飼料中維生素B2測定的色譜條件優化

邢磊，楊琳芬*，符金華，姜文娟，尹騰桂，金海紅，樊晶

（江西省獸藥飼料監察所，江西南昌330096）

飼料中維生素B2測定的色譜條件優化

邢磊1，楊琳芬1*，符金華2，姜文娟3，尹騰桂4，金海紅5，樊晶6

（江西省獸藥飼料監察所，江西南昌330096）

本實驗建立了高效液相色譜法測定飼料中維生素B2的含量。采用了國標法和優化法兩種方法進行測定。國標法∶按照GB/T14701-2002的方法進行。優化方法∶采用Agilent-1260高效液相色譜儀，ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5-M icrom）色譜柱；流動相A液∶1.1003 g庚烷磺酸鈉和0.0502 g EDTA及25 m L冰乙酸、5 m L三乙胺溶液，用冰乙酸、三乙胺調節pH值至3.4；B液為甲醇；A∶B=85∶15；檢測波長∶265 nm；柱溫∶35℃；流速∶1.0 m L/m in；進樣量∶0.5 μL。結果表明∶國標法的保留時間為70 m in左右，優化法的保留時間為9 m in，且優化法的相關系數、重復性和精密度都滿足要求。可見優化法測定所需時間更短，更具有快速、精確測定等優點。

高效液相色譜法；維生素B2；色譜條件優化

維生素是一類分子量較小的有機化合物，在動物機體內發揮著與三大營養物質完全不同的作用，是動物生長所必需的營養物質，是動物飼料中必需添加的物質，它與動物的生命健康、生長發育及生產都有著密切的聯系。王晴（2000）認為，隨著動物養殖行業的發展，近年來，市場上出現了多種維生素B2的添加劑，因此，建立快速、準確的檢測分析方法是必要的。在本實驗中采用了兩種高效液相色譜條件檢測飼料中維生素B2的含量，根據兩種色譜條件下測定結果的比較找到一種更為快速、準確測定飼料中維生素B2含量的液相色譜條件。

1　材料與方法

1.1試劑核黃素標準品（SIGMA）、冰乙酸、三乙胺（分析純）、無水乙醇（分析純）、甲醇（分析純）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、庚烷磺酸鈉。

1.2儀器本實驗中采用了Agilent-1260高效液相色譜儀（USA Agilent Technologies，包括Agilent Technologies 1260 Infinity紫外檢測器）、TGL—16G離心機（上海安亭科學儀器廠）、電子天平（常州宏衡）、津騰過濾器（津騰T-50）、過濾膜（法利特ф50 mm×0.45 μm）、超聲波清洗器（AS3120）及其他常規實驗儀器。

1.3樣品飼料A（5%青年蛋雞復合預混合飼料）、飼料B（10%后備母豬復合預混合飼料）。

1.4樣品前處理

1.4.1試樣溶液的配制稱取A、B兩組復合預混合飼料（每組兩個飼料樣品為平行樣）1～3 g。將其分別加入四個100 mL的棕色容量瓶中，加入維生素B2提取液至約容量瓶2/3體積處，將容量瓶置于80～100℃水浴鍋中煮沸30 min，待其自然冷卻后加入14 mL的甲醇，最后用維生素B2提取液定容至刻度，混勻后，用0.45 μm濾膜過濾后待上機測定。

1.4.2樣品上機前處理將工作液（見下面標準工作液的配制）和兩組四個試樣液分別裝入離心管中，12000 r/min離心12 min，然后裝入到進樣瓶中待上機檢測。

1.5試劑配制

1.5.1流動相的配制A液:25 mL冰乙酸（CH3COOH）+5 mL三乙胺[（C2H5）3N]+0.0502 g乙二胺四乙酸二鈉（EDTA:C10H16N2O8）+1.1000 g庚烷磺酸鈉（C7H15NaO3S），最后用超純水定容至1000 mL（用三乙胺和冰乙酸調節pH值至3.4）；B液:甲醇。

1.5.2提取液的配制50 mg EDTA+25 mL冰乙酸+5 mL三乙胺用去離子水,，定容至1000 mL。

1.5.3標準工作液的配制稱取0.0095 g維生素B2標準品置于100 mL的容量瓶中，加入1 mL冰乙酸在沸水浴（80～100℃）中煮沸30 min，待其自然冷卻到室溫后用去離子水定容至刻度配制成標準儲備液。取2.5 mL維生素B2標準儲備液于50 mL的棕色容量瓶中，用一定比例的流動相A液和B液定容至刻度后置于冰箱中待用。

