 primer combination was a partial fragment of Lectin gene revealed by blast.

Pingguoli; Yanguangli; bud sport; cDNA-SRAP

2016-04-20 基金資助:國家自然科學基金項目(31460504)；吉林省科技支撐計劃重點項目(20120251)

崔百會(1990—)，女，吉林四平人，在讀碩士，研究方向為果樹生物技術。宗成文為通信作者，

E-mail:zongchengwen@aliyun.com

1004-7999(2016)03-0192-07

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.03.002

S661.2

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