2　試驗方法

2.1國標法測定的色譜條件GB/T14701-2002標注的色譜柱:NoVa-pakC18（3.9 mm×150 mm，4-Microm）。

實驗用色譜柱:ZORBAX SB-C18（4.6 mm× 150 mm，5-Microm）。流動相:A液與B液按照86∶14的配比混合。流速:0.8 mL/min。進樣量:10 μL。柱溫:25～28℃。檢測波長:267 nm。

2.2優化法測定的色譜條件色譜柱:ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5-Microm）。流動相:A液與B液按照85∶15的配比混合。流速:1 mL/min。進樣量:5 μL。柱溫:35℃。檢測波長:265 nm。

3　結果

3.1標準品測定結果

3.1.1國標法測定結果按照國標法的色譜條件測定維生素B2標準品溶液，同一濃度的標準溶液檢測2次。在用國標法測定的過程中，因色譜柱的型號非國標的要求，國標GB/T 14701-2002上預計的保留時間為10 min，但在實際的實驗過程中的出峰時間都約為70 min，出色譜峰需要的時間過長。其測定結果為保留時間:73 min；出峰時間: 69.715 min。色譜峰圖如圖1所示。

圖1維生素B2標準品國標法測定色譜圖

3.1.2優化法測定結果按照上述優化法的色譜條件測定維生素B2標準品溶液，同一濃度的標準溶液檢測2次。其結果為保留時間:9.3 min；出峰時間:8.562 min；色譜峰圖如圖2所示。

圖2維生素B2標準品優化法測定色譜圖

3.2標準曲線與線性范圍選取適當的移液管精密吸取配制好的標準儲備液（100 μg/mL），用優化法的流動相稀釋成濃度為1、5、12.5、25、50 μg/mL的系列標準工作液。在上述優化法的色譜條件下檢測，每個濃度檢測2次，進樣的順序為低濃度到高濃度。將兩次測得的色譜峰峰面積求平均值，將平均峰值與對應工作液的濃度作圖得到標準曲線，求其回歸方程及相關系數。

回歸方程為Y=25.123X+8.5728，相關系數R=0.999，表明在該方法下維生素B2在0～50 μg/mL濃度范圍線性關系良好。

3.3樣品測定結果將A、B兩組飼料共四個試樣溶液按照上述優化法的液相色譜條件進行測定，每個樣品檢測2次。根據測定得出的色譜峰圖及具體信息可知所有的樣品溶液都在8.5 min右檢測出目標峰，并且所得到的色譜峰峰形較好。查標準曲線，計算得出了樣品中維生素B2的含量，根據測定結果的數值計算其相對偏差，結果見表1。

表1試樣含量測定結果

從上述結果可發現A組飼料所測得的相對偏差為±2.03%，B組飼料所測得的相對偏差為± 0.93%，在實驗中所測得的兩組飼料樣品中維生素B2的含量都在10×103～1.00×103mg/kg，其相對偏差滿足≤±10.0%，證明該優化法的重復性良好。

3.4精密度分別取飼料A和飼料B兩組飼料的兩個樣品中任意一種飼料配制成樣品溶液，按照上述優化法的條件在高效液相色譜儀中進行平行測定6次，得其峰譜圖。測定含量及相對標準偏差值（RSD）見表2。

表2精密度測定結果

精密度試驗在A、B兩組樣品溶液中所得的RSD分別為:1.02%，1.83%。都小于2%，在標準范圍內，這說明該試驗中的色譜儀精密度良好。

4　分析與討論

4.1樣品前處理飼料樣品的前處理程度可在很大的程度上影響樣品的測定結果。郭亞冬等（2004）認為維生素B2的水溶性較差，在水中的溶解度較小，因此在前處理過程中應適當加入少量酸、堿或在水浴上加熱使其完全溶解。維生素B2對光輻射敏感特別是紫外線，對其進行光照及紫外線照射時易發生不可逆的分解反應，因此在實驗操作過程中盡量使用棕色容量瓶，并將配制好的維生素B2標準液、工作液放置在避光的環境中。

4.2色譜條件

4.2.1波長的選擇采用高效液相色譜法檢測，不同的試樣出現特征性的色譜峰所需要的檢測波長是不同的。梁琳等（2016）將煙酰胺、維生素B6、維生素B1和維生素B2的標準溶液分別進行掃描200～400 nm的吸收譜線，得出維生素B2的最大吸收波長為268 nm。國標（GB/T14701-2002）中表明采用紫外檢測器測定維生素時，多種維生素聯檢時的波長選擇為280 nm，單一檢測維生素B2時的波長選擇為267 nm。根據國標上的要求，在實際的檢測當中，優化法所選取的測定波長是265 nm，此波長維生素B2有較大吸收。

4.2.2流動相的選擇王琛等（2010）認為流動相的選擇對優化液相色譜的條件有很大的影響，若流動相的pH值改變，維生素B2出峰的位置將會發生明顯的變化，同時也將會影響維生素B2的分離度。根據維生素B2的特性，在稀酸溶液中較穩定，本實驗將流動項的pH調為3.4時維生素B2的分離度較好。

4.2.3甲醇對試驗結果的影響索德成等（2015）研究表明，甲醇含量的變化對測定維生素B2的保留時間有比較明顯的影響，測定維生素B2的保留時間將會隨著流動相中甲醇濃度的降低而延長，而且在得到的色譜峰圖中會出現明顯的拖尾現象，導致峰的基線不平穩，對稱性較差等。本實驗優化法甲醇在流動相中的比例為15%，與國標法相似。

4.3國標法與優化法的比較按照國標測定飼料中維生素B2的結果顯示:A、B兩組飼料中都沒有檢測出維生素B2的色譜峰圖，對于維生素B2的標準品，國標法能檢測出其峰譜圖，且其峰型良好，基線平穩，但所耗用的時間較長。采用優化法檢測維生素B2的實驗中，維生素B2的標準品也能得到較好的色譜峰圖，與國標法所得到的色譜峰圖比較，峰形較差，但是出峰的時間較短，僅需9 min。并且用優化法檢測試樣液中維生素B2的實驗結果表明，A、B兩組飼料中的四個樣品能夠在相應的保留時間內得到很好的色譜峰圖。從實驗所得的整個結果來看，優化法比國標法具有更高的靈敏度，更有利于實際操作。

4.4影響測定結果的其他因素索德成等（2015）認為，復合預混飼料中存在大量的金屬離子，在處理樣品的過程中，加入EDTA可作為金屬離子的掩蔽劑，能夠有效地消除金屬離子對出峰時間、峰的對稱性、基線的平穩度等干擾，從而提高檢測結果的準確性。

5　結論

本實驗采用了兩種不同的色譜條件來檢測飼料中維生素B2的含量，不同的色譜條件下檢測試樣得到的峰不同。就本實驗中的兩種色譜條件來說，國標法的出峰時間為70 min，峰型較好，基線平穩；優化法的出峰時間為9 min，峰型較國標法差，基線不如國標法的平穩，但用優化法檢測時出峰的時間更短，具有更快的檢測速度和更高的靈敏度。這表明在沒有國標法要求的色譜柱的條件下，本實驗中所用優化法可作為快速、可行的測定飼料中維生素B2含量的方法。

[1]王晴.高效液相色譜法測定飼料中維生素B2[J].黑龍江畜牧獸醫，2000，7∶14～15.

[2]郭亞東，馬銀海，李燕華，等.維生素B1、B2含量測定方法比較[J].食品科學，2004，25（6）∶153～156.

[3]梁琳，王英.HPLC法同時測定維生素預混合飼料中5種B族維生素[J].中國飼料，2016，1∶21～23.

[4]王琛，陳彬彬，鄒梅娟，等.HPLC法同時測定多維元素膠囊中煙酰胺，維生素B6，維生素B1和維生素B2的含量[J].海峽藥學，2010，22（3）∶52～55.

[5]索德成，趙小陽，李蘭.高效液相色譜法同時測定預混合飼料中維生素C、維生素B2及其磷酸鹽[J].中國飼料，2015，2∶34～37.■

DOI∶10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20162010

In this experiment，the content of vitamin B2in feed was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.Two methods of national standard method and optimization method were adopted.The national standard method:according to GB/T 14701-2002.Optimization method:using high performance liquid chromatograph Agilent-1260，ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5-Microm）chromatographic column；mobile phase for A liquid:1000 mL contained 1.1003 g heptane sulfonic acid sodium，0.0502 g EDTA and 25 mL ice acetic acid，5 mL triethylamine solution，with ice acetic acid and triethylamine to adjust pH value of 3.4；B liquid methanol；A∶B（85∶15）；detection wavelength of 265 nm；column temperature 35℃；the flow rate and sample volume:1.0 mL/min，0.5 μL.Results showed that the retention time of national standard method for 70 minutes，optimization method of retention time was about 9 minutes，and the correlation coefficient，repeatability and precision of optimization method meet the requirements.The results indicated that the required time of optimization was shorter，more had the advantages of fast and accurate determination.

high performance liquid chromatography；Vitamin B2；chromatographic condition optimization

S816.17

A

1004-3314（2016）20-0038-03